Защитные эффекты углеродных точек, полученных из карбонизата коры головного мозга Phellodendri Chinensis, против острой почечной недостаточности, вызванной ядом Deinagkistrodon acutus

Введение

Deinagkistrodon acutus (D. acutus) , принадлежащий к семейству Viperidae, считается одной из самых опасных наземных змей в Китае [1]. Отравление от Д. acutus ассоциируется с рядом симптомов, таких как кровотечение, тромбоцитопения и возможное прямое повреждение почек [2, 3]. Острое повреждение почек (ОПП) является наиболее серьезным системным эффектом и частым осложнением отравления D. acutus что напрямую ведет к стойкой дисфункции почек и высокой заболеваемости [4, 5]. Текущее местное лечение включает использование в качестве противоядия гипериммунного противоядия лошадиного происхождения. Однако его эффективность ограничена в нейтрализации местного повреждения тканей, особенно при возникновении ОПП, и имеет несколько неудовлетворительных эффектов, таких как анафилактические и пирогенные реакции [6]. Кроме того, относительно высокая стоимость и низкая стабильность противоядия также способствуют неудовлетворительному лечению людей, укушенных D. acutus , особенно в дикой природе или в сельской местности [7,8,9]. Следовательно, существует острая потребность в эффективных, безопасных и доступных дополнительных лекарствах для лечения D. acutus вызванный ядом ОПП.

Углеродные точки (CD), новый класс углеродных наноматериалов размером <10 нм, были случайно обнаружены путем разделения и очистки однослойных углеродных нанотрубок в 2004 году [10] и вызвали большой интерес в последнее десятилетие из-за их замечательных свойств. новые свойства, такие как заметная биосовместимость, низкая токсичность, высокая растворимость в воде и обилие сырья [11,12,13]. Появление компакт-дисков способствовало исследованиям по разработке различных «умных» наносистем, в основном для биоимиджинга [14], биомедицины [15], доставки лекарств [16] и фотокатализа [17].

Следует отметить, что разработка компакт-дисков с присущим им потенциалом биологической активности обеспечивает множество стратегий для открытия нового поколения лекарств для эффективного контроля или лечения некоторых заболеваний из-за замечательных вышеупомянутых преимуществ. Сообщалось о нескольких видах биологической активности, таких как антибактериальная для лечения бактериального кератита [18], гемостатическая [19], пероксидазоподобная [20], противораковая, противовирусная и противовоспалительная [21]. Эти эффекты привлекли внимание ученых к изучению дополнительных фармацевтических и биомедицинских применений компакт-дисков. В частности, смягчающая активность CD, полученных из Schizonepetae Spica Carbonisata [22] на D. acutus Кровоизлияние, вызванное ядом, открыло новый взгляд на исследование положительного воздействия CD на AKI, вызванное D. acutus укус змеи, который до сих пор оставался менее изученным.

Phellodendri Chinensis Cortex (PCC) Carbonisata (PCCC) -CD синтезируются путем прямого пиролиза PCC (тип традиционной китайской медицины, который используется более 1000 лет) с использованием одностадийной обработки пиролизом. PCCC-CD представляют собой гипотоксические CD в диаметре от 1,2 до 4,8 нм. Сообщалось, что PCCC-CD обладают замечательными гемостатическими эффектами, что не только расширило биомедицинское применение CD, но также стало пионером в выяснении основы гемостатического материала PCCC [23]. Следует отметить, что PCCC, традиционная китайская медицина, получаемая с помощью обработки древесным углем, впервые была упомянута в Священных рецептах тайпин для универсальной помощи (978–992 гг., В Китае). Профиль безопасности и удовлетворительная терапевтическая эффективность PCCC, такая как гемостаз и противовоспалительное действие, способствовали его дальнейшему клиническому применению в течение более 1000 лет, что было признано в Фармакопее Китайской Народной Республики (PPRC, 2015). Однако изучение дополнительных биоактивностей, лежащих в основе PCCC-CD, было сложной задачей. В частности, имеется мало информации об ингибировании AKI, вызванном D. acutus отравление.

Кроме того, сообщалось, что отравление змеиным укусом может поставить под угрозу физиологию почек непосредственно из-за нефротоксических компонентов или путем активации или модуляции иммунных и воспалительных медиаторов [24]. Эти эффекты в основном связаны с биомедицинскими параметрами [25] (креатинин сыворотки (SCR), азот мочевины крови (BUN), общий белок в моче (UTP) и концентрация микроальбуминурии (MALB)), воспалительные цитокины (интерлейкин (IL) -1β), противовоспалительный цитокин (IL-10) и хемотаксический белок 1 моноцитов (MCP-1), изменение гистологии почек и количество тромбоцитов (PLT). В настоящем исследовании мы синтезировали PCCC-CD с использованием зеленого метода одностадийного пиролиза и впервые исследовали их защитные эффекты против развития этих аномалий в AKI, вызванных внутрибрюшинной инъекцией мышам с D. acutus яд.

