Наночастицы альбумина, содержащие артесунат и конъюгированные с красителем в ближнем инфракрасном диапазоне, как высокоэффективное нацеленное на опухоль фотохимиотераностическое средство

Фон

В течение последних десятилетий фотохимиотерапия под визуализацией (IGPC) вызвала большой интерес у многих исследователей, поскольку это многообещающая стратегия для реализации индивидуализированной терапии опухолей [1, 2]. IGPC позволяет точно определить местонахождение опухоли и отслеживать лекарство in vivo, гарантируя эффективную терапию и уменьшая побочные эффекты [3, 4]. Чтобы быть эффективным, IGPC должен обладать следующими характеристиками:(i) необходим многофункциональный тераностический агент, выполняющий как визуализационные, так и терапевтические функции; (ii) тераностический агент должен быть биосовместимым, стабильным и специфичным в отношении опухоли [5,6,7,8]. Метод визуализации диагностики в IGPC обычно включает магнитно-резонансную томографию, фотоакустическую визуализацию и флуоресцентную визуализацию [9,10,11,12,13,14]. Из-за высокой чувствительности, благоприятного временного разрешения и высокого отношения сигнал / фон флуоресцентная визуализация обычно применялась для фундаментальных исследований и в клинической практике [15, 16].

Методы фотохимиотерапии в основном включают фототермическую терапию (ФТТ), фотодинамическую терапию (ФДТ) и химиотерапию. Поскольку облучение в ближней инфракрасной области (NIR) является одинаковым, функции PTT и PDT могут быть объединены в одну, что делает возможным избирательное и эффективное разрушение опухоли с помощью лазерного луча. Однако сообщалось, что фототермическая и фотодинамическая (PTT-PDT) терапия часто ограничивается неполным подавлением опухоли, что потенциально может вызвать рецидив опухоли [17,18,19]. Химиотерапия, широко используемый метод лечения рака, может эффективно убивать опухолевые клетки посредством системного введения, хотя токсичность для близлежащих нормальных клеток из-за ее неспецифичности ограничивает ее применение [20,21,22]. Таким образом, комбинация IGPC может стать отличной стратегией для преодоления вышеуказанных ограничений.

С развитием наномедицины были разработаны тераностические агенты IGPC, включая индоцианиновый зеленый (ICG), наночастицы на основе металлов, углеродные наноматериалы и полимерные наноматериалы [23,24,25,26,27]. Среди них ICG был одобрен FDA, и сообщается о его использовании в клинической практике для определения сердечного выброса, функции печени, кровотока и офтальмологической ангиографии [28, 29]. Кроме того, ICG обладает высокой эффективностью поглощения в ближней инфракрасной области, таким образом, вызывая высокий эффект PTT-PDT при однократном облучении в ближней инфракрасной области [30]. Однако следующие недостатки, такие как нестабильность в водном растворе, быстрое очищение организма, склонность к самообесцвечиванию и отсутствие целенаправленности, серьезно препятствуют его широкому применению [31, 32]. Чтобы преодолеть эти ограничения, свободные молекулы ICG обычно переносятся транспортными средствами, включая мицеллы, полимерные наночастицы и самособирающиеся белковые наноструктуры, с образованием нанокомпозитов [33, 34]. Хотя соответствующие работы доступны, для визуализации in vivo и фототерапии все еще требуется больше биосовместимых и новых нанокомпозитов на основе ICG.

