Каркасы nHAC / PLGA, гибридизированные с оксидом графена, способствуют пролиферации клеток MC3T3-E1

Фон

Инженерия костной ткани, сочетающая трехмерные пористые каркасы и костные клетки, широко изучалась как привлекательный подход в лечении неисправной или утраченной ткани [1]. Биоразлагаемые каркасы, имитирующие природу кости, играют важную роль в размещении клеток, контроле клеточной адгезии и пролиферации и облегчении регенерации кости [2]. До сих пор для изготовления различных трехмерных (3D) пористых структур применялись различные методы, включая электроспиннинг, интеграцию проектирования вычислительной топологии (CTD) и изготовление твердых тел произвольной формы (SFF), а также сублимационную сушку [3,4,5 , 6,7]. Электропрядение позволяет изготавливать нановолоконные или микроволокнистые каркасы со сложной структурой (выровненные, пружинные волокна) и составами [7]. Однако эффективность его производства немного невысока. Интеграция CTD и SFF позволяет проектировать трехмерные анатомические каркасы с пористой архитектурой и лучшими механическими свойствами. Но этот метод требует сильных профессиональных знаний [4]. По сравнению с этими двумя методами метод сублимационной сушки позволяет изготавливать пористые структуры с помощью гораздо более простого процесса путем сублимации замороженной жидкой фазы под вакуумом для изготовления пористой структуры [8].

Природные кости обладают сложной иерархической архитектурой с двумя основными компонентами, коллагеном и гидроксиапатитом [9,10,11]. В инженерии костной ткани создание идеальной биомимикрии внеклеточного матрикса кости, способствующей адгезии и пролиферации клеток для лечения нарушений, все еще остается проблемой [12]. Биоразлагаемые каркасы на основе наногидроксиапатита / коллагена (nHAC), имитирующие естественную кость, могут обеспечить лучшую биосовместимость, сродство к клеткам и биорезорбируемость [13]. Однако недостатки коллагена, включая плохие механические свойства и способность к быстрой деградации, остаются препятствием для его применения в инженерии костной ткани [14]. Биоразлагаемые алифатические полимеры, такие как сополимер молочно-гликолевой кислоты (PLGA), с высокой механической прочностью, выдающейся биосовместимостью, биоразлагаемостью и хорошей растворимостью в органических растворителях, являются идеальным компенсированным материалом, создающим трехмерные пористые каркасы для инженерии костной ткани [15 , 16]. Гибридный пористый каркас, содержащий коллаген и синтетические полимеры, сочетает в себе преимущества коллагена и полимеров и преодолевает их недостатки, что широко используется для восстановления и регенерации костей [17,18,19]. Например, Liao et al. разработали костный каркас, приготовленный из nHAC и поли (молочной кислоты) (PLA), чтобы способствовать регенерации кости [17]. Niu et al. изготовили композитные каркасы микросфер nHAC / поли (L-молочная кислота) / хитозан для усиления пролиферации остеобластов [19].

В последнее время оксид графена (GO), новый углеродный лист толщиной в один атом [20, 21], вызвал большой интерес в области биологии, поскольку он обладает хорошей биосовместимостью. Гибридизированные каркасы GO способны улучшать как механические свойства каркаса, так и поведение клеток, такое как распространение и пролиферация клеток [22, 23]. Луо и др. сообщили, что включение ГО в нановолокно PLGA усиливает пролиферацию и остеогенную дифференцировку мезенхимальных стволовых клеток (МСК) [20]. Jing et al. сообщили, что добавление 1,0 мас.% ГО в термопластичный полиуретан может способствовать пролиферации клеток фибробластов швейцарских мышей [24]. По сравнению с добавлением химических сшивающих агентов (генипин, глутаральдегид, карбодиимид и т. Д. . ) [25, 26], обладающих определенной цитотоксичностью, для улучшения механических свойств композитных каркасов небольшое количество гибридизированных с ГО каркасов демонстрирует хорошую биосовместимость. Следовательно, гибридизация GO и nHAC / PLGA может стать новым искусственным каркасом для костных тканей.