Материалы и методы

Химические вещества

Материал PCC был приобретен у Beijing Qiancao Herbal Pieces Co., Ltd. (Пекин, Китай), а PCCC был приготовлен в нашей лаборатории. Диализные мембраны с молекулярной массой 1000 Да были приобретены у Beijing Ruida Henghui Technology Development Co., Ltd. (Пекин, Китай). Набор для подсчета клеток (CCK) -8 был приобретен у Dojindo Molecular Technologies, Inc. (Кумамото, Япония). Лиофилизированный змеиный яд D. acutus был предоставлен змеиной фермой Ань Рен (округ Юйцзян, Интань, Цзянси, Китай) для экспериментального использования. Другие химические реактивы аналитической чистоты были получены от Sinopharm Chemical Reagents Beijing (Пекин, Китай). Наборы мышиного MCP-1, IL-10 и IL-1β для иммуноферментного анализа (ELISA) были приобретены у Cloud-Clone Crop. (Ухань, Китай). Все эксперименты проводились с использованием деионизированной воды (DW).

Животные

Протоколы содержания животных и исследований были поддержаны и одобрены Институциональным комитетом по этике экспериментов на животных Пекинского университета китайской медицины. Мыши-самцы Kunming (массой 30,0 ± 2,0 г) были приобретены у Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. с сертификатом соответствия лабораторных животных и содержались в клетках при постоянной температуре и влажности при 12-часовом освещении. темный цикл с ad libitum доступ к пище и воде.

Приготовление раствора яда

Лиофилизированный яд растворяли в физиологическом растворе при мягком перемешивании в течение 20 минут (конечная концентрация:5 мг / мл) и хранили при -20 ° C до тех пор, пока это не понадобится.

Подготовка компакт-дисков PCCC

PCCC был приготовлен с использованием метода одностадийного пиролиза с PCC в качестве единственного предшественника в соответствии с предыдущими методами [23]. Вкратце, образцы ПКК помещали в отдельные фарфоровые тигли и нагревали в течение 1 ч при 350 ° C в предварительно нагретой печи. После охлаждения до 30 ° C полученные гомогенные остатки сажи измельчали ​​в мелкий порошок и дважды кипятили в воде при 100 ° C в течение 1 часа за раз. Затем раствор собирали путем предварительной фильтрации суспензии через 0,22 мкм мембрану из ацетата целлюлозы. Неуглеродные примеси удаляли диализом против DW в течение 72 часов (остаточная молекулярная масса:1000 Да). Раствор PCCC-CDs концентрировали и хранили при 4 ° C до использования. Блок-схема на рис. 1 иллюстрирует описанный выше процесс.

Иллюстрация процесса образования углеродных точек (CD) из коры Phellodendri Chinensis Cortex (PCC) при обработке пиролизом

Характеристика компакт-дисков PCCC

Морфологию компакт-дисков изучали с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ТЕМ, JEM-2100 electronic, JEOL, Япония) с энергией электронов 200 кВ. Структурные детали исследовали с помощью ПЭМ высокого разрешения (ПЭМВР) на электронном микроскопе Tecnai G2 20 (FEI, США). Ультрафиолетовый-видимый (УФ-видимый) спектр и свойства флуоресценции регистрировали и измеряли с помощью УФ-видимой (CECIL, Кембридж, Великобритания) и флуоресцентной (F-4500, Токио, Япония) спектроскопии соответственно. Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (FTIR) использовалась для анализа информации о поверхностных функциональных группах в спектральном окне от 400 до 4000 см ^{- 1} .

Анализы цитотоксичности

Гепатоцит L02 человека и линии Т-клеток 293 почки эмбриона человека использовали для оценки потенциальной цитотоксичности PCCC-CD с использованием анализа CCK-8. Клетки L02 культивировали в среде Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), тогда как Т-клетки 293 выращивали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) с высоким содержанием глюкозы, содержащей 10% FBS. Обе клеточные линии инкубировали при 37 ° C в увлажненном 5% CO ₂ . .

L02 и 293 Т-клетки были засеяны с плотностью 2,0 × 10 ⁴ . клеток на лунку в 96-луночных планшетах и ​​культивировали при 37 ° C во влажной атмосфере с 5% CO ₂ на 24 ч. Затем оба типа клеток обрабатывали 100 мкл различных концентраций (5000, 2500, 1250, 625, 156, 78, 39 и 19,5 мкг / мл) растворов PCCC-CD в бессывороточной среде и инкубировали еще 24 часа. час Затем среду, содержащую PCCC-CD, удаляли, и клетки дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS). Цитотоксичность определяли путем считывания с планшета при 450 нм сразу после добавления 10 мкл реагента CCK-8 и инкубации в течение 4 ч при 37 ° C.

