Меченные наночастицами берлинского голубого мезенхимальные стволовые клетки:оценка жизнеспособности, пролиферации, миграции, дифференцировки, цитоскелета и экспрессии белков in vitro

Фон

Мезенхимальные стволовые клетки, тип взрослых стволовых клеток, обладают противовоспалительным, регенеративным потенциалом и могут мигрировать в поврежденные ткани, чтобы способствовать восстановлению поврежденной функции [1]. Они могут дифференцироваться в несколько типов клеток в конкретном микроокружении и легко собираются из тканей взрослого человека и плода [2]. Таким образом, мезенхимальные стволовые клетки (МСК) были использованы в регенеративной медицине и онкологической терапии в качестве многообещающего инструмента благодаря этим превосходным свойствам [3, 4]. Однако судьба МСК после трансплантации в организм остается неясной, и неинвазивное отслеживание МСК необходимо in vivo для оценки эффективности трансплантации, их судьбы, свойств и локализации [5]. В последнее время широко используется магнитно-резонансная томография (МРТ) как эффективная технология для исследования структурной и функциональной информации мезенхимальных стволовых клеток in vitro и in vivo [6].

В последние годы множественные наночастицы использовались для маркировки МСК в качестве многообещающего инструмента для неинвазивной визуализации клеток для регистрации их распределения и судьбы in vivo и in vitro, и даже использовались для лечения опухолей [7]. Например, суперпарамагнитные наночастицы оксида железа (SPIO) и квантовые точки (КТ) уже много лет используются для мечения клеток [8, 9]. А флуоресцентные магнитные наночастицы (FMNP) были использованы для мечения МСК для реализации направленной визуализации и синергической терапии клеток рака желудка in vivo [10]. Для этих новых меток необходим тщательный и полный анализ клеточной токсичности, потому что все имеет токсичную дозу и может нарушить функцию последующих клеток [11]. Например, контрастные наночастицы оксида железа по данным МРТ были приписаны генерации АФК и могут вызывать гибель клеток [12].

Недавно было продемонстрировано, что наночастицы берлинской синей (PBNP) могут быть контрастным агентом для МРТ [13,14,15]. Берлинская лазурь, рассматриваемая как практичный, экономичный, безопасный и экологически чистый препарат, была одобрена Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) в клинике для лечения радиоактивного воздействия. Важно отметить, что PBNP были высокодисперсными и стабильными как в воде, так и в биологической имитирующей среде, такой как сыворотка крови, без появления агрегации в течение 1 недели [16], и обладали хорошей фототермической стабильностью, которая могла повторно использовать PBNP во время практического применения [17]. Например, Liang et al. [13] впервые продемонстрировали, что PBNP с сильным поглощением в ближней ИК-области могут использоваться в качестве отличного контрастного вещества для улучшения фотоакустической визуализации. PBNP с однородным размером и хорошей коллоидной стабильностью можно легко изготовить из недорогих химических веществ.

PBNP использовались для маркировки некоторых опухолевых клеток в качестве агента MRI в исследованиях [18], но мало исследований было сообщено о применении PBNP в MSC. Здесь мы сообщаем, что меченные PBNP мезенхимальные стволовые клетки демонстрируют нормальную жизнеспособность, пролиферацию, миграцию, цитоскелет, дифференцировку и экспрессию белка in vitro. Необходима дальнейшая работа, если это реальность in vivo, и чтобы убедиться, что направленная доставка внутрь очага поражения PBNP-меченых МСК так же важна, как мысли о отслеживании клеток.

Методы

Культура клеток

MSC мыши C3H10T1 / 2 были получены от Nanjing KeyGen Biotech. Inc. Клетки культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM; Hyclone, США) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS; Израиль) и 1% пенициллин-стрептомицина (Hyclone, США) при 37 ° C с 5% CO ₂ насыщения, а среду меняли каждые 3 дня. После четырех пассажей клетки использовали для экспериментов.