В этой работе мы сообщили о целевом агенте IGPC, который ковалентно конъюгировал фолиевую кислоту (FA) и ICG с наночастицами человеческого сывороточного альбумина (HSA), которые также инкапсулировали противораковый препарат артесунат (Arte) (FA-IHA NPs). Сообщалось, что ЖК связывает наночастицы, чтобы увеличить эффективность их поглощения клетками посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза [17]. HSA - это эндогенный белок. Благодаря своей хорошей биосовместимости, нетоксичности и неиммуногенности, HSA стал одним из наиболее интересных носителей для доставки нерастворимых противораковых препаратов [12, 17, 31]. Arte, натуральный препарат, полученный из Artemisia annua , была доказана значительная эффективность при лечении различных видов рака, таких как рак печени, рак легких и рак груди [35]. Приготовленные НП FA-IHA состояли из этих четырех клинически одобренных материалов и показали высокую биосовместимость и стабильность. В качестве многофункционального тераностического нанокомпозита ICG применялся в качестве агента для получения изображения с помощью флуоресценции в ближнем инфракрасном диапазоне и агента для фототерапии из-за его свойств PTT-PDT. Arte был сильно загружен в НЧ и высвобождался БИК-излучением для химиотерапии. На основании результатов визуализации NIR был продемонстрирован высокий эффект целевой комбинации IGPC как in vitro, так и in vivo. Согласно нашим результатам, мы полагаем, что НЧ FA-IHA могут быть потенциально универсальным тераностическим агентом в контролируемой доставке лекарств и нацеленной на опухоль комбинированной фотохимиотерапии под контролем визуализации.

Методы

Материалы

N- (3-диметиламинопропил) -N'-этилкарбодиимидгидрохлорид (EDC), N-гидроксисукцинимид (NHS) и артесунат (Arte, ≥ 99%) были получены от Sigma-Aldrich (США). 4 ', 6'-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) и набор для подсчета клеток-8 (CCK-8) были приобретены у Aladdin (Шанхай, Китай). NH ₂ –ПЭГ ₂₀₀₀ –COOH и NH ₂ –ПЭГ ₂₀₀₀ -FA были куплены у Xi’an Ruixi Biological Technology Co., Ltd. (Сиань, Китай). Среда DMEM и физиологический раствор с фосфатным буфером (PBS) были предоставлены Gibco BRL (Нью-Йорк, США). Сульфо-NHS ​​производное ICG (ICG-NHS) было куплено в Dojindo Laboratories (Кумамото, Япония).

Синтез и характеристика НП FA-IHA

Артесунат растворяли в ДМСО, а затем добавляли в 15 мл воды. К вышеуказанному раствору добавляли 10 мг порошка HSA и слегка перемешивали в течение 3 часов при комнатной температуре. После перемешивания смесь обрабатывали сшиванием 150 мкл 0,5% глутарового альдегида. Чтобы удалить избыточные химические реагенты, смесь диализовали против дистиллированной воды (пороговая молекулярная масса =8000–12000 Да) в течение 1 дня, в результате чего были получены нанокомпозиты HSA, нагруженные Arte (Arte-HSA).

Для активации карбоксильных групп HSA в раствор Arte-HSA добавляли химические реагенты EDC и NHS. После этого смесь реагировала с NH ₂ . –ПЭГ ₂₀₀₀ -FA в течение 3 ч при 4 ° С. Затем к смеси добавляли ICG-NHS при легком перемешивании в течение 30 минут при комнатной температуре. Очищенные наночастицы FA и ICG-конъюгированного HSA (FA-ICG-HSA @ Arte, НЧ FA-IHA) получали диализом в деионизированной воде в течение 24 часов. Количество загруженного Arte и ICG определяли спектрофотометром в УФ-видимой области. Эффективность загрузки =W1 / W2 × 100%, где W1 представляет собой вес Arte или ICG в НЧ FA-IHA, а W2 - вес добавленного Arte или ICG.

Просвечивающая электронная микроскопия (Hitachi, Токио, Япония) использовалась для определения морфологии образцов. Zetasizer (Zetasizer 3000; Malvern Instruments, Вустершир, Великобритания) использовали для измерения размера и дзета-потенциала образцов. Спектрофотометр UV-vis (UV-1601PC, Shimadzu, Kyoto, Japan) применяли для измерения спектров поглощения. Одноволновый лазер непрерывного действия с длиной волны 808 нм (Beijing Laserwave Optoelectronics Technology Co. Ltd) применялся для проведения фототермических экспериментов, а температура определялась термометром с термопарой (Fluke, США).

