Повышающая регуляция MicroRNA-410 или понижающая регуляция Wnt-11 увеличивает остеобласты и уменьшает остеокласты для облегчения остеонекроза головки бедренной кости

Введение

Остеонекроз головки бедренной кости (ONFH), как одно из наиболее известных заболеваний, поражающих тазобедренные суставы, приводит к сильной боли или инвалидности суставов и в основном встречается у людей среднего возраста [1]. Лечение ОНГБ у взрослых, которым в Китае пользуются 8,12 миллиона пациентов, по-прежнему является проблемой для хирургов [2]. С возникновением ONFH связаны многие факторы риска, такие как гиперлипидемия, аутоиммунные заболевания, нарушения свертывания крови, алкоголизм и гиперкортизонизм [3]. Хирургическое лечение включает базовую декомпрессию с адъювантом или без него, например, аутологичным костным мозгом, в то время как тотальное эндопротезирование тазобедренного сустава (THR) сохраняется для пациентов старческого возраста или прогрессирующего остеонекроза, который не лечится путем удержания суставов [4]. Тем не менее, ONFH имеет неудовлетворительный прогноз у тех пациентов, которым часто требуется THR [5]. Следовательно, существует острая необходимость в поиске точной терапевтической цели для лечения ONFH.

МикроРНК (миРНК) являются основными регуляторами функции клеток и экспрессии генов, которые оказывают огромное влияние на гомеостаз эндотелия и могут быть новым методом лечения [6]. Исследование показало, что miR-410 аномально экспрессируется при некоторых злокачественных опухолях человека и может использоваться в качестве ингибитора опухолей при раке эндометрия, легких, миеломе и раке груди [7,8,9,10]. Другое исследование показало, что существует нейропротекторный эффект miR-410 на модели клеток болезни Паркинсона, индуцированный 6-гидроксидофамином, путем подавления сигнального пути PTEN / AKT / mTOR [11]. Более того, было обнаружено, что miR-410 модулирует злокачественное биологическое поведение детей с острым лимфобластным лейкозом посредством нацеливания на сигнальные пути FKBP5 и AKT [12]. В статье также продемонстрирован ингибирующий эффект miR-410, направленный на ангиотензин II типа 1 при раке поджелудочной железы [13]. Белок Wnt - это разновидность богатых цистеином секретируемых липогликопротеинов, которые оказывают огромное влияние на развитие и болезнь [14]. Wnt-11 принадлежит к сигнальному пути Wnt и является положительным регулятором, который играет ключевую роль в канцерогенезе [15]. В одном исследовании сообщается о клинической значимости экспрессии антигена плоскоклеточной карциномы и Wnt11 при карциноме шейки матки [16]. Более того, было показано, что синергические сигналы TGF-β1 и Wnt11 управляют экспрессией sm-α-актина в гладких мышцах посредством передачи сигналов Rho kinase-actin-MRTF-A [17]. Основываясь на приведенной выше литературе, целью настоящего исследования было изучить роль miR-410, регулирующего Wnt-11, на предотвращение ONFH, и выдвинута гипотеза, что miR-410, нацеленная на Wnt-11, может модулировать остеогенные и остеокластические процессы. механизм предотвращения ONFH.

Материалы и методы

Этика

Исследование было проведено с одобрения Институционального наблюдательного совета Пекинской больницы Шиджитан, Столичного медицинского университета, и следовало принципам Хельсинкской декларации. Участники предоставили письменное информированное согласие на участие в этом исследовании. Все эксперименты на животных соответствовали Руководству по уходу и использованию лабораторных животных Национального института здоровья. Протокол был разрешен Комитетом по этике экспериментов на животных Пекинской больницы Шиджитан, Столичного медицинского университета.

Темы исследования

Всего было отобрано 30 пациентов, которые проходят лечение в ортопедическом отделении Пекинской больницы Шиджитан Столичного медицинского университета с января 2017 года по сентябрь 2018 года. Среди этих пациентов 15 пациентов с ONFH лечились с помощью операции THR, средний возраст пациентов составлял 50,6 ± 4,3 года, а масса тела составляла 57,0 ± 5,6 кг с 7 мужчинами и 8 женщинами (группа ONFH). Еще 15 пациентов с переломом шейки бедра были пролечены с помощью операции THR, средний возраст составил 59,6 ± 3,3 года, а масса тела - 50,0 ± 5,6 кг, у 9 мужчин и 6 женщин (контрольная группа). Не было заметной разницы по полу, возрасту и весу между двумя группами ( P > 0,05), что было сопоставимо. Ткани в области субхондрального некроза были взяты путем долбления по продольной линии головки бедренной кости и хранили при -80 ° C. Каждая группа была исследована на предмет патологии и молекулярной биологии соответственно.

Окрашивание гематоксилином-эозином (HE)

Образцы закрепляли 4% параформальдегидом и декальцинировали 10% этилендиаминтетрауксусной кислотой, а раствор для декальцинации заменяли один раз в неделю. Наблюдали за цветом образца кости и измеряли степень декальцификации. После полной декальцификации образец заливали парафином и нарезали ломтиками толщиной 4 мкм. Запеченные секции были погружены в ксилол I и ксилол II по очереди на 10 минут, а депарафинированные секции были погружены в абсолютный спирт I, абсолютный спирт II, 95% спирт, 80% спирт и 70% спирт на 2 минуты соответственно. Затем срезы окрашивали гематоксилином в течение 3 мин и дифференцировали 1% раствором соляной кислоты в течение 2 мин. Затем срезы замачивали в 50%, 70% и 80% спирте по очереди 2 мин и погружали в эозин на 5 с. Затем срезы погружали в 95% спирт, абсолютный спирт I и абсолютный спирт II на 3 мин, а затем по очереди погружали в ксилол I и ксилол II на 5 мин. Наконец, срезы были запечатаны нейтральной камедью и исследованы под микроскопом.