Подготовка PBNP

При обычном синтезе 2,5 ммоль лимонной кислоты (490 мг) сначала добавляли к 20 мл 1,0 мМ водного раствора FeCl ₃ . раствор при перемешивании при 60 ° C. К этому раствору по каплям добавляли 20 мл 1,0 мМ водного раствора K ₄ [Fe (CN) ₆ ] раствор, содержащий 0,5 ммоль лимонной кислоты (98 мг) при 60 ° C. Сразу образовалась прозрачная ярко-синяя дисперсия. Через 30 мин раствору давали остыть до комнатной температуры, продолжая перемешивание еще 5 мин при комнатной температуре. Затем к дисперсии добавляли равный объем этилового спирта и центрифугировали при 10 000 об / мин в течение 20 мин, в результате чего образовался осадок наночастиц. Последний снова разделяли добавлением равного объема этилового спирта и центрифугированием.

Характеристика PBNP

Инфракрасную спектроскопию синтезированных PBNP измеряли с использованием инфракрасного спектрофотометра (IR; Thermo Fisher Nicolet IS10). Морфологию синтезированных PBNP исследовали с помощью просвечивающей электронной микроскопии (TEM; JEM 2100F). Зависимая от поля намагниченность PBNP исследовалась с помощью магнитометра с вибрирующим образцом (VSM; Lakeshore 7307). Рентгеноструктурный анализ (XRD) выполняли с использованием Bruker D8 ADVANCE A25X (XRD). Индекс полидисперистости PBNP определяли с помощью Zetasizer Nano ZS.

Внутриклеточное распределение PBNP и ультраструктура меченых клеток C3H10T1 / 2

Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) была проведена для оценки внутриклеточного распределения PBNP. После удаления среды клетки промывали PBS, а затем переваривали 0,25% трипсином. Затем клетки переносили в пробирку EP объемом 1,5 мл для центрифугирования (2000 об / мин, 5 мин). Затем супернатант удаляли и клетки фиксировали 0,25% глутаровым альдегидом и 1% осмиевой кислотой. После повторной промывки клеток клетки дегидратировали в 50% этаноле, 70% этаноле, 90% этаноле, 90% ацетоне и 100% ацетоне в течение 20 минут каждый. Затем клетки помещали на ночь при 4 ° C. Затем проводили двойное окрашивание срезов 3% ацетатом-цитратом урана. Наконец, изображения были собраны ТЕМ.

Сканирующая электронная микроскопия (SEM) была проведена для оценки ультраструктуры меченых клеток C3H10T1 / 2. После удаления среды клетки промывали PBS и фиксировали 3% глутаровым альдегидом при предварительном охлаждении на 4 ° C в течение ночи. Затем клетки дважды промывали PBS и фиксировали 1% осмиевой кислотой при 4 ° C в течение 1 ч. После повторной промывки клеток C3H10T1 / 2 клетки дегидратировали в спиртах с возрастающей градацией (30% этанол, 50% этанол, 70% этанол, 80% этанол, 90% этанол, 95% этанол и 100% этанол) в течение 2 × По 10 мин. Затем клетки погружали в 70%, 80%, 90%, 95% и 100% раствор ацетонитрила на 15 мин каждый. Затем были выполнены вакуумная сушка и нанесение покрытия на золото распылением. Наконец, изображения были собраны SEM.

Анализ жизнеспособности клеток PBNP

Жизнеспособность клеток оценивали с помощью МТТ (Sigma, США). Клетки высевали в 96-луночные планшеты в количестве 1 × 10 ³ . клеток на лунку при 37 ° C с 5% CO ₂ Атмосфера. После инкубации в течение ночи культуральную среду заменяли 100 мкл свежей среды, содержащей различные концентрации PBNP (0, 5, 10, 20, 40 и 80 мкг / мл), а затем клетки культивировали еще от 1 до 3 дней. Культуральную среду удаляли, и клетки инкубировали с 20 мкл МТТ (5 мг / мл) при 37 ° C в течение 4 часов. Выпавшие в осадок кристаллы фиолетового красителя растворяли в 150 мкл диметилсульфоксида (ДМСО; Sigma-Aldrich, США) в течение 10 мин при осторожном встряхивании. Величину оптической плотности (OD) измеряли при длине волны 490 нм с использованием считывающего устройства для микропланшетов. Результаты клеток выражали в процентах жизнеспособных клеток.