Высвобождение артефактов, вызванное термическим воздействием и pH

Для определения термического и pH-триггерного высвобождения Arte, НЧ FA-IHA (50 мкг / мл) были разделены на три группы:(a) pH 6,5, (b) pH 7,4 и (c) pH 6,5 при БИК-облучении (808 нм, 1 Вт / см ² , Импульс 1 мин) в выбранные моменты времени в течение 36 ч. Высвободившееся количество Arte определяли по поглощению Arte в УФ-видимой области при 287 нм в супернатанте.

Обнаружение выработки синглетного кислорода

1,3-дифенилизобензофуран (DPBF) был использован для обнаружения синглетного кислорода. 15 мкл раствора ацетонитрила DPBF добавляли в исходный раствор НЧ ICG или FA-IHA (1,0 мл, 10 мкг / мл) и тщательно перемешивали с последующим 5-минутным облучением (808 нм, 1,0 Вт / см 2 ). Спектры поглощения УФ-видимой области были записаны в разные моменты времени, и скорость уменьшения поглощения при 410 нм пропорциональна производству синглетного кислорода.

Культура клеток и клеточное поглощение

Клетки HepG2 были приобретены из Американской коллекции типовых культур и размером 25 см ² колба для культивирования клеток, соответственно, с культуральной средой DMEM путем добавления 1% пенициллин-стрептомицина и 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). Клетки HepG2 хранили при 37 ° C в 5% CO ₂ атмосфера.

Для наблюдения клеточного поглощения клетки HepG2 культивировали со свободными ICG, IHA NP и FA-IHA NP (с 0,05 мг / мл ICG) в течение 6 часов. После этого обработанные клетки трижды промывали PBS. Затем клетки фиксировали 200 мкл глутаральдегида и окрашивали DAPI в течение 10 мин. Сигналы флуоресценции наночастиц в клетках регистрировали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (FV300, Olympus, Япония).

Для дальнейшей оценки клеточного поглощения применяли проточный цитометр (FCM, BD, Franklin Lakes, NJ, USA). Как описано выше, клетки, обработанные свободными ICG-, IHA NPs и FA-IHA NPs, трижды промывали PBS и расщепляли трипсином-EDTA. Взвешенные клетки вводили непосредственно в FCM для анализа коэффициента поглощения клетками.

Создание внутриклеточных ROS

Клетки HepG2 культивировали в 12-луночных планшетах с плотностью 2 × 10 ⁵ . клеток на миллилитр и инкубировали в течение 24 часов с последующим добавлением 1 мл различных образцов, включая (1) PBS, (2) Arte, (3) FA-HA-NP, (4) свободный ICG, (5) IHA- НП и (6) раствор НП ФА-ИГА. После дополнительной инкубации в течение 12 часов клетки облучали в течение 5 минут (808 нм, 1,0 Вт / см ² ) с последующей обработкой DCFH-DA (5 мкг / мл) в течение еще 30 мин. Наконец, клетки были тщательно промыты PBS, и образование внутриклеточных ROS было обнаружено количественно с помощью цитометра и качественно с помощью инвертированной флуоресцентной микроскопии Leica.

Комбинированная фотохимиотерапия опухолей in vitro

Клетки HepG2 высевали в 96-луночные планшеты (2 × 10 ⁴ клеток на лунку) для 24-часовой инкубации. Свободные НЧ ICG, Arte, IHA и НЧ FA-IHA (с 0, 5, 10, 20 и 30 мкг / мл Arte) добавляли в клетки. После 6-часовой инкубации старые среды были выброшены. Обработанные клетки облучали лазером с длиной волны 808 нм (1,0 Вт / см ² или без него). , 5 мин) и культивировали в течение следующих 24 часов. Жизнеспособность клеток измеряли с помощью классического анализа CCK-8 в соответствии с протоколом.