Г. acutus ОПП, вызванная ядом, и лечение

Г. acutus Модель индуцированного ядом AKI

Модель мышей AKI была создана путем внутрибрюшинного введения мышам D. acutus Змеиный яд. Мышей случайным образом разделили на следующие пять групп по 36 животных в каждой:контрольная; модель; и группы лечения высокими, средними и низкими дозами PCCC-CD. Модельная группа получила D. acutus яд в дозе 1 мг / кг (0,15 мг / мл, 0,2 мл) массы тела и 0,5 мл физиологического раствора внутрибрюшинно, в то время как группы лечения высокими, средними и низкими дозами PCCC-CD получали эквивалентный объем змеиного яда и PCCC -CD экстракт в дозах 8,0, 4,0 и 2,0 мг / кг соответственно. Мыши, которым внутрибрюшинно вводили только физиологический раствор (NS), служили контролем. Шесть мышей из каждой группы были умерщвлены через 1, 3 и 12 ч после введения NS, D. acutus яд и PCCC-CD по расписанию, описанному выше, в то время как мышей, умерщвленных на 1, 2 и 5 день, непрерывно вводили NS, D. acutus змеиный яд и диски PCCC-CD два раза в день.

Анализ концентраций UTP и MALB

После введения соответствующих обработок животных в контрольной, модельной группах и группах, обработанных PCCC-CDs- (4,0 мг / кг), немедленно помещали в соответствующие метаболические клетки для сбора мочи до окончания периода инкубации (24 ч). Концентрации UTP и MALB анализировали с помощью автоматического биохимического анализатора.

Анализ биомаркеров функции почек

Функцию почек оценивали путем измерения уровней SCR и BUN. Перед умерщвлением мышей образцы крови отбирали из ретроорбитального сплетения, а затем помещали в пластиковые пробирки не менее чем на 4 часа при 4 ° C. Сыворотку получали центрифугированием при 750 × g в течение 15 минут, и уровни BUN и SCR были проанализированы с помощью автоматического биохимического анализатора.

Определение уровней воспалительных цитокинов

Правые почки мышей удаляли, быстро замораживали в сухом льду и хранили при -80 ° C до использования в следующих процедурах. Образцы тканей (100 мг) из разных групп гомогенизировали с PBS на льду, а затем центрифугировали при 750 × g на 15 мин. Супернатанты собирали для определения уровней MCP-1, IL-10 и IL-1β с использованием соответствующих наборов для ELISA в соответствии с инструкциями производителя.

Гистология почки

Образцы ткани левой почки мыши фиксировали в 10% формалине с нейтральным буфером при 4 ° C в течение более 48 часов, обезвоживали, заливали парафином, разрезали на срезы и затем окрашивали гематоксилином и эозином (H&E). Морфологические изменения сравнивали среди контрольной, модельной и получавших PCCC-CD групп.

Тромбоцитопеническая активность

PLT проводился на крови, взятой у мышей из ретроорбитального сплетения и обнаруженной с помощью автоматического гематологического анализатора (XS-800i, Sysmex Corporation Co., Ltd., Кобе, Япония).

Статистический анализ

Статистический анализ проводился с использованием Статистического пакета для социальных наук (SPSS, версия 13.0). Нормально распределенные данные и однородные дисперсии выражаются как среднее ± стандартное отклонение (SD). Для множественных сравнений использовался односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с последующим тестом наименьшего значимого различия (LSD). P <0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

Характеристика компакт-дисков PCCC

ПЭМ использовали для прямого наблюдения за морфологией и распределением по размерам PCCC-CD (рис. 2a, c и d). Полученные компакт-диски были сферическими и однородными по размеру, большинство из которых составляли 2,84 ± 0,89 нм без отчетливых агрегатов. Изображение HRTEM показало полосы кристаллической решетки (0,24 нм) компакт-дисков, которые соответствовали графитному углероду, как показано на рис. 2b.

а и c Изображения углеродных точек Phellodendri Cortex Carbonisatus (PCCC-CD), полученные с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), b ПЭМ-изображение высокого разрешения PCCC-CD, d Распределение размеров компакт-дисков PCCC

Как показано на фиг. 3а, компакт-диски демонстрировали отчетливо синюю флуоресценцию с максимумом пика при 445 нм после возбуждения 370 нм. Соответственно, оптическая информация на PCCC-CD, отображаемая в УФ-видимом спектре, показала сильный пик поглощения при 265 нм, соответствующий π-π * переходу конъюгированных органических молекул на поверхности CD (рис. 3b).

Оптические свойства углеродных точек Phellodendri Cortex Carbonisatus (PCCC-CD). а Спектры флуоресценции, b ультрафиолетовые и видимые спектры (UV-Vis) и c Инфракрасный спектр с преобразованием Фурье (FTIR)

Кроме того, функциональные группы составленных компакт-дисков были идентифицированы подробно на основе FTIR-спектра, как показано на фиг. 3c. Пик на 3433 см ^{- 1} был отнесен к полосам поглощения валентных колебаний O – H и N – H, а валентные колебания C – H возникли при 2923 см ^{- 1} и 2853 см ^{- 1} . Кроме того, пик поглощения при 1624 см ^{- 1} указывает на присутствие C =O. Связи C – O – C наблюдались при 1109 см ^{- 1} . , а пик на 1400 см ^{- 1} был приписан растяжению C – N. Эти результаты согласуются с результатами предыдущих отчетов.