Анализ распространения

По сравнению с MTT, MTS, WST-1 и XTT, RTCA позволяет анализировать весь период эксперимента и не требует маркировки, которая отрицательно сказывается на экспериментах с культурами клеток [19]. Таким образом, система xCELLigence (Roche / ACEA Biosciences) использовалась для измерения пролиферации клеток в реальном времени. Вкратце, клетки высевали в E-Plate-16 (ACEA Biosciences, Inc., Сан-Диего, США) при 5 × 10 ³ клеток на лунку с 150 мкл полной среды. После 24 часов выращивания среду заменяли свежей средой, содержащей различные концентрации PBNP, и инкубировали еще 96 часов. Эта система измеряла электрический импеданс, который был создан путем прикрепления клеток к интегрированным в микроэлектрод планшетам для культивирования клеток [20], чтобы предоставить количественную информацию о количестве и жизнеспособности клеток в режиме реального времени с помощью прибора RTCA-DP [21]. Клеточную пролиферацию измеряли периодически каждые 15 минут в течение следующих 4 дней.

Мониторинг миграции сотовой связи в реальном времени

Миграцию клеток C3H10T1 / 2 измеряли с использованием системы анализа инвазии и миграции клеток в реальном времени (RT-CIM) (ACEA Biosciences, Inc., Сан-Диего, США). Клетки обладают способностью увеличивать импеданс до считывания «индекса клетки», когда они контактируют и прилипают к датчикам из-за миграции клеток из верхней камеры в нижнюю камеру через мембрану. Просто клетки засевали в верхнюю камеру с плотностью 4 × 10 ⁴ на лунку в бессывороточной среде в присутствии различных концентраций PBNP. Нижние камеры планшетов CIM были заполнены 165 мкл полной среды, содержащей 10% FBS. Миграцию клеток контролировали прибором RTCA DP каждые 10 мин в течение 100 часов. Индекс ячейки (CI) использовался для отражения результатов. Значение CI было получено из изменения электрического импеданса при взаимодействии живых клеток с поверхностью биосовместимого микроэлектрода в лунке микропланшета для эффективного измерения количества, формы и адгезии клеток. Чем больше количество перенесенных ячеек, тем больше индекс ячейки.

Исследование клеточной миграции с помощью Transwell Assay

После культивирования с различными концентрациями PBNP в течение 48 часов клетки с плотностью 2 × 10 ⁶ ячейка / см ² культивировали в камере Transwell (размер пор 8 мкм; BD FalconTM, США) в течение 24 часов при 37 ° C и 5% CO ₂ . После культивирования внутреннюю камеру очищали, а мигрировавшие клетки на дне камеры фиксировали и окрашивали 0,1% кристаллическим фиолетовым. После каждого шага промывали PBS в течение 5 мин три раза. Мигрировавшие клетки фотографировали в разных полях зрения с помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа (CK2, Olympus, Япония).

Дифференциация клеток in vitro

C3H10T1 / 2-меченые или немеченые PBNP индуцировали дифференцировку в две нижележащие клеточные линии адипоцитов или остеоцитов. После того, как клетки достигли слияния в шестилуночном планшете, клетки культивировали в среде для остеогенной индукции (10% FBS / DMEM, содержащей 10 нМ дексаметазона, 50 мкМ аскорбиновой кислоты, 10 мМ β-глицерофосфата, Sigma) или в среде для адипогенной индукции (10% FBS / DMEM, содержащий 1 мкМ дексаметазона, 0,5 мМ изобутилметилксантин, 10 мкМ инсулин, Sigma). Через 3 недели клетки промывали PBS, фиксировали 4% полиоксиметиленом и окрашивали ализариновым красным или Oil Red O (Sigma). Индуцированные клетки фотографировали в разных полях зрения с помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа (CK2, Olympus, Япония).