Чтобы дополнительно подтвердить наличие живых и мертвых клеток после обработки NIR, обработанные клетки совместно окрашивали кальцеином-AM / PI. Клетки HepG2 предварительно высевали в чашки диаметром 35 мм с плотностью 1 × 10 ⁶ . клеток на чашку и обрабатывали PBS, PBS + NIR, НЧ FA-IHA или НЧ FA-IHA + NIR. После 6 часов инкубации клетки облучали в течение 5 минут лазером с длиной волны 808 нм (1 Вт / см ² ) и культивировали в течение следующих 24 часов. Клетки окрашивали кальцеином-AM / PI в течение 30 мин, промывали PBS для удаления избытка раствора красителя, а затем отображали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (кальцеин-AM lex =488 нм, lem =515 нм; PI lex =535 нм. , lem =617 нм).

Модель животных и флуоресцентная визуализация in vivo

Голых мышей Balb / c получали из Центра лабораторных исследований животных провинции Гуандун и использовали в соответствии с протоколами, утвержденными Медицинским университетом Гуанчжоу. Чтобы установить подкожные опухоли HepG2, 1 × 10 ⁶ Клетки HepG2 (в 100 мкл PBS) вводили в спину голой мыши Balb / c.

Мыши с опухолями ( n =5) были получены с помощью имеющейся в продаже системы IVIS Spectrum (Caliper LifeSciences, США) до и через 10 мин, 6 ч, 12 ч, 24 ч и 48 ч после внутривенного введения свободных ICG, НЧ IHA и FA- НП МАС.

Комбинированная фотохимиотерапия опухолей in vivo

Мышей с опухолями случайным образом разделили на разные группы ( n =5) и лечились PBS, Arte, НЧ FA-IHA, ICG + NIR, НЧ IHA + NIR и НЧ FA-IHA + NIR (с равной дозой свободного Arte), соответственно. Пятиминутный БИК-лазер (808 нм, 1 Вт / см ² ) использовали для облучения области опухоли через 24 часа (день 0) и 48 часов (день 1) после внутривенной инъекции этих образцов. Регистрировали тепловые изображения и температуру облученных мышей. Во время лечения размер опухоли регистрировали каждые 4 дня и рассчитывали в соответствии с уравнением:объем =(длина опухоли) × (ширина опухоли) ² / 2. Результаты были представлены как относительный объем опухоли, который представлял собой объем опухоли, деленный на исходный объем опухоли. После лечения основные органы, включая сердце, печень, селезенку, легкие и почки этих мышей в группах PBS и FA-IHA NPs + NIR, собирали, фиксировали в 4% формалине, заливали в парафин, окрашивали H&E и регистрировали с помощью цифровой микроскоп.

Результаты и обсуждение

Синтез и характеристика НП FA-IHA

На рисунке 1 схематично показано использование НЧ FA-IHA и их применение для направленной на опухоль комбинированной фотохимиотерапии с визуализацией. Многофункциональные тераностические агенты НЧ FA-IHA были приготовлены с помощью простого и биосовместимого метода самосборки. Конъюгированный ICG был использован в качестве агента для визуализации флуоресценции NIR и агента для фототерапии из-за его свойств PTT-PDT. Кроме того, загруженный Арте оказывал химиотерапевтический эффект.

Схематическое изображение использования НЧ FA-IHA для направленной на опухоль комбинированной фотохимиотерапии под визуализацией in vitro и in vivo

На ПЭМ-изображении НЧ FA-IHA показана монодисперсная сферическая структура диаметром примерно 131,2 нм (рис. 2а). Этот гидродинамический диаметр был подтвержден как длина 131 ± 2,3 нм в воде, фосфатно-солевом буфере (PBS) и клеточной среде (рис. 2b), согласно DLS-анализу. Дзета-потенциал 131,2 ± 2,12 также был определен как -29,2 ± 1,13 мВ в этих трех средах (рис. 2c). Более того, диаметр НЧ FA-IHA не претерпел значительных изменений в течение 7 дней в этих трех средах (рис. 2d). Эти результаты показали, что приготовленные наночастицы FA-IHA имели хорошую стабильность, вероятно, из-за покрытия PEG и HSA. Спектр UV-vis-NIR НЧ FA-IHA показал пик поглощения как Arte, так и ICG (рис. 2e), демонстрируя существование Arte и ICG в НЧ FA-IHA. Коэффициент загрузки Arte составлял 98,6 ± 3,1%, а коэффициент загрузки ICG составлял 56,9 ± 2,4%. На рис. 2f показано, что НЧ FA-IHA имели сходные свойства флуоресценции по сравнению со свободным ICG.