Окрашивание щелочной фосфатазой (ЩФ)

Из каждого образца отбирали по одной секции и запекали при 60 ° C в течение 60 мин. Парафиновые срезы депарафинизировали ксилолом I и ксилолом II в течение 15 минут соответственно и погружали в абсолютный спирт I, абсолютный спирт II, 95% этанол, 90% этанол, 80% этанол и 75% этанол на 5 минут по очереди. и промывали трижды дистиллированной водой по 2 мин. На срезы капали немного жидкости-субстрата, приготовленной в наборе для окрашивания ALP (NanJing JianCheng Bioengineering Institute, Нанкин, Китай), чтобы субстратная жидкость полностью покрывала образец, затем вылупляли при 37 ° C, избегая света в течение 15 мин. Избыточный раствор красителя отбрасывали, на срезы немедленно добавляли хромогенный агент A в течение 5 минут и промывали трехдистиллированной водой в течение 30 секунд. Затем срезы окрашивали хромогенным агентом В в течение 30 с и контрастировали с реагентом в течение 30 с. Фотография была получена под 200-кратным оптическим микроскопом, а количество остеобластов было подсчитано с помощью системы анализа изображений для микроскопа (Image-Proplus 6.0).

Окрашивание устойчивой к тартрату кислой фосфатазой (TRAP)

Для каждого образца отбирали по одной секции и обжаривали при 60 ° C в течение 60 мин. Парафиновые срезы депарафинизировали ксилолом I и ксилолом II в течение 15 минут и погружали в абсолютный спирт I, абсолютный спирт II, 95% этанол, 90% этанол, 80% этанол и 75% этанол на 5 минут по очереди. Срезы фиксировали приготовленным фиксирующим раствором на 30 с. Срезы вставляли в стойку для окрашивания и помещали в темную коробку, содержащую свежеприготовленный окрашивающий раствор TRAP (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США), окрашивающий раствор должен быть полностью покрыт срезами, а затем срезы были заштрихованы. Водяная баня 37 ° C на 1 час. Затем срезы контрастировали гематоксилином в течение 2 мин и сушили. Поскольку окрашивание TRAP со временем будет ослабевать, срезы можно будет непосредственно исследовать под микроскопом без запечатывания. Изображение было получено под 200-кратным оптическим микроскопом, а количество остеокластов было подсчитано с помощью системы анализа изображений для микроскопа (Image-Proplus 6.0).

Иммуногистохимическое окрашивание

После декальцинации срезы заливали парафином и нарезали ломтиками толщиной 4 мкм. Срезы депарафинизировали обычным ксилолом, обезвоживали градиентным спиртом, заштриховывали 3% H ₂ О ₂ (Sigma-Aldrich Chemical Company, Сент-Луис, Миссури, США) при 7 ° C в течение 30 минут, а затем кипятили с 0,01 М лимоннокислым буфером при 95 ° C в течение 20 минут. Срезы блокировали нормальной рабочей жидкостью овечьей сыворотки в течение 10 мин, смешивали с первичным антителом Wnt-11 (1:100, Invitrogen, Карлсбад, Калифорния, США) при 4 ° C в течение ночи, вторичное антитело (готовое к использованию вторичное антитело. набор (PV-6000), ZSGB-Bio, Пекин, Китай) на 20 мин и рабочую жидкость овальбумина, меченного пероксидазой хрена (SA / HRP, Beijing ComWin Biotech Co. Ltd, Пекин, Китай) на 2 мин. Срезы проявляли диаминобензидином (DAB) (Sigma-Aldrich Chemical Company, Сент-Луис, Миссури, США), контрастировали гематоксилином (Shanghai Bogoo Biological Technology Co., Ltd., Шанхай, Китай), а затем запечатывали. Солевой раствор с фосфатным буфером (PBS) заменил первичное антитело в качестве отрицательного контроля (NC). Под световым микроскопом положительные клетки были локализованы с коричневыми реагентами в цитоплазме, сильная положительная экспрессия была темно-коричневато-желтой, слабая положительная экспрессия была светло-коричневато-желтой, а отрицательная экспрессия не имела окраски. Окрашивание клеток наблюдали под световым микроскопом, для каждого среза наблюдали пять полей высокой мощности (400 ×) и подсчитывали 100 клеток в каждом поле. Среднее значение было результатом наблюдения каждого раздела. В соответствии с долей и распределением положительных клеток, было определено следующее:отрицательное (-), одноклеточное окрашивание, положительные клетки менее 5%; слабоположительное (+), рассеянное или мелкоклеточное окрашивание, количество положительных клеток 5–24%; положительное (++), чешуйчатое или кластерное окрашивание клеток, количество положительных клеток 25–50%; и сильно положительное (+++), диффузное окрашивание клеток, количество положительных клеток составляло более 50%. Результаты иммуногистохимии были оценены двойным слепым методом двумя людьми независимо друг от друга.

Количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (RT-qPCR)

Суммарную РНК выделяли из образцов тканей с помощью набора для экстракции Trizol (Invitrogen, Carlsbad, California, USA). Определяли концентрацию и чистоту РНК. Праймеры были разработаны и составлены Takara Bio Inc. (Оцу, Сига, Япония) (дополнительный файл 1:таблица S1). Затем РНК подвергали обратной транскрипции в кДНК с использованием набора PrimeScript RT (Takara Biotechnology Ltd., Далянь, Китай). Реакционный раствор использовали для количественной ПЦР флуоресценции в соответствии с инструкциями SYBR® Premix Ex Taq ^TM II комплект (Takara Biotechnology Ltd., Далянь, Китай). Количественная флуоресцентная ПЦР была реализована в системе ABI PRISM® 7300 (Applied Biosystems, Массачусетс, США). U6 был контролем загрузки miR-410, а глицеральдегидфосфатдегидрогеназа (GAPDH) была внутренними параметрами Wnt-11, ALP, костного гамма-карбоксиглутаматного белка (BGLAP), Collα1, тартрат-устойчивой кислой фосфатазы 5 (ACP5), катепсина. K (CTSK), матриксная металлопептидаза (MMP) 9, Bcl-2 и Bax. Относительные уровни транскрипции генов-мишеней рассчитывали по 2 ^{- △△ Ct} метод [18].