Цитотоксичность in vitro

Для оценки цитотоксичности Т-клетки L02 и 293 подвергались воздействию различных концентраций PCCC-CD в течение 24 часов, а жизнеспособность исследовалась с использованием анализа CCK-8. Как показано на фиг. 4a, жизнеспособность клеток L02, обработанных PCCC-CD, была> 85% по сравнению с таковой контрольных клеток, даже при такой высокой концентрации, как 5 мг / мл. Точно так же PCCC-CD не влияли на рост Т-клеток 293 при концентрациях примерно до 2500 мкг / мл (фиг. 4b). Эти результаты показали, что PCCC-CD обладают низкой цитотоксичностью.

Жизнеспособность клеток с помощью анализа CCK-8 ( a ) Ячеек L02 и ( b ) 293 Т-клеток, инкубированных с PCCC-CD в течение 4 ч

Влияние PCCC-CD на концентрацию UTP и MALB

По сравнению с уровнем UTP в контрольной группе (0,98 ± 0,38 мг / л) уровни UTP значительно увеличились в D. acutus обработанный ядом (3,08 ± 0,92 мг / л, P <0,01) и PCCC-CD (2,36 ± 0,83 мг / л, P <0,05) группы (рис. 5а). Кроме того, уровень UTP снизился после лечения PCCC-CD по сравнению с уровнями после введения яда ( P <0,05). Кроме того, уровень MALB, очевидно, увеличился через 24 часа после внутрибрюшинного введения D. acutus яд (17,78 ± 5,96 мг / л, P <0,01) по сравнению с контрольной группой (2,02 ± 0,91 мг / л). Напротив, мыши, получавшие PCCC-CD, показали тенденцию к снижению уровня MALB (14,25 ± 4,16 мг / л, рис. 5b).

Влияние углеродных точек Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata (PCCC-CD) на общий белок (UTP) и микроальбуминурию (MALB) в моче. а UTP и b МАЛЬБ. Мышей лечили физиологическим раствором (NS), D.acutus яд (Dav, 1 мг / кг) и PCCC-CD (4 мг / кг) + Dav (1 мг / кг). Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение для шести животных в каждой группе. * p < 0,05 и ** p < 0,01 по сравнению с контрольной группой, получавшей NS. ^# p < 0,05 по сравнению с группой Dav

PCCC-CD облегчили дисфункцию почек в D. acutus Мыши с AKI, индуцированные ядом

Функцию почек оценивали путем измерения уровней BUN и SCR, которые показаны на фиг. 6 и 7. Мыши, получавшие D. acutus яд имел значительно более высокие уровни АМК (12,07 ± 1,00 ммоль / л [1 день], P <0,01; 11,43 ± 1,37 ммоль / л [2 дня], P <0,01; 14,83 ± 2,53 ммоль / л [5 дней], P <0,01) и SCR (12,83 ± 1,43 мкмоль / л [1 день], P <0,01; 13,48 ± 2,26 мкмоль / л [2 дня]; P <0,01. 13,80 ± 1,90 мкмоль / л [5 дней], P <0,01), чем у мышей, получавших NS (АМК:8,95 ± 1,04 [1 день], 9,53 ± 1,40 [2 дня] и 9,07 ± 1,57 [5 дней] ммоль / л; SCR:9,40 ± 0,89 [1 день] , 10,27 ± 2,04 [2 дня] и 9,85 ± 1,99 [5 дней] мкмоль / л) с 1 по 5 день (рис. 6a и 7a). Следует отметить, что по сравнению с модельной группой лечение низкими дозами PCCC-CD значительно ингибировало повышение уровней SCR (9,77 ± 0,79 мкмоль / мл, P <0,01) и АМК (10,50 ± 1,38 ммоль / л, P <0,05), тогда как высокий (9,62 ± 1,87 мкмоль / мл, P <0,01) и средней (10,75 ± 1,48 мкмоль / мл, P <0,05) дозы ингибировали увеличение SCR (фиг. 7b), но не BUN (фиг. 6b), вызванное D. acutus яд на 1-й день. Уровни SCR (рис. 7c) в группах, получавших высокие, средние и низкие дозы PCCC-CD, снизились (10,97 ± 0,88, 10,42 ± 1,75 и 10,68 ± 1,41 мкмоль / мл, соответственно; P <0,05), чем в модельной группе на 2-й день. Кроме того, по сравнению с модельной группой, уровни АМК значительно снизились в группе с высоким (9,57 ± 0,52 ммоль / л, P <0,01) и в малых дозах (10,72 ± 2,04 ммоль / л, P <0,05) группы PCCC-CD, но не группы средней дозы (фиг. 6c) на 2 день. Как показано на фиг. 6d и 7d, ингибирующие эффекты наблюдались на высоких уровнях обоих индексов (12,28 ± 1,65 ммоль / л, P <0,01 (АМК); 11,38 ± 1,80 мкмоль / мл, P <0,05 (SCR) соответственно) и средний (12,40 ± 1,33 ммоль / л, P <0,05 (АМК); 10,83 ± 2,57 мкмоль / мл, P <0,05 (SCR) соответственно) доз PCCC-CD. Кроме того, не наблюдалось значительной разницы между контрольной группой и группами, обработанными PCCC-CD, в SCR.