В этом исследовании пористые каркасы наногидроксиапатит / коллаген / поли (молочная и гликолевая кислота) / оксид графена (nHAC / PLGA / GO), которые содержат различное массовое соотношение ГО (0,0, 0,5, 1,0 и 1,5 мас. %) были изготовлены и охарактеризованы. Каркас гибридизации показывает пористую структуру. Добавление GO изменяет гидрофильные свойства и механические свойства гибридизационных каркасов. Чтобы исследовать влияние каркаса nHAC / PLGA / GO на инженерию костной ткани, клетки MC3T3-E1 культивировали на пористых каркасах гибридизации. Результаты показывают, что гибридизационные каркасы, легированные 1,5 мас.% GO, способствуют адгезии, росту и пролиферации клеток, что дополнительно указывает на то, что каркас nHAC / PLGA / GO может рассматриваться как многообещающий кандидат в инженерии костной ткани.

Результаты и обсуждение

Структура составных каркасов nHAC / PLGA / GO

На рисунке 1 показан процесс изготовления каркасов nHAC / PLGA / GO. Детали процесса изготовления показаны в экспериментальной части. NHAC был синтезирован до изготовления композитных каркасов nHAC / PLGA / GO. Изображение порошка nHAC, полученное с помощью сканирующего электронного микроскопа (SEM), показывает его наноструктуру. Также показаны соответствующие спектры энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии (EDS) nHAC (дополнительный файл 1:рисунок S1), которые показывают присутствие Ca, Cu, P, C и O. Сигналы меди должны быть вкладом подтверждающие образцы. Таким образом, nHAC состоит из Ca, P, C, O, и молярное отношение Ca:P порошка nHAC составляет 1,41, что ниже, чем у гидроксиапатита (HA) (1,66). Это указывает на то, что синтезированная ГК относится к типу дефицита кальция [27], что приведет к снижению твердости, модуля упругости и ударной вязкости в nHAC. Для повышения механических свойств композитного каркаса в порошок nHAC добавляли PLGA и GO. Оптический обзор изготовленных каркасов nHAC / PLGA / GO с различным количеством GO показан на рис. 2а. Образец представляет собой цилиндр диаметром 14 мм. Видно, что композитные каркасы без ГО имеют белый цвет. По мере увеличения ГО композитные леса становятся все более темными. Подробная морфология различных каркасов nHAC / PLGA / GO выявляется с помощью SEM (Fig. 2b-e). Это существенно показывает, что все каркасы образуют пористые структуры, а поверхности четырех разных каркасов довольно шероховатые. Чтобы получить характеристику информации об этих отверстиях, мы использовали автоматический измеритель площади поверхности и пористости. Результаты распределения отверстий показаны на рис. 2е. Размер четырех отверстий каркаса составляет от 0 до 200 нм. И количество отверстий на десятки нанометров больше, чем на несколько сотен нанометров в четырех каркасах. Сообщалось, что пористость каркасов биоматериалов нетривиальна для формирования кости in vitro и in vivo [28]. Для оптимизации интеграции в окружающие ткани каркасы для остеогенеза должны имитировать морфологию, структуру и функцию кости [4]. Таким образом, трехмерная пористая структура композитных каркасов nHAC / PLGA / GO имеет решающее значение для регенерации кости. Также показаны крупномасштабные СЭМ-изображения четырех композитных каркасов (дополнительный файл 1:Рисунок S2), которые иллюстрируют обзорные структуры различных поверхностей.

Принципиальная схема процесса изготовления каркасов nHAC / PLGA / GO

а Оптическое изображение синтезированных скаффолдов nHAC / PLGA / GO с различным количеством GO. б - е СЭМ-изображения b nHAC / PLGA, c nHAC / PLGA / GO (0,5 мас.%), d nHAC / PLGA / GO (1,0 мас.%) и e Матрицы nHAC / PLGA / GO (1,5 мас.%). е Распределение отверстий nHAC / PLGA / GO (0, 0,5, 1,0 и 1,5 мас.%)

Физико-химические и механические характеристики композитных каркасов nHAC / PLGA / GO