Вестерн-блоттинг

Общий белок извлекали из тканей головки бедренной кости. Концентрация белка в каждом образце была измерена, и загрузка образца была скорректирована деионизированной водой, чтобы гарантировать постоянный размер. Были приготовлены разделительный гель додецилсульфата натрия и спейсерный гель (10%). После купания со льдом и центрифугирования образец разделяли электрофорезом с тем же количеством микродозатора, а затем белок с геля переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Нитроцеллюлозную мембрану герметизировали 5% сухим обезжиренным молоком при 4 ° C в течение ночи и смешивали с первичным антителом Wnt-11 (1:150, Santa Cruz Biotechnology, Санта-Крус, Калифорния, США), ALP (1:100, Sigma, St Луис, Миссури, США), BGLAP, Collα1 и MMP9 (1:1000), ACP5 (1:100), CTSK (1:500, Abcam, Кембридж, Массачусетс, США) и Bcl-2 и Bax (1:500, Proteintech, Чикаго, США) и вылупились в течение ночи. И в образец добавляли вторичное антитело IgG (1:1000, Wuhan Boster Biological Technology Co., Ltd., Хубэй, Китай), меченное HRP, и инкубировали в течение 1 часа. Мембрану погружали в реакционный раствор с усиленной хемилюминесценцией (Pierce, Rockford, IL, USA) на 1 мин. После удаления жидкости образец был покрыт пленкой для консервирования пищевых продуктов. После проявки и фиксации результат наблюдался. GAPDH был внутренним параметром, и изображение отпечатка белка было проанализировано с помощью программного обеспечения ImageJ2x.

Создание моделей ONFH для крыс

Отбирали девяносто крыс-самцов Sprague-Dawley (SD) (Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd., Шанхай, Китай) массой от 300 г до 350 г. Температура окружающей среды составляла 18–25 ° C, а влажность 45–70%. Крыс содержали в отдельных клетках, избегая шума. После 1 недели адаптивного кормления были проведены дополнительные эксперименты.

Модель создана травматическим ОНФХ. Методы моделирования:крысам SD анестезировали брюшную полость с последующей эпиляцией и препарированием кожи. Кожу крысы разрезали, ткани отделяли и после обнажения головки бедренной кости отрезали круглую связку. У крыс соскабливали надкостницу шейки бедренной кости и нарушали кровоснабжение головки бедренной кости. Суставная капсула, мышцы и кожа были послойно зашиты и снова стерилизованы.

Группировка животных

Семьдесят успешно смоделированных крыс SD были разделены на семь групп по 10 крыс в каждой:группа ONFH; группа агомир-NC (0,5 мл агониста miR-410 NC (200 нМ, Guangzhou RiboBio Co., Ltd., Гуандун, Китай) вводили вокруг тазобедренного сустава через 1 неделю после успешного установления ONFH), группа агомир-miR-410 (0,5 мл агониста miR-410 (200 нМ, Guangzhou RiboBio Co., Ltd., Гуандун, Китай) вводили вокруг тазобедренного сустава через 1 неделю после успешного установления ONFH), группа siRNA-NC (NC 0,4 мл подавленного Wnt -11 вектор (содержащий 1 × 10 ⁹ бляшкообразующий элемент (PFU) (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Шанхай, Китай) инъецировали вокруг тазобедренного сустава через 1 неделю после успешного установления ONFH), группу Wnt-11-миРНК (0,4 мл заглушенного вектора Wnt-11 (содержащего 1 × 10 ⁹ PFU) (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Шанхай, Китай) вводили вокруг тазобедренного сустава через 1 неделю после успешного установления ONFH), группа агомир-miR-410 + сверхэкспрессируемая (OE) -NC (0,5 мл агониста miR-410 и NC 0,4 мл активированного вектора Wnt-11 (содержащего 1 × 10 ⁹ PFU) (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Шанхай, Китай) вводили вокруг тазобедренного сустава через 1 неделю после успешного установления ONFH), а группа агомир-miR-410 + OE-Wnt-11 (0,5 мл агониста miR-410 и 0,4 мл активированного вектора Wnt-11 (содержащего 1 × 10 ⁹ PFU) (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Шанхай, Китай) вводили в области тазобедренного сустава через 1 неделю после успешного установления ONFH). Между тем нормальная группа (в брюшную полость вводили только физиологический раствор, 10 крыс) была выбрана в качестве контроля. После 4 недель ONFH были выполнены микро-КТ, остеонометрический анализ, рентгенологическое наблюдение, денситометрия костей и определение уровня кальция и фосфора в сыворотке крови.

Микро-КТ-тест и остеонометрический анализ

Головку правой бедренной кости крыс помещали на аппарат микро-КТ (General Electric (GE) Company, Массачусетс, США), и также сканировали случайно оборудованный стандартный фантом. Параметры сканирования следующие:разрешение 27 мкм × 27 мкм × 27 мкм, ток сканирования 450 мА, напряжение сканирования 80 кВ, время одиночного сканирования 88 мин. Детально наблюдали микроструктуру головки бедренной кости крысы. После калибровки в соответствии со спецификацией, из разных групп крыс для реконструкции случайным образом были выбраны три представляющих интерес кубовидных области (ROI) (0,5 × 0,5 × 0,5 см ³ ). Обработка изображений проводилась с помощью программного обеспечения GE Microview, а ROI была реконструирована и проанализирована с помощью метрологии кости. Были выбраны параметры минеральной плотности костной ткани (BMD) и объемной доли кости (BV / TV).

Наблюдение за рентгеновскими лучами, определение МПК и определение уровня кальция и фосфора в сыворотке

Через четыре недели после операции крысам в каждой группе вводили через брюшную полость 10% хлоралгидрат. После анестезии крыс помещали в положение лежа на спине, фиксировали конечности и затем исследовали с помощью рентгеновской фотографии. Отмечено изменение формы и плотности головки бедренной кости. Плотность костей позвоночника левой бедренной кости, головки бедренной кости и позвоночника проверяли с помощью двухэнергетического рентгеновского прибора для измерения плотности кости. Через 4 недели после операции крысы в ​​каждой группе голодали в течение 12 ч перед сбором крови. Образцы крови (5 мл) собирали утром через сердце и помещали в вакуумно-чистую пробирку для коагуляции. Сыворотку отделяли центрифугированием при 3000 об / мин в течение 15 мин. Уровни кальция и фосфора в сыворотке измерялись автоматическим биохимическим анализатором.