Влияние Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata - углеродных точек (PCCC-CD) на азот мочевины крови (BUN). а Концентрация АМК изменяется через 1 час, 3 часа, 12 часов, 1 день, 2 дня и 5 дней. Уровни АМК в ( b ) 1 день ( c ) 2 дня ( д ) 5 день. Мышей лечили физиологическим раствором (NS), D.acutus яд (Dav, 1 мг / кг) и высокие (H), средние (M) и низкие (L) дозы PCCC-CD + Dav (1 мг / кг). Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение для шести животных в каждой группе. * p < 0,05 и ** p < 0,01 по сравнению с контрольной группой, получавшей NS. ^# p < 0,05 по сравнению с группой Dav

Влияние углеродных точек Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata (PCCC-CD) на креатинин сыворотки (SCR). а Концентрация SCR изменяется через 1 час, 3 часа, 12 часов, 1 день, 2 дня и 5 дней. Уровни SCR в ( b ) 1 день ( c ) 2 дня ( д ) 5 дней. Мышей лечили физиологическим раствором (NS), D.acutus яд (Dav, 1 мг / кг) и высокие (H), средние (M) и низкие (L) дозы PCCC-CD + Dav (1 мг / кг). Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение для шести животных в каждой группе. * p < 0,05 и ** p < 0,01 по сравнению с контрольной группой, получавшей физиологический раствор (NS). ^# p < 0,05 по сравнению с группой Dav

PCCC-CD ингибируют секрецию цитокинов

Влияние трех концентраций PCCC-CD на продукцию хемоаттрактанта (MCP-1), провоспалительных (IL-1β) и противовоспалительных (IL-10) цитокинов в ответ на инъекции D. acutus яд были исследованы. На фигуре 8 показано, что инъекция яда увеличивала высвобождение IL-1β в мышиной модели (1 час:58,19 ± 5,35 нг / мл, P <0,01; 3 ч:56,57 ± 3,54 нг / мл, P <0,01; 12 ч:49,48 ± 7,74 нг / мл, P <0,05; день 1:41,09 ± 4,82 нг / мл, P <0,05; день 2:47,96 ± 8,33 нг / мл, P <0,05; день 5:45,11 ± 6,95 нг / мл, P <0,05) по сравнению с уровнями у мышей, получавших NS (1 час:35,96 ± 4,72 нг / мл, 3 часа:34,94 ± 2,58 нг / мл, 12 часов:36,42 ± 5,25 нг / мл, день 1:34,47 ± 3,67 нг. / мл, 2-й день:39,84 ± 3,71 нг / мл, 5-й день:36,82 ± 8,27 нг / мл). Как показано на рис. 8b – d, сравнение с D. acutus Группа, индуцированная ядом, показала, что 1-, 3- и 12-часовое воздействие высоких (50,09 ± 7,68 нг / мл, P <0,05 [1 час]; 40,36 ± 8,51 нг / мл, P <0,01 [3 ч]; 39,87 ± 4,64 нг / мл, P <0,05 [12 ч] соответственно) и низко- (46,64 ± 3,83 нг / мл, P <0,01 [1 час]; 37,65 ± 9,61 нг / мл, P <0,01 [3 ч]; 38,75 ± 6,64 нг / мл, P <0,05 [12 ч] соответственно) дозы PCCC-CD значительно снижают уровни IL-1β. Кроме того, средние дозы PCCC-CD значительно снижали уровень IL-1β (41,50 ± 11,08 нг / мл, P <0,01) по сравнению с мышами, получавшими яд, через 3 часа, но не в другие моменты времени.

Влияние углеродных точек Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata (PCCC-CD) на уровень IL-1β в ткани почек. а Уровень IL-1β изменяется через 1 час, 3 часа, 12 часов, 1 день, 2 дня и 5 дней. Уровни IL-1β в ( b ) 1 ч, ( c ) 3 ч, ( д ) 12 ч., ( e ) 1 день, ( f ) 2 дня и ( г ) 5 дней. Мышей лечили физиологическим раствором (NS), D.acutus яд (Dav, 1 мг / кг) и высокие (H), средние (M) и низкие (L) дозы PCCC-CD + Dav (1 мг / кг). Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение для шести животных в каждой группе. * p <0,05 и ** p <0,01 по сравнению с контрольной группой, получавшей физиологический раствор (NS). ^# p < 0,05 по сравнению с группой Dav

Уровни противовоспалительного цитокина IL-10 резко увеличились в D. acutus группа, обработанная ядом в разные моменты времени (23,27 ± 0,72 нг / мл, P <0,01; 22,03 ± 0,96 нг / мл, P <0,05; 21,76 ± 1,99 нг / мл, P <0,05; 26,31 ± 6,55 нг / мл, P <0,01; 3 часа, 12 часов, день 1 и день 2 соответственно) по сравнению с группой, получавшей NS (рис. 9). В отличие от этого, лечение высокими и средними дозами PCCC-CD (17,17 ± 4,04 и 17,25 ± 5,64 нг / мл, соответственно, оба P <0,05) подавляли индуцированную ядом секрецию IL-10 через 3 часа, в то время как низкие дозы PCCC-CD подавляли уровни через 3 часа, 12 часов и день 1 (17,17 ± 5,24, 17,83 ± 4,11 и 18,31 ± 2,14 нг / мл, соответственно, все P <0,05). Не наблюдалось значительной разницы между группой, получавшей PCCC-CD, и группой NS.