Механизм процесса синтеза может быть выявлен с помощью спектров рентгеновской дифракции (XRD) и инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (FT-IR) различных отдельных веществ и композитов (рис. 3). Как показано на рис. 3a, неорганическая фаза была определена как HA согласно файлу порошковой дифракции (карточка PDF № 09–0432), поскольку на рентгенограмме не присутствовали пики от других материалов Ca-P. По сравнению с nHA расширенные дифракционные пики nHAC предполагают малый размер зерна и низкую кристалличность. Подобно nHAC, структура nHAC / PLGA / GO с различным количеством GO также имела низкую кристалличность. Однако пик GO не появлялся в композитах nHAC / PLGA / GO, что могло быть связано с небольшим количеством GO по сравнению с основной массой. На рис. 3b показаны ИК-Фурье спектры различных отдельных веществ и композитов. На рис. 3b можно наблюдать типичные полосы для коллагена, такие как растяжение N – H при 3336 см ⁻¹ . для амида А; C – H растяжение при 3079 см ⁻¹ для амида B; C =O при растяжении на 1656 см ⁻¹ для амида I; Деформация N – H при 1548 см ⁻¹ для амида II и пика поглощения при 1238 см ⁻¹ для амида III. По мере образования nHAC амид A перемещается от 3336 см ^-1 примерно до 3411 см ⁻¹ , амид B был ослаблен, амид I, амид II, амид III сдвинулись с 1656, 1548 и 1238 см ^-1 до 1654, 1542 и 1240 см ⁻¹ , соответственно. Таким образом, это подтверждает химическую реакцию между коллагеном и ГК. Кроме того, пики на 1033, 601 и 563 см ⁻¹ типичные пики для (PO4) ³⁻ группа, которая указывает на новое образование HA на коллагене из-за того, что продаваемый HA имеет только характерные пики (PO4) ^3- при 1033, 603 и 565 см ⁻¹ . Характерные пики PLGA около 2996 и 2944 см ^-1 были назначены -CH ₂ , 1752 см ⁻¹ было присвоено C =O, 1183 и 1093 см ^-1 были отнесены к C – O, отчетливо видны. По сравнению с каркасом PLGA пики каркаса nHAC / PLGA смещаются с 1752 до 1183 см ^-1 до 1760 и 1187 см ⁻¹ соответственно, которые демонстрируют химическую реакцию между PLGA и nHAC power. По сравнению с каркасами nHAC / PLGA пики каркасов nHAC / PLGA, допированных GO, сместились с 1760 до 1762 см ^-1 ; произошло красное смещение, которое демонстрирует химическую реакцию между GO и nHAC / PLGA.

а XRD и b ИК-Фурье спектры различных компонентов

Наноструктура и механические свойства матриксов nHAC / PLGA / GO с различным количеством GO были охарактеризованы с помощью количественного наномеханического атомно-силового микроскопа (QNM-AFM) [29,30,31,32,33,34], который может самопроизвольно обеспечивает морфологию и жесткость и широко используется для определения механических свойств различных материалов, включая кость [30], зубы [35], роговицу [36] и т. д. На рис. 4a – d показана томография четырех видов композитов. строительные леса. Из-за ограниченности областей сканирования изображения АСМ показывают только локальную структуру поверхности. Таким образом, пористая структура не очевидна. Однако изображения АСМ также показывают шероховатую морфологию поверхности, аналогичную изображениям СЭМ. Шероховатость оказывает важное влияние на пролиферацию и дифференцировку клеток. Шероховатая поверхность способствует пролиферации и дифференцировке клеток [37,38,39]. Профили линий (рис. 4e – h), полученные на основе морфологии (рис. 4a – d), показывают только максимальные перепады высот при разных направлениях линий. Хорошо видно, что максимальные перепады высот составляют от ~ 200 до ~ 600 нм. Соответствующее распределение жесткости (рис. 4i) показывает, что модуль Юнга четырех различных каркасов составляет 7,53 ± 1,25, 8,34 ± 1,00, 9,15 ± 0,85 и 10,20 ± 1,28 ГПа, соответственно. Чтобы наглядно показать разницу в жесткости, также дана соответствующая гистограмма (рис. 4j). Хотя модуль Юнга каркасов nHAC / PLGA / GO с небольшой разницей в количестве GO существенно не отличается, например, nHAC / PLGA / GO с содержанием GO 0,0 и 0,5 мас.% (7,53 ± 1,25 и 8,34 ± 1,00%). ГПа), 0,5 и 1,0 мас.% (8,34 ± 1,00 и 9,15 ± 0,85 ГПа), 1,0 и 1,5 мас.% (9,15 ± 0,85 и 10,20 ± 1,28 ГПа), модуль Юнга матриксов nHAC / PLGA / GO с немного большая разница в количестве GO (0,0 мас.% и 1,5 мас.%) существенно различаются (7,53 ± 1,25 и 10,20 ± 1,28 ГПа). Это указывает на то, что механические свойства каркаса nHAC / PLGA / GO увеличиваются с увеличением количества GO.