а ПЭМ изображение НП FA-IHA. б , c Распределение размеров и дзета-потенциала НЧ FA-IHA в воде, клеточной среде и PBS. г Изменение размера НЧ FA-IHA в воде, клеточной среде и PBS. е Спектры поглощения свободных НЧ ICG, Arte и FA-IHA. е Спектры флуоресценции свободных НЧ ICG и FA-IHA

Благодаря сильному оптическому поглощению в ближнем инфракрасном диапазоне НЧ FA-IHA была проведена оценка фототермических свойств НЧ FA-IHA. Вода, свободный ICG и НЧ FA-IHA (с равной концентрацией ICG) облучали лазером с длиной волны 808 нм (1 Вт / см ² ). Температура наночастиц FA-IHA и свободного ICG увеличилась примерно на 36 ° C в течение 5 минут после облучения (рис. 3a), в то время как вода дала прирост температуры менее 4 ° C, демонстрируя, что наночастицы, содержащие ICG, обладают значительным фототермическим воздействием. эффект и потенциал для лечения рака. Кроме того, Дополнительный файл 1:На рисунке S1 показаны кривые фототермического нагрева НЧ FA-IHA при 5-минутном облучении лазером 808 нм с мощностью 0,5, 1 и 1,5 Вт / см ² , что означает, что оптимальная интенсивность лазерного излучения составляет 1 Вт / см ² . Проведены испытания на фотостабильность НЧ FA-IHA и свободного ICG. Свободный ICG показал значительное снижение температуры после пяти циклов по сравнению с НЧ FA-IHA (рис. 3b). На рисунке 3c показано изменение интенсивности поглощения свободных НЧ ICG и FA-IHA до и после пяти циклов БИК-облучения (808 нм, 1 Вт / см ² ). Результаты свидетельствуют о том, что интенсивность поглощения при 808 нм свободного ICG снижалась после пяти циклов облучения NIR, в то время как НЧ FA-IHA сохраняли первоначальную интенсивность поглощения. Кроме того, мы сравнили стабильность флуоресценции свободных НЧ ICG и FA-IHA (рис. 3d). После 30 дней хранения при 4 ° C интенсивность флуоресценции НЧ FA-IHA при 800 нм составляла 0,72 по сравнению с исходной интенсивностью 1, в то время как флуоресценция свободного ICG упала до 0,12 по сравнению с исходной интенсивностью из-за индуцированной агрегацией -обесцвечивание [36]. Эти результаты показали, что ковалентно конъюгированный ICG был более стабильным, чем свободный ICG, вероятно, из-за самосборки HSA и PEG, защищающих ICG от агрегации, вызванной внутренней средой, такой как тепло или свет. Таким образом, эти результаты свидетельствуют о том, что НЧ FA-IHA обладают превосходным фототермическим эффектом и фототермической стабильностью.

а Кривые фототермического нагрева воды, ICG и НЧ FA-IHA при 5-минутном облучении лазером 808 нм (1 Вт / см ² ). б Температурные колебания НЧ ICG и FA-IHA после непрерывного 5-минутного облучения лазером с длиной волны 808 нм в течение 5 циклов. c Изменение поглощения НЧ FA-IHA при 780 нм до и после облучения лазером 808 нм NIR в течение 5 циклов. г Изменение флуоресценции НЧ ICG и FA-IHA за 30 дней