Наблюдение под электронным микроскопом

Массу костной ткани крысы закрепляли 3,5% глутаровым альдегидом, декальцинировали 5% раствором соляной кислоты и 1% осмиевой кислоты, затем дегидратировали градиентным ацетоном, дважды окрашивали ацетатом урана и лимонной кислотой и, наконец, заливали Epon-61. После того, как полутонкий срез был подготовлен, ультратонкий срез исследовали с помощью просвечивающего электронного микроскопа.

Анализ TdT-опосредованного мечения dUTP-биотина по нику (TUNEL)

Залитые парафином срезы предварительно обрабатывали обычными методами депарафинизации и обезвоживания. Срезы заштриховали пепсином (0,25 ~ 0,5% раствор соляной кислоты) в течение 25 минут, затем закапали 50 мкл реакционного смешанного раствора TUNEL и вылупили во влажном боксе на 60 минут, затем закапали 50 мкл агента-пероксидазы и заштриховали в мокрый бокс на 30 мин. Срезы проявляли с помощью реагента DAB, независимо от того, были ли срезы окрашенными и наблюдались ли они под микроскопом. В срезы добавляли воду для остановки развития и окрашивали гематоксилином в течение 2 мин. Затем срезы погружали в 95% этанол I – II, абсолютный этанол I – II на 3–5 мин, ксилол I – II на 3–5 мин и герметизировали нейтральной смолой. Результаты были проанализированы под световым микроскопом.

Иммуноферментный анализ (ELISA)

После анестезии крыс брали кровь из бедренной артерии и образцы сыворотки собирали центрифугированием после 1-часового отдыха. На основании спецификации набора для ELISA (Shanghai Enhancement-Link Biotechnology Co., Ltd., Шанхай, Китай) были добавлены семь стандартных лунок с различными стандартами концентрации (100 мкл) по очереди, пустые лунки были добавлены с 100 мкл стандартный раствор для разведения, а в остальные лунки добавляли 100 мкл образца для тестирования. Планшет с ферментом покрывали пленкой и помещали на 1 ч, а затем жидкость сливали. Раствор (100 мкл) добавляли во все лунки, и планшет с ферментами закрывали пленкой на 1 час. После отмывки во все лунки добавляли 100 мкл раствора В и планшет с ферментами покрывали пленкой на 30 мин. Затем добавляли раствор тетраметилбензидинового субстрата (90 мкл), планшет с ферментами покрывали пленкой на 10–20 мин и во все лунки добавляли 50 мкл раствора для терминации. Значение оптической плотности (OD) каждой лунки измеряли с помощью устройства для считывания микропланшетов и подсчитывали фактическую концентрацию образца.

Анализ двойного люциферазного репортерного гена

Сайты связывания и целевые отношения 3'-нетранслируемой области (UTR) miR-410 и Wnt-11 были спрогнозированы с использованием программного обеспечения для биоинформатики http://www.targetscan.org. Последовательность промоторной области 3'UTR Wnt-11, содержащая сайт связывания miR-410, была составлена ​​и вставлена ​​в pMIR-REPORT ^TM Люциферазная векторная плазмида (Ambion, Company, Остин, Техас, США) для создания плазмиды Wnt-11 3'UTR дикого типа (Wnt-11-WT). А мутантная плазмида 3'UTR Wnt-11 (Wnt-11-MUT) была сконструирована на основе плазмиды и сайта связывания мутации. Следуйте инструкциям приобретенного набора для экстракции плазмид (Promega, Мэдисон, Висконсин, США), и логарифмические клетки высевают в 96-луночные планшеты. Когда слияние клеток составило около 70%, для трансфекции был принят Lipofectamine 2000. Wnt-11-WT и Wnt-11-MUT смешивали с имитаторами NC и miR-410 (Shanghai GenePharma Co. Ltd., Шанхай, Китай), соответственно, а затем котрансфицировали на 293 Т-клетки. Клетки собирали и лизировали через 48 часов после трансфекции, а активность люциферазы тестировали с помощью набора для определения люциферазы (BioVision, Сан-Франциско, Калифорния, США) и люминометра Glomax 20/20 (Promega, Мэдисон, Висконсин, США).

Статистический анализ

Все данные обрабатывались с помощью программы SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, США). Данные измерений были представлены как среднее ± стандартное отклонение. Односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) был проведен для сравнений нескольких групп, и t тест для сравнения двух групп и наименьшее значимое различие Фишера t тест (LSD-t) был использован после дисперсионного анализа. P значение <0,05 свидетельствует о статистически значимой разнице.

Результаты

Патологические изменения в тканях ONFH клинических образцов

Окрашивание HE было принято для наблюдения за патологическими изменениями головки бедренной кости в группе с переломом шейки бедра (контрольная группа) и группе ONFH; результаты показали, что в контрольной группе трабекулярная плотность кости была хорошо распределена, а структура была целостной. В то время как в группе ONFH в костном мозжечке было много пустых костных лакун, количество костных клеток уменьшилось, а костные трабекулы постоянно менялись. Кроме того, вокруг костного мозжечка было много других гиперплазий тканей (рис. 1а).

Патологические изменения тканей ONFH клинических образцов. а Результаты окрашивания HE в каждой группе (200 ×). б Результаты окрашивания TRAP и подсчет TRAP-положительных клеток в каждой группе (200 ×). c Результаты окрашивания ALP и количество положительных по ALP клеток в каждой группе (400 ×). * P <0,05 по сравнению с контрольной группой

Окрашивание TRAP показало, что TRAP в основном обнаруживается в остеокластах и ​​часто используется для идентификации зрелых остеокластов у амаранта. По сравнению с контрольной группой количество TRAP-положительных остеокластов в группе ONFH увеличивалось, морфология остеокластов была разнообразной, а клетки были большими с многоядерным внешним видом. В костном мозжечке, прилегающем к остеокластам, наблюдались очевидные костные дефекты, которые демонстрировали резорбцию кости (рис. 1b).