Изображения a , полученные с помощью АСМ nHAC / PLGA, b nHAC / PLGA / GO (0,5 мас.%), c nHAC / PLGA / GO (1,0 мас.%) и d Матрицы nHAC / PLGA / GO (1,5 мас.%). е - ч Профили линий, полученные из изображений морфологии. я Распределение жесткости четырех различных каркасов, измеренное с помощью QNM-AFM. j Гистограмма модуля Юнга в зависимости от количества GO. к Соответствующие углы смачивания четырех видов каркасов, измеренные методом лежащей капли

Гидрофильность каркасов играет ключевую роль во взаимодействии с клетками. Добавление GO не только увеличивает механические свойства композитных каркасов, но также изменяет гидрофобность четырех видов каркасов. На рис. 4f показаны углы смачивания различных каркасов nHAC / PLGA / GO. Углы смачивания каркасов nHAC / PLGA составляли ~ 125,1 °, в то время как для nHAC / PLGA / GO с различным количеством GO (0,5, 1,0 и 1,5 мас.%) Составляли ~ 113,4 °, ~ 103,4 ° и ~ 101,4 ° соответственно. По мере увеличения количества GO краевые углы композитных каркасов немного уменьшаются из-за наличия как гидроксильных групп, так и отрицательно заряженных групп, таких как группы карбоновой кислоты на поверхности GO [40]. Таким образом, GO может обеспечить замечательную биоактивность каркасов 3D nHAC / PLGA.

В целом, каркасы для тканевой инженерии требуют не только наличия биосовместимой морфологии и свойств, но также пористой структуры и физической прочности [41]. Лиофилизированные каркасы 3D nHAC / PLGA / GO обладают пористой структурой из-за сублимации растворителя. Функциональные группы, включая гидроксильные (OH), эпоксидные (C-O-C) и карбоксильные (COOH) разновидности на поверхностях каркасов [40], вызывают хорошую гидрофильность. Добавление PLGA и GO обеспечивает достаточную физическую силу. Таким образом, каркасы 3D nHAC / PLGA / GO могут быть многообещающим кандидатом для тканевой инженерии.

Культура клеток

Хорошо известно, что каркасы, используемые для костной ткани, должны быть биосовместимыми, пролиферативными и исключать иммунный ответ [21]. NHAC / PLGA / GO, который содержит компоненты натуральной кости (коллаген и HA) и обладает подходящими механическими свойствами и гидрофильностью, должен быть идеальным кандидатом для инженерии костной ткани. Для исследования клеточной пролиферации этих каркасов в этой работе культивировали клетки остеобластов MC3T3-E1. На Фигуре 5 показана зависимость жизнеспособности клеток от времени культивирования, оцененная с помощью набора для подсчета клеток 8 (CCK-8). Размножение клеток постоянно увеличивалось в течение всего периода культивирования для всех групп. Более конкретно, пролиферация клеток MC3T3-E1 на каркасах nHAC / PLGA / GO (0,5 и 1,0 мас.%) Значительно снижается в день 1, в то время как пролиферация клеток на каркасах nHAC / PLGA / GO (1,5 мас.%) Аналогична таковой на каркасах Каркасы nHAC / PLGA. По мере увеличения времени пролиферация клеток MC3T3-E1 на каркасах nHAC / PLGA / GO (1,5 мас.%) Значительно увеличивается на 3, 5 и 7. Однако пролиферация клеток MC3T3-E1 на nHAC / PLGA / GO. (0,5 и 1,0 вес.%) Каркасы существенно не отличаются от каркасов nHAC / PLGA.