Влияние углеродных точек Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata (PCCC-CD) на уровень IL-10 в ткани почек. а Уровень IL-10 изменяется через 1 час, 3 часа, 12 часов, 1 день, 2 дня и 5 дней. Уровень ИЛ-10 в ( б ) 1 ч, ( c ) 3 ч, ( д ) 12 ч., ( e ) 1 день, ( f ) 2 дня и ( г ) 5 дней. Мышей лечили физиологическим раствором (NS), D.acutus яд (Dav, 1 мг / кг) и высокие (H), средние (M) и низкие (L) дозы PCCC-CD + Dav (1 мг / кг). Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение для шести животных в каждой группе. * p <0,05 и ** p <0,01 по сравнению с контрольной группой, получавшей физиологический раствор (NS). ^# p < 0,05 по сравнению с группой Dav

Кроме того, на рис. 10 показано, что инъекция D. acutus яд значительно увеличивал высвобождение МСР-1 в модельной группе (1 час:197,45 ± 22,34 нг / мл, P <0,01; 3 ч:182,42 ± 12,94 нг / мл, P <0,01; 12 ч:169,20 ± 26,74 нг / мл, P <0,01; 24 ч:142,81 ± 25,85 нг / мл, P <0,05) по сравнению с контролем, обработанным NS (1 час:115,82 ± 14,80 нг / мл; 3 часа:106,46 ± 13,76 нг / мл; 12 часов:120,35 ± 15,75 нг / мл; и 24 часа:108,81 ± 25,60 нг / мл). мл). Что еще более примечательно, лечение отравленных мышей тремя дозами PCCC-CD ингибировало повышение уровней MCP-1. Среда- (3 ч:136,84 ± 39,94 нг / мл, P <0,01; 12 ч:127,48 ± 13,75 нг / мл, P <0,01) и низко- (1 ч:152,13 ± 18,89 нг / мл, P <0,05; 3 ч:129,54 ± 30,85 нг / мл, P <0,01; 12 ч:118,75 ± 19,96 нг / мл, P <0,01) дозы PCCC-CD ингибировали увеличение уровней MCP-1 через 1, 3 и 12 ч, за исключением средней дозы, через 1 ч (178,20 ± 22,79 нг / мл). Лечение высокими дозами PCCC-CD эффективно снижало уровень MCP-1 только через 3 часа (131,42 ± 24,62 нг / мл, P <0,01).

Effects of Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-carbon dots (PCCC-CDs) on MCP-1 level in the kidney tissue. а MCP-1 level changes in 1 h, 3 h, 12 h, 1 day, 2 days, and 5 days. MCP-1 levels in (b ) 1 h, (c ) 3 h, (d ) 12 h, (e ) 1 day, (f ) 2 days, and (g ) 5 days. Mice were treated with normal saline (NS), D.acutus venom (Dav, 1 mg/kg) and high (H), medium (M), and low (L) doses of PCCC-CDs + Dav (1 mg/kg). Data are represented as mean ± SD of six animals of each group. * p  < 0.05 and ** p < 0.01 compared with control group treated with normal saline (NS). ^# p < 0.05 compared with Dav group

In contrast, IL-1β, IL-10, and MCP-1 levels of the PCCC-CDs-treated groups at certain time points were not significantly different from those of the model group, and showed a decreasing tendency.

Effect of PCCC-CDs on the Inhibition of Thrombocytopenia

PLTs have a specific role in the pathogenesis of AKI; therefore, the PLT count was investigated and the results are shown in Fig. 11 [26]. Compared with the PLT values of the control group (1 h:[1228 ± 51] × 10 ⁹ ; 3 h:[1120 ± 36] × 10 ⁹ ; 12 h:[1245 ± 111] × 10 ⁹ ; day 1:[1177 ± 69] × 10 ⁹ ; day 2:[1195 ± 51] × 10 ⁹ ; and day 5:[1181 ± 46] × 10 ⁹ ), a drastic reduction occurred as early as 1 h after D. acutus venom administration, with a nadir occurring at 3 h. Subsequently, the PLT steadily increased up to day 5 (1 h:[354 ± 70] × 10 ⁹ , P  < 0.01; 3 h:[315 ± 77] × 10 ⁹ , P < 0.01; 12 h:[435 ± 91] × 10 ⁹ , P < 0.01; day 1:[663 ± 226] × 10 ⁹ , P < 0.01; day 2:[941 ± 248] × 10 ⁹ , P < 0.05; day 5:[1083 ± 89] × 10 ⁹ ). Of note, even at this time interval, the PLT values were significantly lower than those of control mice. In addition, administration of PCCC-CDs at a dose of 8 mg/kg markedly inhibited the venom-induced thrombocytopenia induced at 1 h ([435 ± 91] × 10 ⁹ , P < 0.05), 3 h ([599 ± 290] × 10 ⁹ , P < 0.05), 12 h ([929 ± 92] × 10 ⁹ , P < 0.01), day 1 ([1028 ± 248] × 10 ⁹ , P < 0.01), and day 2 ([1183 ± 89] × 10 ⁹ , P <0,01). This inhibitory effect was also observed at a dose of 2 mg/kg PCCC-CDs at 3 h and day 2 and 4 mg/kg PCCC-CDs at day 2, in addition to increased PLT. Although there was no significant difference between the model and medium-dose groups, an increasing tendency was observed at other different time points.