Результат окрашивания ALP показал, что ALP является ферментом-маркером для дифференцировки и созревания остеобластов, который участвует в регуляции кальцификации созревания костного матрикса. Следовательно, экспрессия ALP обычно использовалась для идентификации остеобластов. Коричневые или кофейные частицы можно было увидеть в цитоплазме зрелых остеобластов. По сравнению с контрольной группой количество ALP-положительных остеобластов уменьшилось в группе ONFH (рис. 1c).

MiR-410, ALP, BGLAP и Collα1 деградированы, а Wnt-11, ACP5, CTSK и MMP9 улучшены в тканях ONFH клинических образцов

Вестерн-блоттинг и RT-qPCR продемонстрировали, что экспрессия miR-410 в группе ONFH снизилась по сравнению с таковой в контрольной группе, тогда как экспрессия Wnt-11 повысилась; снижена экспрессия связанных с остеобластами факторов ALP, BGLAP и Collα1; и повышалась экспрессия связанных с остеокластами факторов ACP5, CTSK и MMP9 (все P <0,05) (рис. 2а – в).

MiR-410, ALP, BGLAP и Collα1 снизились, а Wnt-11, ACP5, CTSK и MMP9 увеличились в тканях ONFH клинических образцов. а Обнаружение miR-410, Wnt-11 и генов, связанных с остеобластами и остеокластами, методом RT-qPCR. б Wnt-11 и белки, связанные с остеобластами и остеокластами, обнаруживаются с помощью вестерн-блоттинга. c Белковые полосы Wnt-11 и белков, связанных с остеобластами и остеокластами. г Экспрессия Wnt11 (400 ×) и сравнение уровня положительности белка Wnt11, обнаруженного иммуногистохимическим окрашиванием. * P <0,05 по сравнению с контрольной группой

Экспрессию Wnt-11 тестировали с помощью иммуногистохимии, и результаты показали, что белок Wnt-11 в основном экспрессировался в цитоплазме, а положительная экспрессия была в основном коричневато-желтой или коричневой. В отличие от контрольной группы, положительный уровень экспрессии белка Wnt-11 в группе ONFH был повышен ( P <0,05) (рис. 2г).

Повышенная регуляция miR-410 и пониженная регуляция Wnt-11 повышают BMD и BV / TV у крыс

Микро-КТ показала, что в нормальной группе головка бедренной кости была круглой, толщина шейки была однородной, а структура костных трабекул была непрерывной и равномерно распределенной. Головка бедренной кости крыс в группе ONFH, группе агомир-NC, группе siRNA-NC и группе агомир-miR-410 + OE-Wnt-11 постепенно разрушалась, постепенно появлялась зона резорбции кости, шейка бедер истончалась. , костные трабекулы были сломаны, а целостность нарушена. В группе агомир-miR-410, группе Wnt-11-миРНК и группе агомир-miR-410 + OE-NC внешний вид крыс оставался неизменным, коллапса не происходило, не появлялись очевидные зоны резорбции кости, костные трабекулы были устроены нормально, и конструкция была завершена (рис. 3а).

Высокоэкспрессированный miR-410 и плохо выраженный Wnt-11 увеличивают BMD и BV / TV у крыс. а Результаты микро-КТ крыс в каждой группе. б Результаты анализа МПК. c Результаты анализа BV / TV. * P <0,05 по сравнению с нормальной группой. ⁺ P <0,05 по сравнению с группой агомир-NC. ^# P <0,05 по сравнению с группой siRNA-NC. ^& P <0,05 по сравнению с группой агомир-miR-410 + OE-NC

Результаты метрологии костей показали, что, в отличие от нормальной группы, BMD и BV / TV в группе ONFH были снижены (оба P <0,05). По отношению к группе агомир-NC и группе миРНК-NC, BMD и BV / TV повышены в группе агомир-miR-410 и группе Wnt-11-миРНК (все P <0,05). По сравнению с группой агомир-miR-410 + OE-NC, BMD и BV / TV в группе агомир-miR-410 + OE-Wnt-11 были снижены (обе P <0,05) (рис. 3б, в).

Избыточная экспрессия miR-410 и плохая экспрессия Wnt-11 Повышают уровни BMD диафиза бедренной кости, головки бедренной кости и позвоночника, а также повышают уровень кальция в сыворотке и уровень фосфора в крысах

Рентген показал, что внешний вид головки бедренной кости в нормальной группе был круглым, плотность головки бедренной кости была однородной, а структура была целостной. В группе ONFH, группе агомир-NC, группе siRNA-NC и группе агомир-miR-410 + OE-Wnt11 внешний вид головки бедренной кости крыс стал более тонким и появилась зона резорбции кости. Внешний вид был ровным, а толщина головки бедренной кости у крыс была полной в группе агомир-miR-410, группе Wnt11-siRNA и группе агомир-miR-410 + группе OE-NC (рис. 4a). P>

Повышенная регуляция miR-410 и пониженная регуляция Wnt-11 увеличивают уровень минеральной плотности костной ткани диафиза бедренной кости, головки бедренной кости и позвоночного столба, а также повышают уровни кальция и фосфора в сыворотке крови крыс. а Результаты рентгенологического наблюдения животных. б Сравнение минеральной плотности костной ткани диафиза бедренной кости, головки бедренной кости и позвоночника в каждой группе. c Comparison of the serum calcium and phosphorus levels in each group. * P <0.05 vs. the normal group. ⁺ P <0.05 vs. the agomir-NC group. ^# P <0.05 vs. the siRNA-NC group. ^& P <0.05 vs. the agomir-miR-410 + OE-NC group

BMD and serum calcium and phosphorus level determination reported that compared to the normal group, the BMD of the femoral shaft, femoral head, and spine, as well as the serum calcium and phosphorus levels, fell in the ONFH group (all P <0,05). In contrast with the agomir-NC group and siRNA-NC group, the BMD of the femoral shaft, femoral head, and spine, as well as serum calcium and phosphorus levels, ascended in the agomir-miR-410 group and Wnt-11-siRNA group (all P <0,05). In relation to the agomir-miR-410 + OE-NC group, the BMD of the femoral shaft, femoral head, and spine, as well as the serum calcium and phosphorus levels in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group, was abated (all P <0.05) (Fig. 4b, c).