Иммунофлуоресцентный анализ для визуализации F-актина

МСК культивировали с различными концентрациями PBNP в 24-луночном планшете в течение 48 часов. Клетки фиксировали 4% параформальдегидом в течение 10 минут, пермеабилизировали 0,2% тритоном-100 в течение 5 минут, блокировали 1% BSA в PBS в течение 30 минут при комнатной температуре, а затем культивировали с фаллоидином (1:100, Thermo Fisher Scientific. , США) и DAPI (1:800, Thermo Fisher Scientific, США) в течение 30 мин при комнатной температуре. Флуоресцентная микроскопия выполнялась на микроскопе Nikon eclipse Ti-S с программным обеспечением NIS elements

Экспрессия белка с помощью вестерн-блоттинга

Экспрессию белка в клетках оценивали с помощью Вестерн-блоттинга. МСК культивировали со средой, содержащей различные концентрации PBNP (0, 25, 50 мкг / мл), на шестилуночных планшетах в течение 24 ч, дважды промывали ледяным PBS и соскребали в 100 мкл буфера PIPA (Beyotime), содержащего ингибиторы протеаз и ортованадат натрия (Beyotime, Китай). Через 30 мин образцы центрифугировали при 14000 об / мин в течение 10 мин при 4 ° C, затем концентрации белка в образцах определяли с помощью набора BCA (Beyotime, Китай). Такое же количество белков подвергали электрофорезу в 10% гелях SDS-PAGE (Beyotime, Китай) и переносили на мембрану PVDF (GE Healthcare). Мембраны блокировали 5% молоком в трис-буферном физиологическом растворе с Tween20 (TBST) при комнатной температуре в течение 2 ч, а затем инкубировали с анти-β-катенином (1:1000, CST, США), анти-виментином (1:1000). , Abiocode) и анти-β-актин (1:1000, CST, USA) в течение ночи при 4 ° C. Мембраны промывали трижды по 5 мин каждый, а затем инкубировали с соответствующими вторичными антителами в течение 2 ч при комнатной температуре. Сигналы детектировали с помощью ECL и ECL-plus (Beyotime, Китай) и подвергали воздействию системы Molecular Image® ChemiDoc ™ XRS + (Bio-Rad Inc., США) с помощью программного обеспечения Image Lab ™ с использованием усиленной хемилюминесценции.

Исследование эффективности клеточной маркировки с помощью визуализации клеток с помощью МРТ

МСК обрабатывали различными концентрациями (25 и 50 мкг / мл) PBNP, и контрольные клетки культивировали с заполненной средой без PBNP в течение 48 часов, трижды промывали буфером PBS, трипсинизировали, собирали и затем помещали в 1 мл 1. % ( w / v ) раствор агарозы для визуализационных исследований. Кроме того, МСК, меченные 50 мкг / мл PBNP, индуцировали к остеогенной дифференцировке в течение 14 дней, затем исследовали влияние сигнала МРТ. Визуализация с T2-взвешиванием была выполнена с использованием последовательности эхо-сигналов с градиентным восстановлением инверсии с TE =23 мс, TR =400 мс, NEX =2,0, толщиной среза 2 см, полем обзора 20 × 20 см и размером матрицы 384 × 256.

Статистический анализ

Результаты выражали как среднее значение ± стандартное отклонение по крайней мере трех независимых экспериментов, проведенных в трех повторностях. Группы лечения сравнивали с использованием одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) и t Стьюдента. был использован тест. p Значение <0,05 было принято как значимое различие.