Effects of Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-carbon dots (PCCC-CDs) on platelet (PLT) counts in the blood. а PLT changes in 1 h, 3 h, 12 h, 1 day, 2 days, and 5 days. PLT in (b ) 1 h, (c ) 3 h, (d ) 12 h, (e ) 1 day, (f ) 2 days, and (g ) 5 days. Mice were treated with normal saline (NS), D.acutus venom (Dav, 1 mg/kg) and high (H), medium (M), and low (L) doses of PCCC-CDs + Dav (1 mg/kg). Data are represented as mean ± SD of six animals of each group. * p  < 0.05 and ** p < 0.01 compared with control group treated with normal saline (NS). ^# p < 0.05 compared with Dav group

Histopathological Observations

The renal injury in the venom group was histologically evaluated. As shown in Fig. 12a, in contrast to the NS-treated group, which showed normal glomeruli and tubular cellularity, marked changes were observed in the renal parenchyma of the D. acutus venom-treated group. These changes include marked haemorrhage, renal tubular dilation, and degeneration. Cotreatment with PCCC-CDs prevented D. acutus venom-induced renal damage, and the histopathological examination of the architecture of the renal tissues was almost normal with mild haemostasis, renal tubular dilation, and degeneration.

Effects of Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-carbon dots (PCCC-CDs) on histopathological changes in kidney tissues in D.acutus venom (Dav)-induced AKI mice. After D.acutus venom challenged, kidney tissues from each experimental group were prepared for histological evaluation. Histological changes of kidney obtained from mice of different groups normal saline (NS), D.acutus venom (Dav, 1 mg/kg) and high (H), medium (M), and low (L) doses of PCCC-CDs + Dav (1 mg/kg) in (a ) 1 h, (b ) 3 h, (c ) 12 h, (d ) 1 day, (e ) 2 days, and (f ) 5 days

Discussion

As an emerging nanomaterial, CDs are beginning to occupy an important niche as innovative materials for next-generation nanomedicines. Compared to traditional heavy-metal-based quantum dots, CDs are good candidates for biomedical application because of their unique characteristics that have considerable potential advantages in the development of novel medicines with relatively low toxicity [27, 28].

The derived PCCC-CDs particles were quasi-spherical and well-dispersed in water, with abundant functional groups present on the surface. This observation is consistent with previously reported findings [23]. In addition, the as-prepared CDs showed low toxicity against L02 and 237 T cells, which indicated its suitability for biomedical applications.

The current study is the first, to the best of our knowledge, to demonstrate the remarkable bioactivities of PCCC-CDs on AKI induced by D. acutus snakebite. D. acutus is widely called “five pacer” or “hundred pacer” in Chinese folk medicine on account of the folkloric description that the people or animals bitten by D. acutus could not walk more than 100 steps. More than 90% of the population of D. acutus is found in China, and the frequency of critical conditions and even death related to the bite of this snake is higher than that by many other venomous snakes [29]. AKI is the most serious systemic effect and common complication, which leads to secondary renal ischemia and failure. An enhanced knowledge of relevant information on AKI induced by D. acutus envenomation would contribute to the development of novel therapeutic approaches. However, in contrast to the considerable knowledge available on the nephrotoxicity of snake venom in general [30, 31], information on the AKI induced by D. acutus venom is rare, which led us to investigate this potential medicine that is still in the early stages of development.

In this study, we established an AKI model by intraperitoneally injecting D. acutus venom into mice to assess the complex and multifactorial pathogenesis of venom-induced AKI. Furthermore, the model provided a tool for investigating the protective effects of PCCC-CDs against AKI induced by D. acutus venom.

Current experiments have shown the development of substantial AKI with distinct changes in inflammatory cytokines and serum and urinary biochemical index, as well histopathological evidence of renal injury after intraperitoneal injection of snake venom [31]. These findings indicated the possible factors that may mainly contribute to the venom toxicity are [32] (1) direct venom cytotoxicity against the kidney and (2) renal inflammatory reactions.