Silencing Wnt-11 and Upregulating miR-410 Alleviate the Pathological Changes of Rat Tissues and Restrain Apoptosis of Osteocytes

The results of HE staining showed that the bone trabeculae were neat and clear and arranged regularly and tightly. Bone cells filled the bone lacunae, and the calcified zone was well connected to the subcartilage bone trabeculae in the normal group. In the ONFH group, agomir-NC group, siRNA-NC group, and agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group, the bone trabecula was sparse; thinned, and even broken; the structure was disordered; and some fragments appeared. Some osteocytes in the bone lacuna were necrotic and a large number of bone lacuna was in emptiness that no bone cells filled in, and obvious proliferation of granulation tissue was observed in the necrosis bone trabecular space, which was wrapped around the necrotic bone trabeculae. In the agomir-miR-410 group, the Wnt-11-siRNA group, and the agomir-miR-410 + OE-NC group, the appearance of the rats remained intact, no obvious bone resorption area appeared and the bone trabeculae were arranged normally and the structure was complete (Fig. 5a).

Poor expression of Wnt-11 and overexpression of miR-410 alleviate pathological changes of rats tissues and restrain apoptosis of osteocytes. а Morphological observation of the femoral head of rats in each group (200 ×). б Ultrastructural observation of bone cells in rats of each group (8000 ×). c The results of TUNEL staining (200 ×). г Detection of apoptosis rate by TUNEL assay. е Detection of the Bax and Bcl-2 mRNA expression by RT-qPCR. е , г Detection of the Bax and Bcl-2 protein expression by western blot analysis. * P <0.05 vs. the normal group. ⁺ P <0.05 vs. the agomir-NC group. ^# P <0.05 vs. the siRNA-NC group. ^& P <0.05 vs. the agomir-miR-410 + OE-NC group

Electron microscopic observation observed that the shape of the bone cells in the normal group was consistent with the lacunae, and there was a small gap between the cell and the lacunae wall. The organelles were abundant, the cells in the lacunae were normal, the nucleus was egg-shaped, the nuclear membrane was intact, the chromatin did not agglutinate, and the cytoplasmic pseudo-foot stretched to the peripheral bone small tube and was connected with the adjacent bone cells. Osteoblasts were located on the surface of the bone trabecula, the sample was long, and there were many organelles. In the ONFH group, agomir-NC group, siRNA-NC group, and agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group, a large number of lipid deposits were found in the cytoplasm of osteoblasts, the gap between capsule and lacunae well was further widened, edema bright bands appeared between the nuclear membrane and cytoplasm, nuclear margination showed with compression, nuclear membrane was intact, mitochondria in cytoplasm was swollen, and the endoplasmic reticulum and Gore apparatus disappeared. In the agomir-miR-410 group, Wnt-11-siRNA group, and agomir-miR-410 + OE-NC group, the morphology of rat osteoblasts was normal, chromatin aggregation was found in the nucleus of a small number of cells, no obvious lipid droplets were found in the cytoplasm, and the nuclear membrane was intact (Fig. 5b).

The results of TUNEL staining demonstrated that compared to the normal group, the apoptosis rate of osteocytes in the ONFH group was raised (P <0,05). In contrast with the agomir-NC group and the siRNA-NC group, the apoptosis rate of osteocytes abated in the agomir-miR-410 group and the Wnt-11-siRNA group (both P <0,05). In relation to the agomir-miR-410 + OE-NC group, the apoptosis rate of osteocytes enhanced in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group (P <0.05) (Fig. 5c, d).

Western blot analysis and RT-qPCR reported that the Bcl-2 expression reduced and Bax expression raised in the ONFH group compared to the normal group (both P <0,05). By comparison with the agomir-NC group and the siRNA-NC group, Bcl-2 expression ascended and Bax expression descended in the agomir-miR-410 group and the Wnt-11-siRNA group (all P <0,05). In contrast with the agomir-miR-410 + OE-NC group, the Bcl-2 expression declined and Bax expression appended in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group (both P <0.05) (Fig. 5e–g).

Overexpression of miR-410 and Low Expression of Wnt-11 Increase the Number of Osteoblasts and Decrease the Number of Osteoclasts

TRAP staining revealed that in the normal group, the morphology of osteoclasts with positive TRAP staining was different, most of them were shuttle or fusiform, few large osteoclasts were polygons, and most of them were distributed around the bone cerebellum. In the ONFH group, agomir-NC group, siRNA-NC group, and agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group, TRAP-positive cells were ascended, the morphology of cells was diverse in large polygons and polykaryotes, bone resorption was found in the bone trabeculae adjacent to osteoclasts, and typical resorption lacunae were formed. In the agomir-miR-410 group, Wnt-11-siRNA group, and agomir-miR-410 + OE-NC group, the number of cells positive for TRAP staining was reduced, the cells were in a long strip shape and the morphology was more regular, the polygonous polynuclear osteoclasts were rare, and the bone structure of adjacent bone trabeculae was relatively complete (Fig. 6a).