Затем использовали зонд, специфичный для АФК 1,3-дифенилизобензофуран (DPBF), для обнаружения продукции АФК НЧ FA-IHA после БИК-облучения. Как показано на рис. 4а, НЧ FA-IHA продуцировали значительное количество АФК (0,58 при стандартной абсорбции) в течение 5 минут после облучения NIR по сравнению со свободной ICG (0,35), что можно отнести к комбинированной терапии НЧ FA-IHA. / P>

а Нормализованное поглощение DPBF в присутствии ICG, НЧ FA-IHA и холостого образца при лазерном облучении 808 нм (1 Вт / см ² ). б Кинетика высвобождения Arte из НЧ FA-IHA при pH =7,4 и pH =6,5 с или без облучения лазером NIR, соответственно

При облучении лазером NIR (808 нм, 1 Вт / см ² ) и pH, были исследованы характеристики высвобождения (рис. 4b). Напротив, без БИК-облучения НЧ FA-IHA показали 11,61% и 34,2% высвобождения Arte при pH 7,4 и pH 6,5, соответственно, в то время как при шестикратном облучении БИК НЧ FA-IHA показали в общей сложности 68,4% высвобождения Arte при pH. pH 6,5, предполагая, что NIR-облучение и кислотные условия могут значительно вызвать высвобождение Arte из НЧ FA-IHA. БИК-облучение и высвобождение лекарственного средства, чувствительного к кислоте, вероятно, были вызваны тепловым расширением наночастиц HSA и, кроме того, в кислой среде H ⁺ может изменить поверхностный заряд HSA, что изменит гидрофильный / гидрофобный баланс наночастиц [37, 38].

Поглощение клеток и обнаружение внутриклеточных АФК

Благодаря свойствам флуоресценции ICG, поглощение НЧ FA-IHA непосредственно наблюдалось в клетках HepG2 с помощью флуоресцентного микроскопа. Как показано на фиг. 5а, после обработки клеток НЧ FA-IHA цитоплазма показала более сильную красную флуоресценцию ICG, чем наблюдаемая в клетках, обработанных свободными НЧ ICG и IHA. Кроме того, коэффициент поглощения клетками НЧ FA-IHA был определен FCM как 52,3%, что было выше, чем у НЧ IHA (25,2%) и свободного ICG (3,9%) (рис. 5b). Результаты показали, что конъюгированные FA способствовали нацеливанию наночастиц на рецепторы FA на опухолевые клетки и, таким образом, увеличивали поглощение клетками НЧ FA-IHA [39, 40, 41].

а Конфокальные флуоресцентные изображения клеток HepG2 после инкубации со свободными НЧ ICG и IHA, а также НЧ FA-IHA. Красный и синий цвета представляют собой ICG-флуоресценцию и ядра клеток, окрашенных DAPI, соответственно. б Измерение интенсивности флуоресценции ICG в клетках HepG2 с помощью проточной цитометрии после инкубации со свободными НЧ ICG и IHA и НЧ FA-IHA

Используя флуоресцентный микроскоп, мы наблюдали собственную фотодинамическую активность клеток, обработанных НЧ Arte-, ICG- и FA-IHA, с или без БИК-излучения. Зонд 2,7-дихлородигидрофлуоресцеина диацетат ROS использовали для визуализации продукции ROS в клетках. Результаты показали, что НЧ FA-IHA могут вызывать значительно увеличенную продукцию ROS по сравнению с другими образцами после 5 мин облучения NIR (рис. 6a). Соответствующие значения флуоресценции показаны на рис. 6b.

а Флуоресцентные изображения продукции ROS в раковых клетках, обработанных различными лекарствами, и b соответствующая интенсивность флуоресценции:(1) PBS, (2) Arte, (3) НЧ FA-HA, (4) свободный ICG + NIR, (5) НЧ IHA + NIR и (6) НЧ FA-IHA + NIR