Результаты и обсуждение

Характеристика PBNP

Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) была проведена для характеристики PBNPs (рис. 1a), которые имеют диаметр 20-25 нм. Что касается морфологии, PBNP имели кубическую структуру. На рис. 1б представлена ​​инфракрасная спектроскопия синтезированных PBNP. PBNP показали типичный пик поглощения Fe ³⁺ . -CN около 2085,23 морских миль, что соответствует таковому у PBNP. Измерение зависящей от поля намагниченности в дальнейшем использовалось для изучения магнитных свойств PBNP. На рис. 1в показаны кривые намагничивания PBNP при комнатной температуре, демонстрирующие суперпарамагнетизм PBNP. На рисунке 1d показаны дифракционные пики при 200, 220, 400 и 420, которые подтверждаются рентгенограммой PBNP. Кроме того, индекс полидисперистости PBNP составил 0,16, что указывает на равномерное распределение частиц по размерам.

Характеристика PBNP. а Морфология PBNP. б Спектры поглощения PBNP в УФ-видимой области. c Зависимая от поля намагниченность PBNP. г Рентгенограмма PBNP

Поглощение клетками и цитотоксичность PBNP

Для дальнейшего подтверждения клеточного поглощения PBNP MSC изучали клеточную микроморфологию вышеуказанных клеток C3H10T1 / 2, обработанных PBNP и без них. На рис. 2 показаны СЭМ- и ПЭМ-изображения клеток C3H10T1 / 2 после инкубации в течение 48 часов с PBNP и без них. По изображениям SEM, ультраструктура меченых клеток C3H10T1 / 2 не претерпела явных изменений по сравнению с контрольными клетками C3H10T1 / 2. Из изображений ПЭМ контрольные клетки C3H10T1 / 2 без инкубации с PBNP показали типичную клеточную микроморфологию с очевидными клеточными микроструктурами. Тем не менее, после инкубации с PBNP в цитоплазме клеток C3H10T1 / 2 четко наблюдалось случайное распределение PBNP. И некоторые PBNP оказались локализованными в везикулах в цитоплазме клеток. Хотя случайное распределение PBNP наблюдалось в цитоплазме клеток C3H10T1 / 2, точный механизм внутриклеточного поглощения был неясен. Мы предполагаем, что интернализация PBNP в клетках C3H10T1 / 2 может происходить по такому же механизму, как и в предыдущем исследовании, в котором сообщалось, что различные неорганические наночастицы, включая берлинскую лазурь – поли (l-лизин), золото, серебро и оксиды металлов, могут легко поглощается клетками посредством эндоцитоза [15, 22, 23].

СЭМ и ПЭМ изображения клеток C3H10T1 / 2 после инкубации с различными концентрациями PBNP в течение 48 часов. а СЭМ изображения. б Изображения ПЭМ. ↑, внутриклеточно распределенные PBNP

Для оценки цитотоксичности и анализа жизнеспособности клеток в МСК использовали метод МТТ. Клетки инкубировали от 1 до 3 дней при 37 ° C в атмосфере 5% CO ₂ . с различными концентрациями PBNP, суспендированных в DMEM. Было проведено три независимых испытания, и были представлены средние значения и стандартные отклонения. На рисунке 3 показано, что жизнеспособность МСК, обработанных PBNP (5, 10, 20, 40, 80 мкг / мл), была относительно жизнеспособности контрольных клеток через 24–72 часа соответственно. Результаты показали, что PBNP нетоксичны для клеток, обработанных таким же количеством PBNP, что и МТТ. Кроме того, для исследования кривых роста МСК был использован анализ пролиферации в реальном времени с использованием прибора xCELLigence. Результаты показали, что эти концентрации PBNP не оказали значительного влияния на кривые роста МСК (рис. 4a), а жизнеспособность клеток была подсчитана и показана на рис. 4b после обработки через 24, 48, 72 и 96 часов. Эти результаты предполагают, что PBNP не влияют на пролиферацию MSC.