Overexpression of miR-410 and low expression of Wnt-11 increase the number of osteoblasts and decrease the number of osteoclasts. а Results of TRAP staining in osteoclasts of rats (200 ×). б Count of positive cells in TRAP staining. c Results of ALP staining in osteoblasts of rats in each group (200 ×). г Count of positive cells determined by ALP staining. * P <0.05 vs. the normal group. ⁺ P <0.05 vs. the agomir-NC group. ^# P <0.05 vs. the siRNA-NC group. ^& P <0.05 vs. the agomir-miR-410 + OE-NC group

ALP staining presented that in the normal group, in osteoblasts, which were positive for ALP staining, the morphology was small and round. The cells were distributed in aggregation, most of which were located in the bone trabecular space of bone marrow cavity and on the surface of some bone trabeculae. In the ONFH group, agomir-NC group, siRNA-NC group, and agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group, the number of osteoblasts positive for ALP staining was dispersedly distributed in the trabecular space of the bone marrow cavity. In the agomir-miR-410 group, Wnt-11-siRNA group, and agomir-miR-410 + OE-NC group, the number of osteoblast-positive cells enhanced, and they were distributed in the trabecular space of the bone marrow cavity and the surface of the part of the bone trabecular (Fig. 6c).

By comparison with the normal group, the number of osteoblasts per unit area was suppressed and the number of osteoclasts was heightened in the ONFH group (both P <0,05). In relation to the agomir-NC group and the siRNA-NC group, the number of osteoblasts per unit area was heightened and the number of osteoclasts was declined in the agomir-miR-410 group and Wnt-11-siRNA group (all P <0,05). In contrast to the agomir-miR-410 + OE-NC group, the number of osteoblasts per unit area was declined and the number of osteoclasts was raised in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group (both P <0.05) (Fig. 6b, d).

Highly Expressed miR-410 and Lowly Expressed Wnt-11 Elevate the Expression of Osteocalcin (OCN), ALP, BGLAP, and Collα1, as well as Abate C- and N-terminal Telopeptides of Type I collagen (NTX-1, CTX-1), ACP5, CTSK, and MMP9 expression in ONFH Rats

The results of ELISA revealed that in relation to the normal group, the level of osteogenic function index ALP and OCN degraded while the levels of osteoclast function index NTX-1 and CTX-1 heightened in the ONFH group (all P <0,05). In contrast with the agomir-NC group and the siRNA-NC group, ALP and OCN ascended and NTX-1 and CTX-1 descended in the agomir-miR-410 group and the Wnt-11-siRNA group (all P <0,05). By comparison with the agomir-miR-410 + OE-NC group, ALP and OCN dropped and NTX-1 and CTX-1 appended in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group (all P <0.05) (Fig. 7a).

Highly expressed miR-410 and lowly expressed Wnt-11 elevate the expression of OCN, ALP, BGLAP, and Collα1 as well as abate NTX-1, CTX-1, ACP5, CTSK, and MMP9 expression in ONFH rats. а Detection of osteogenesis and osteoclast function indices in the serum of rats in each group by ELISA. б Detection of osteoblast- and osteoclast-related genes by RT-qPCR. c , d Detection of osteoblast- and osteoclast-related genes protein expression by western blot analysis. * P <0.05 vs. the normal group. ⁺ P <0.05 vs. the agomir-NC group. ^# P <0.05 vs. the siRNA-NC group. ^& P <0.05 vs. the agomir-miR-410 + OE-NC group

The results of western blot analysis and RT-qPCR revealed that in relation to the normal group, the expression of osteoblast-related factors ALP, BGLAP, and Collα1 degraded, and osteoclast-related factors ACP5, CTSK, and MMP9 expression ascended (all P <0,05). In contrast with the agomir-NC group and the siRNA-NC group, the expression of ALP, BGLAP, and Collα1 elevated, and ACP5, CTSK, and MMP9 expression abated in the agomir-miR-410 group and the Wnt-11-siRNA group (all P <0,05). By comparison with the agomir-miR-410 + OE-NC group, the expression of ALP, BGLAP, and Collα1 depressed, and ACP5, CTSK, and MMP9 expression heightened in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group (all P <0.05) (Fig. 7b–d).

Elevated Wnt-11 and Decreased miR-410 are Found in ONFH Tissues of Rats as well as Wnt-11 is the Target Gene of miR-410

The targeting relationship between miR-410 and Wnt-11 gene was analyzed by an online analysis software. It was displayed that a specific binding region existed between Wnt-11 gene sequence and miR-410 sequence, implying that Wnt-11 was the target gene of miR-410 (Fig. 8a). Luciferase activity assay was utilized to verify this relationship (Fig. 8b). The results presented that compared to the NC group, the luciferase activity depressed in the miR-410 mimics group (P <0.05), but there was no significant difference in the luciferase activity of MUT 3′UTR (P> 0.05), indicating that miR-410 could specifically bind to Wnt-11.

Increased Wnt-11 and decreased miR-410 are found in ONFH tissues as well as Wnt-11 is the target gene of miR-410. а Prediction of binding sites of miR-410 on Wnt-11 3′UTR. б Luciferase activity detection for verifying the relationship between miR-410 and Wnt-11. c Detection of miR-410 and Wnt-11 expression by RT-qPCR. г , e Wnt-11 protein expression determined by western blot analysis. е Expression of Wnt-11 in femoral head of rats in each group detected by immunohistochemistry (200 ×). г Comparison of the positive rate of Wnt-11 protein expression in each group. * P <0.05 vs. the normal group. ⁺ P <0.05 vs. the agomir-NC group. ^# P <0.05 vs. the siRNA-NC group. ^& P <0.05 vs. the agomir-miR-410 + OE-NC group

The results of western blot analysis and RT-qPCR revealed that in relation to the normal group, miR-410 expression declined and Wnt-11 expression raised in the ONFH group (both P <0,05). By comparison with the agomir-NC group, miR-410 raised and Wnt-11 reduced in the agomir-miR-410 group (both P <0,05). In contrast with the siRNA-NC group, Wnt-11 declined in the Wnt-11-siRNA group (P <0,05). Wnt-11 enhanced in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group relative to that in the agomir-miR-410 + OE-NC group (P <0.05) (Fig. 8c–e).

>Wnt-11 expression was verified by immunohistochemistry. Wnt-11 protein was mainly expressed in the cytoplasm, and the positive expression was mainly brownish yellow or brown. Compared to the normal group, the positive rate of Wnt-11 protein expression in the ONFH group was raised (P <0,05). By comparison with the agomir-NC group and the siRNA-NC group, the positive rate of the Wnt-11 protein expression descended in the agomir-miR-410 group and Wnt-11-siRNA group (both P <0,05). In relation to the agomir-miR-410 + OE-NC group, the positive rate of Wnt-11 protein expression enhanced in the agomir-miR-410 + OE-Wnt-11 group (P <0.05) (Fig. 8f, g).