Комбинированная фотохимиотерапия опухолей in vitro

На рисунке 7a показано изменение температуры клеток, обработанных PBS, свободным ICG, IHA NPs и FA-IHA NPs (с равной концентрацией ICG) после 5 мин облучения NIR (1,0 Вт / см 2 ). Температура клеток, обработанных НЧ FA-IHA, показала наибольшее повышение ( ΔT =31 ° C) по сравнению с клетками, обработанными PBS, свободным ICG и IHA NP. Жизнеспособность клеток, обработанных Arte, НЧ IHA и НЧ FA-IHA в различных концентрациях в течение 24 ч без облучения NIR, снижалась с увеличением концентрации, тогда как свободный ICG при этих концентрациях не проявлял какой-либо цитотоксичности (рис. 7b). Между тем, НЧ FA-IH-носитель лекарственного средства (НЧ FA-IHA без Arte) также не проявили значительной цитотоксичности (дополнительный файл 1:Рисунок S2). Напротив, после облучения NIR (1,0 Вт / см ² , 5 мин), значительная зависимая от концентрации гибель клеток наблюдалась в клетках, обработанных свободным ICG, НЧ IHA и НЧ FA-IHA (рис. 7c). Эффект был особенно значительным в клетках, обработанных НЧ FA-IHA. Превосходный противоопухолевый эффект может быть объяснен направленной комбинационной фотохимиотерапией, такой как химиотерапевтический эффект высвобожденного Arte и терапевтический эффект PTT-PDT ICG. Кроме того, цитотоксичность НЧ FA-IHA с или без БИК-облучения исследовали с помощью двойного окрашивания кальцеином-AM / PI. Клетки, обработанные НЧ FA-IHA и облучение, были почти полностью мертвыми по сравнению с другими обработанными группами (рис. 7d).

а Кривые изменения температуры клеток, обработанных PBS, свободным ICG, IHA NPs и FA-IHA NPs, в 96-луночных планшетах после 5 минут NIR-облучения. б, в Жизнеспособность клеток, обработанных свободным ICG, Arte, НЧ IHA и НЧ FA-IHA без или с лазерным облучением 808 нм (5 мин, 1 Вт / см ² ), соответственно. г Изображения клеток с двойным окрашиванием кальцием AM / PI после обработки PBS (контроль), PBS + NIR, НЧ FA-IHA и НЧ FA-IHA + NIR, соответственно

Визуализация флуоресценции in vivo

Как показано на фиг. 8а и b, через 0,1 ч после инъекции свободных ICG, НЧ IHA и НЧ FA-IHA, сильный сигнал флуоресценции можно было увидеть во всем теле мышей с опухолью. Сигналы флуоресценции увеличивались в области опухоли с увеличением времени, достигая пика через 24 часа после инъекции. Сигналы флуоресценции опухоли в группе НЧ FA-IHA были самыми высокими по сравнению с таковыми в группах НЧ ICG и IHA во всех тестируемых точках (рис. 8b), что указывает на то, что НЧ FA-IHA могут сильно накапливаться в области опухоли за счет FA. -индуцированный направленный на опухоль эффект. Кроме того, биораспределение в основных тканях, включая сердце, печень, селезенку, легкие и почки, было проведено количественным анализом флуоресценции ex vivo через 24 часа после инъекции. Во всех тестируемых группах в ткани печени были обнаружены сильные сигналы флуоресценции (фиг. 8c), что указывает на то, что основное метаболическое превращение этих соединений происходит по печеночному пути. Эти результаты продемонстрировали, что НЧ FA-IHA могут избирательно накапливаться в опухолях in vivo, вероятно, за счет нацеленного на FA эффекта [37].

а Типичные флуоресцентные изображения мышей с опухолями после инъекции в хвостовую вену свободных ICG, IHA NP и FA-RIPNP. Черными пунктирными кружками обозначена область опухоли. б Количественный анализ in vivo сигнала флуоресценции в областях опухоли мышей, получавших свободный ICG, НЧ IHA и НЧ FA-IHA, в зависимости от времени инъекции. c Сигнал флуоресценции основных органов, включая сердце, печень, селезенку, легкие и почки