Жизнеспособность клеток C3H10T1 / 2 в присутствии различных количеств PBNP, определенная методом МТТ

Пролиферация клеток C3H10T1 / 2 в присутствии различных количеств PBNP, как определено с помощью анализа RT-CIM. а Кривые роста клеток C3H10T1 / 2. б Жизнеспособность клеток C3H10T1 / 2 после обработки через 24, 48, 72 и 96 часов

Возможность переноса ячеек

Миграцию МСК, обработанных различными концентрациями PBNP, тестировали с использованием анализа Transwell и нового метода, системы анализа RT-CIM. Из анализа Transwell меченые клетки не показали очевидных изменений в миграции. Используя систему анализа RT-CIM, миграцию клеток отслеживали в режиме реального времени, что отражало более точные данные и могло более точно предсказать способность миграции клеток. Из системы анализа RT-CIM, хотя в начале мечения меченые клетки мигрировали медленнее, чем немеченые клетки. Но через 72 и 96 часов не было значительной разницы в миграции клеток между мечеными и немечеными клетками, что указывает на то, что высокие концентрации PBNP не влияют на подвижность МСК (рис. 5).

Миграция клеток C3H10T1 / 2 в присутствии различных количеств PBNP. а Миграцию клеток C3H10T1 / 2 определяют с помощью анализа RT-CIM. б Индекс клеток C3H10T1 / 2 после обработки через 12, 24, 48, 72 и 96 часов. c Миграция клеток C3H10T1 / 2 определена анализом Transwell (увеличение × 200)

Дифференциация клеток in vitro

Плюрипотентность меченых и немеченых МСК исследовали с помощью окрашивания ализариновым красным и масляным красным О. На рисунке 6 показано, что меченые МСК могут быть успешно дифференцированы в адипоциты и остеоциты, как это сделали немеченые МСК. Эти результаты предполагают, что PBNP не влияют на способность клеток к дифференцировке, что сохраняет плюрипотентность меченых МСК.

Дифференциация клеток in vitro с PBNP или без них. Окрашивание масляным красным О для адипоцитов и окрашивание ализариновым красным для остеоцитов. Изображения были получены через 3 недели после маркировки (увеличение × 200)

Влияние маркировки PBNP на цитоскелет

Чтобы исследовать влияние PBNP на цитоскелет МСК, использовали иммунофлуоресцентный анализ F-актина. Окрашивание фаллоидином показывает отсутствие изменений красных актиновых филаментов цитоскелета после мечения в течение 48 часов по сравнению с немечеными МСК. Сравнение целостности и распределения актиновых филаментов в меченых и немеченых клетках в течение 48 часов не выявило никаких изменений (рис. 7).

Иммунофлуоресценция клеток C3H10T1 / 2 в присутствии различных количеств PBNP в течение 48 ч (увеличение × 400). ↑, цитоскелет

Вестерн-блоттинг

Пути передачи сигналов Wnt играют важную роль в регуляции клеточной пролиферации, дифференцировки, апоптоза, образования тканей и судьбы стволовых клеток [24]. Итак, β-катенин - это функциональный белок МСК. Кроме того, виментин является мезенхимальным биомаркером, а также функциональным белком МСК [25]. Эти два белка связаны с биологической функцией МСК. Экспрессию β-катенина и виментина оценивали с помощью вестерн-блоттинга. На фигуре 8 показано, что экспрессия β-катенина и виментина в MSC, обработанных различными концентрациями PBNP в течение 48 часов, не претерпела значительных изменений по сравнению с экспрессией MSC, обработанных без PBNP. Эти результаты показали, что PBNP не могут изменять экспрессию β-катенина и виментина MSC, что показало стабильность биологической функции MSC после обработки PBNP.

Вестерн-блоттинг показывает экспрессию β-катенина и виментина в МСК, обработанных PBNP и без них в течение 48 часов. Уровень β-катенина и виментина количественно определяли с помощью программного обеспечения ImageJ