Discussion

ONFH, a kind of bone destruction disease, is caused by blood supply failure and coagulation and fibrinolysis system disorder and finally causes the femoral head to collapse [19]. A previous study has discussed miRNA expression in bone marrow mesenchymal stem cells induced by hormone in mice with ONFH [20]. Also, a recent study has provided a proof that the expression profile of miRNA of bone marrow-derived mesenchymal stem cells in osteogenesis related to steroid-induced ONFH [21]. Furthermore, it was revealed the Li-nHA/GM/rhEPO stents can elevate both Wnt and HIF-1/VEGF pathways and promote osteogenesis and angiogenesis, which is beneficial to the repair of ONFH induced by glucocorticoids [22]. Based on these facts, the study aimed to explore the effects of miR-410 in the prevention of ONFH by targeting Wnt-11.

Our study has provided substantial evidence in relation to the notion that miR-410, ALP, BGLAP, and Collα1 degraded and Wnt-11, ACP5, CTSK, and MMP9 enhanced in ONFH tissues. A recent study has promoted that the expression of miR-410 in osteosarcoma is declined, and the anti-tumor effect is shown [23]. Another study has presented miR-410 expression was reduced in human estrogen receptor-positive tissues of breast cancer [24]. It is reported that secreted factor Wnt-11 expression is ascended in several types of cancer, containing colorectal cancer, where it advances the migration and invasion of cancer cells [25]. Similarly, a previous study has proved that Wnt-11 expression is heightened in hormone-independent prostate cancer [26]. ALP is a useful index for the state diagnosis and clinical prognosis of the disease [27]. OCN (bone gamma-carboxyglutamate protein; BGLAP) is a widely conserved molecule related to mineralization of bone matrix [28]. ACP5 is necessary for osteoclast differentiation and bone resorption, and it promotes cell movement by regulating adhesion kinase phosphorylation [29]. CTSK is a critical protease in charge of osteopontin, degrading type I collagen and other bone matrix proteins [30]. MMPs can degrade and modify most of the components of extracellular matrix and basement membrane and push forward an immense influence on cancer invasion and metastasis [31]. Also, our study revealed that Wnt-11 is the target gene of miR-410. Similarly, Zhang et al. found that miR-410 targeted the inferred binding site in the Wnt3a 3′-UTR to modulate the Wnt signaling pathway [32].

In addition, it was revealed that upregulated miR-410 and downregulated Wnt-11 increased BMD and BV/TV of ONFH rats. It has been suggested previously that a decrease of spinal BMD and an increase of urinary DPD/Cr ratio in non-traumatic ONFH patients [33]. Another study has verified that BMD of the femoral head and lumbar vertebrae in the ONFH group were degraded relative to that in the control group [34]. Additionally, imaging analysis revealed muscone can restore BMD and BV/TV ratio of the necrotic femoral head, while histologic examination further confirmed the protective effect of muscone on alcohol-induced ONFH [35]. A result emerged from our data that highly expressed miR-410 and lowly expressed Wnt-11 restrained apoptosis of osteocytes. A study has demonstrated that silencing miR-410 can induce cell proliferation and reduce the apoptosis of human umbilical vein endothelial cells induced by oxidized low-density lipoprotein [36]. It is reported that the descended miR-410 expression and ascended SOCS3 expression could reduce the expression of anti-apoptosis factor Bcl-2 and promoted the apoptosis of cells [37]. In addition, in androgen deficient LNCaP cells, the downregulation of Wnt-11 can prevent neuroendocrine-like differentiation and lead to apoptosis of prostate cancer cells [26]. The study also showed that the downregulation of Wnt-11 and upregulation of miR-410 enhanced ALP, BGLAP, and Collα1 expression and reduced ACP5, CTSK, and MMP9 expression. A study has indicated that Wnt-11 expression heightened in cervical cancer cells may result in activation and phosphorylation of JNK-1 by activating Wnt/Jnk pathway and boosts the proliferation and migration/invasion of tumor cells [15]. It has been suggested that Wnt-11 gene silencing in colorectal cancer cell lines reduced the invasive ability of cells [25]. Furthermore, the overexpression of miR-410 can restrain the invasion, migration, proliferation, and epithelial mesenchymal transformation of osteosarcoma cells via directly targeting TRIM44 [23]. Furthermore, a previous study stated that upregulated miR-410 inhibited the growth of cholangiocarcinoma in a xenograft mouse model by inducing apoptosis [38].

Conclusion

In summary, our investigation revealed that miR-410 was lowly expressed and Wnt-11 was highly expressed in ONFH, and upregulating miR-410 or downregulating Wnt-11 increased osteoblasts and reduced osteoclasts to alleviate ONFH. However, clinical researches might be further carried out to detect the efficacy of miR-410 and Wnt-11 for the treatment of ONFH.

Доступность данных и материалов

Not applicable

История изменений

Сокращения

ALP:

Щелочная фосфатаза

ANOVA:

Analysis of variance

BMD:

Bone mineral density

EDTA:

Ethylene diamine tetraacetic acid

ELISA:

Иммуноферментный анализ

GAPDH:

Glyceraldehyde phosphate dehydrogenase

GE:

General Electric

HE:

Hematoxylin-eosin

LSD-t:

Least significant difference t test

miR-410:

MicroRNA-410

miRNAs:

MicroRNAs

NC:

Negative control

OD:

Оптическая плотность

ONFH:

Osteonecrosis of femoral head

PBS:

Физиологический раствор с фосфатным буфером

ROI:

Интересующие регионы

RT-qPCR:

Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction

SD:

Sprague-Dawley

SDS:

Додецилсульфат натрия

THR:

Total hip replacement

TRAP:

Tartrate resistant acid phosphatase

TUNEL:

TdT-mediated dUTP-biotin nick end-labeling