Комбинированная фотохимиотерапия опухолей in vivo

Как показано на фиг. 9a и b, температура опухоли у мышей с опухолью после обработки PBS, свободной ICG, НЧ IHA и НЧ FA-IHA через 24 часа после инъекции при 5-минутном облучении NIR (1 Вт / см ² ) был записан тепловизором. Приблизительное увеличение области опухоли на 22,1 ° C было обнаружено в группе, обработанной НЧ FA-IHA, что было самым высоким, чем у других групп. После двух циклов NIR-облучения (день 0 и день 2) в группе FA-IHA NPs + NIR наблюдалось значительное подавление роста опухоли без рецидива (фиг. 9c), в то время как группы, получавшие PBS, Arte, FA-IHA NPs, PBS + NIR, ICG + NIR и IHA NPs + NIR не показали четких указаний на супрессию опухоли. Кроме того, через 90 дней мыши в группе НЧ FA-IHA + NIR показали 100% выживаемость (фиг. 9d). Эти результаты показывают, что НЧ FA-IHA с БИК-облучением обладали превосходной терапевтической эффективностью против опухолей in vivo, вероятно, благодаря активной таргетной и комбинированной фотохимиотерапии.

а Температура области опухоли у мышей с опухолью после инъекции в хвостовую вену PBS, ICG, IHA NP и FA-RIPNP через 24 часа при 5-минутном облучении NIR (808 нм, 1 Вт / см ² ). б Тепловые изображения мышей с опухолями после инъекции в хвостовую вену PBS, ICG, IHA NP и FA-RIPNP через 24 часа при 5-минутном облучении NIR (808 нм, 1 Вт / см ² ). c Профиль роста опухолей ксенотрансплантата HepG2 после внутривенной инъекции PBS, Arte, ICG, IHA NP и FA-RIPNP с или без 5-минутного БИК-облучения (808 нм, 1 Вт / см ² ). г Выживаемость мышей с опухолью после инъекции в хвостовую вену PBS, свободного Arte, ICG, IHA NP и FA-RIPNP с или без 5-минутного БИК-облучения (808 нм, 1 Вт / см ² )

Наконец, окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) использовали для оценки токсичности НЧ FA-IHA. На изображениях сечения не было обнаружено значительных гистологических поражений по сравнению с группой, получавшей PBS (рис.10), что указывает на то, что НЧ FA-IHA обладали незначительной токсичностью, что, вероятно, было связано с безопасностью ингредиентов НЧ FA-IHA, что, таким образом, было полезно для их будущее использование в клинической практике.

Окрашенные H и E срезы тканей основных органов, включая сердце, печень, селезенку, легкие и почки, от мышей, получавших PBS и НЧ FA-IHA

Выводы

В заключение был приготовлен многофункциональный тераностический агент, ковалентно конъюгирующий FA и ICG и инкапсулирующий Arte для направленной на визуализацию комбинированной фотохимиотерапии in vitro и in vivo. Приготовленные НЧ FA-IHA показали отличную коллоидную и термостабильность, а также свойство флуоресценции. При облучении NIR НЧ FA-IHA показали большой фототермический эффект, который мог запускать высвобождение Arte и производить гораздо больше ROS после облучения NIR, чем свободный ICG, который демонстрировал фотодинамические характеристики. Конъюгированные ЖК способствовали высокоэффективному захвату клетками и накоплению опухолей in vitro и in vivo. Более того, высокоэффективная противоопухолевая эффективность НЧ FA-IHA в сочетании с термальной лекарственной химиотерапией с активным направлением действия, такой как терапия PTT-PDT, была продемонстрирована in vitro и in vivo. В целом полученные результаты показали, что НЧ FA-IHA могут быть многообещающей системой, нацеленной на опухоль, пригодной для будущих применений в наномедицине.

Сокращения

Arte:

Артесунат

FA:

Фолиевая кислота

HSA:

Сывороточный альбумин человека

ICG:

Индоцианин зеленый

NIR:

Ближний инфракрасный порт

PDT:

Фотодинамическая терапия

PEG:

Полиэтиленгликоль

PTT:

Фототермическая терапия