МРТ In Vitro

МСК, как и другие стволовые клетки, обладают потенциалом дифференцировать клетки костей, хрящей, жира, мышц и сердца, которые стали важным источником для регенеративной медицины. А отслеживание миграции и исходов МСК так важно для оценки роли и результатов экзогенных МСК в репарации дефектов. Магнитно-резонансная томография (МРТ) помогла наблюдать МСК после клинического введения, и для МРТ необходимо контрастное вещество. Потенциал использования PBNP в качестве эффективного T2-взвешенного клеточного контрастирующего агента для МРТ был продемонстрирован [14], а некоторые другие исследования также продемонстрировали, что модификация поверхности PBNP повышает его эффективность при МРТ [17, 26]. В настоящее время мечение PBNP используется во множестве клеток. Dumont et al. описали PBNP как агенты для МРТ и флюоресцентной визуализации детских опухолей головного мозга [27]; Perera et al. разработали PBNP, содержащие гадолиний, для раннего обнаружения опухолей желудочно-кишечного тракта [28]; и Cano-Mejia et al. комбинированная фототермическая терапия (PTT) на основе наночастиц берлинской синей (PBNP) с ингибированием контрольных точек анти-CTLA-4 для лечения нейробластомы [29]. Однако отчеты о MSC, меченных PBNP, появляются редко. Кроме того, остается неясным, есть ли какое-либо негативное влияние на функцию клеток и жизнеспособность МСК после мечения PBNP.

Чтобы исследовать, обладают ли PBNP способности увеличивать Т2-взвешенный контраст клеток при МРТ, мы инкубировали МСК с или без PBNP и исследовали влияние сигнала МРТ. Чтобы контролировать временную стабильность мечения и исследовать, потеряют ли PBNP возможности визуализации при дифференцировке MSC, мы инкубировали MSC с PBNP и индуцировали MSC к остеогенной дифференцировке в течение 14 дней, затем исследовали влияние сигнала MRI. Как показано на фиг. 9, осадок МСК, инкубированных с PBNP, показал четкий эффект затемнения сигнала МРТ, и значение SI меченых МСК имело очевидное отличие от немеченых МСК. Примечательно, что меченые МСК также демонстрировали явный эффект потемнения сигнала МРТ при индуцировании дифференцировки. Эти результаты продемонстрировали, что PBNP могут быть использованы в качестве эффективного контрастного агента T2 для клеточной визуализации MSC и могут обеспечивать долгосрочное удерживание контрастного вещества даже после дифференцировки клеток.

Т2-взвешенные МРТ-фантомы МСК. а Поперечный разрез. б Количественный анализ значения SI. ** P <0,001 по сравнению с контролем

Есть много опубликованных данных о МСК, меченных магнитными наночастицами (МНЧ), но применение МНЧ было ограничено их цитотоксичностью. При доставке MNP к ткани-мишени большинство MNP часто распределяются в печени и селезенке, поэтому токсичностью MNP нельзя пренебрегать [30]. Например, Costa C обнаружил, что SPION могут вызывать цитотоксичность по отношению к нейрональным клеткам и клеткам глии [31]. Как мы упоминали выше, PBNP не проявляли обнаруживаемой цитотоксичности и не влияли на клеточные характеристики МСК, включая цитоскелет, клеточную морфологию и функциональный белок. Таким образом, эффективность использования PBNP в качестве эффективного контрастного агента для Т2-взвешенной клеточной МРТ будет продемонстрирована с точки зрения цитотоксичности.

Выводы

Таким образом, мы представили PBNP для отслеживания мезенхимальных стволовых клеток и изучили выживаемость, потенциал миграции и клеточные характеристики MSC после того, как были помечены PBNP. Кроме того, мы также продемонстрировали потенциал PBNP в качестве эффективного контрастного агента T2-взвешенной МРТ для клеточной МРТ МСК. PBNP могут эффективно использоваться для мечения МСК и не влияют на биологические характеристики МСК. Этот вывод проложил новую дорогу для обозначения MSC.

Сокращения

DMEM:

Модифицированный носитель Орла, созданный Дульбекко

DMSO:

Диметилсульфоксид

FBS:

Фетальная бычья сыворотка

МРТ:

Магнитно-резонансная томография

MSC:

Мезенхимальные стволовые клетки

NIR:

Ближний инфракрасный порт

OD:

Оптическая плотность

PBNP:

Наночастицы берлинской синей

ТЕМ:

Просвечивающая электронная микроскопия

VSM:

Магнитометр с вибрационным образцом