Specifically, renal insufficiency was confirmed approximately 24 h post venom injection based on oliguria associated with proteinuria and elevated serum biomarkers (SCR and BUN). We further affirmed the renal involvement in the D. acutus venom-treated group using biochemical analysis, which showed significantly elevated UTP and MALB levels compared with those of the control group. These findings indicated the presence of glomerular malfunction and tubular reabsorption in the venom-treated group [33], which were supported by evidence of histopathological change. In contrast, a significant reduction in the levels of UTP and MALB was observed in the envenomated medium-dose PCCC-CD-treated group. In addition, serum biochemical indicators (SCR and BUN) are other vital parameters used to determine the elevation of renal dysfunction in AKI and they remain clinical indicators in its diagnosis [34]. Injecting snake venom from day 1 to 5 also dramatically increased the levels of SCR and BUN, whereas treatment with PCCC-CDs reversed these effects, resulting in a faster recovery than that of the control group. More importantly, the distinct changes in the kidney tissue, marked haemorrhage, renal tubular dilation, and degeneration further indicated the direct impairment of the kidney by the venom. The attenuating effects of PCCC-CDs on the histopathological changes were demonstrated in this study. These results suggested that PCCC-CDs inhibited the AKI-induced abnormal manifestation of urinary and serum biochemical markers associated with kidney dysfunction as well as renal histological damage. Furthermore, these effects may be attributable to the amelioration of the direct nephrotoxicity of the D. acutus venom by the PCCC-CDs [35]. The protective effects of PCCC-CDs were evidenced by the inhibition of D. acutus venom-induced direct kidney damage.

An intense inflammatory response is a common feature induced by envenomation by venomous animals such as snakes and caterpillars [35,36,37]. The signs of systemic inflammation with mononuclear cell infiltration, neutrophilic leukocytosis, tubular epithelial cell degeneration, and necrosis have also been shown in kidney impairment induced by injecting snake venom. MCP-1 is a small molecule protein that plays a vital role in recruiting and activating leukocytes during inflammatory responses [38]. In addition, mononuclear phagocytes and lymphocytes may contribute to acute renal cell injury by different mechanisms such as the secretion of proinflammatory mediators, which may then induce resident renal cells to express chemokines [39]. The involvement of MCP-1, inflammatory cytokines (IL-1β) and anti-inflammatory cytokine (IL-10) in the inflammatory response in the pathogenesis of AKI in mice injected with D. acutus venom only was demonstrated in the present study. This observation indicated that the underlying mechanism of the D. acutus venom-induced AKI may be associated with the renal inflammatory response. The evidence that exposure to PCCC-CDs significantly reduced levels of IL-1β, IL-10, and MCP-1 suggests that CDs may exhibit renoprotection by inhibiting renal inflammatory reactions.

Furthermore, PLTs play a crucial role in acute haemostatic and inflammatory processes and are associated with diverse inflammatory pathologies [40, 41]. They are highly sensitive and respond quickly to biological changes when an organism is injured or bleeding, as the first cells to arrive at the site of acute injury to interact with endothelial cells and leukocytes [42]. PLTs are involved in the pathogenesis of AKI [43], and are considered a prognostic marker that is significantly associated with a worse outcome of AKI [44]. This study provided evidence that D. acutus venom conspicuously decreased the PLT count, which was consistent with the results of studies reporting that thrombocytopenia can be induced by snake venom [34, 45]. We observed that exposure to PCCC-CDs significantly elevated the PLT counts, which was consistent with the findings of a previous study [23].

The abnormalities of AKI induced by D. acutus venom were, to our knowledge, demonstrated for the first time in the current study and mainly included renal dysfunction associated with proteinuria, oliguria, elevated BUN and SCR levels, pathological kidney damage, inflammatory responses, and thrombocytopenia.

Remarkably, the PCCC-CDs demonstrated protective activity against D. acutus venom-induced AKI by inhibiting the associated impairments, as evidenced in this study for the first time. This study was a preliminary evaluation of the beneficial effects of PCCC-CDs on AKI induced by D. acutus venom, and further investigations of the underlying mechanism would be the focus of future studies.

Conclusion

The impressive protective effects of PCCC-CDs on D. acutus venom-induced AKI have been demonstrated in this study, for the first time, to the best of our knowledge. The AKI-related effects were mainly manifested as renal dysfunction, pathological kidney damage, inflammatory responses, and thrombocytopenia. These results indicated that PCCC-CDs have potential application prospects for use as a complementary medicine for the treatment of abnormalities induced by D. acutus venom-induced AKI. Furthermore, this provides a novel strategy for the study of active ingredients of traditional Chinese medicine formulations, and further broadens the biomedical applications of CDs.

Доступность данных и материалов

All data generated or analysed during this study are included in this published article.

Сокращения

AKI:

Acute kidney injury

BUN:

Blood urea nitrogen

компакт-диски:

Углеродные точки

D. acutus :

Deinagkistrodon acutus

HE:

Haematoxylin and eosin

IL:

Interleukin

MALB:

Microalbuminuria

MCP-1:

Monocyte chemotactic protein 1

PCC:

Phellodendri Chinensis Cortex

PCCC-CDs:

Phellodendri Chinensis Cortex Carbonisata-carbon dots

PLT:

Platelet counts

SCR:

Serum creatinine

UTP:

Urinary total protein