Сравнение клеток MC3T3-E1 на разных поверхностях каркасов; двойные звездочки обозначают p <0,01, количество образцов N =4

Доказательства клеточного роста, пролиферации на различных каркасах также фиксировались с помощью SEM. На Фигуре 6 показана морфология поверхности клеток остеобластов на четырех различных каркасах после культивирования в течение 1, 3, 5, 7 дней соответственно. В день 1 все клетки равномерно и изолированно распределяются на четырех разных каркасах. Со временем (дни 3, 5 и 7) все группы клеток растут, пролиферируют и начинают интегрироваться на разных каркасах, образуя большой слой клеток. По сравнению с морфологией клеток на различных каркасах, клетки на поверхностях каркасов nHAC / PLGA / GO были намного больше и растянуты, чем на поверхности каркасов nHAC / PLGA. Нет существенной разницы в ситуации распространения клеток, адгезии между клетками на nHAC / PLGA / GO с разным количеством (0,5, 1,0 и 1,5 мас.%) Согласно изображениям SEM.

а - п СЭМ-изображения клеток MC3T3-E1, культивированных на четырех различных каркасах в течение 1, 3, 5 и 7 дней. Масштабные полосы на всех изображениях составляют 50 мкм. Белая звездочка представляет клетки остеобластов MC3T3-E1

Тест на цитотоксичность

Цитотоксичность ГО является важной проблемой для его применения в области биологии. Итак, мы оцениваем цитотоксичность четырех каркасов в течение 24 часов. Результаты показаны на рис. 7. Жизнеспособность клеток фибробластов (NIH-3T3) в nHAC / PLGA, содержащих 0,5,1, и 1,5% GO составляет 99,101,11, и 97,86% относятся к nHAC / PLGA, которые не имеют значимой разницы. чем nHAC / PLGA, что указывает на безопасное увеличение содержания оксида графена на уровне 0–1,5%.

Относительная активность клеток HIH-373 в nHAC / PLGA (0,5, 1, 1,5 мас.%) Относится к nHAC / PLGA

В таблице 1 обобщены механические свойства и свойства клеточных культур четырех видов композитных каркасов. По мере увеличения GO соответственно увеличивается модуль Юнга каркасов. Однако четко различаются только механические свойства nHAC / PLGA и nHAC / PLGA / GO (1,5 мас.%). Жизнеспособность клеток четырех видов каркасов демонстрирует ту же тенденцию, что и механические свойства, то есть значения OD всех групп увеличиваются с увеличением времени культивирования клеток, но только nHAC / PLGA и nHAC / PLGA / GO (1,5 мас. %) группы показывают значительную разницу. Это указывает на то, что механические свойства каркасов тесно связаны со свойством культуры клеток. Результаты могут быть связаны с тем, что тканевые клетки могут чувствовать жесткость своих субстратов и реагировать на них [42,43,44,45]. Настройка механических свойств субстратов может способствовать клеточным ответам, влияющим на взаимодействия клеточной поверхности, наряду с ростом и жизнеспособностью клеток [46, 47, 48, 49]. Haugh et al. обнаружили, что жесткость каркасов увеличивает активность клеток MC3T3-E1 (пролиферацию и миграцию клеток) [50]. Энглер и др. продемонстрировали, что важным физическим фактором в реакции многих типов клеток является жесткость субстрата [51]. Они обнаружили, что гладкомышечные клетки, происходящие из аорты крысы (линия A7R5), как и другие зависимые от закрепления клетки, больше распространяются и организуют свой цитоскелет и очаговые адгезии на «жестких» субстратах, чем на «мягких». Механическое свойство влияет не только на поведение клеток, но и на активность тканей. Дункан и др. изучал механотрансдукцию и механическую деформацию функционального ответа на кости. Они обнаружили, что механическая нагрузка может ингибировать резорбцию кости и увеличивать образование кости in vivo [52]. Следовательно, самые жесткие каркасы nHAC / PLGA / GO (1,5 мас.%) Могут способствовать пролиферации клеток MC3T3-E1.

Цитотоксичность ГО является важной проблемой для его применения в области биологии. До сих пор возникло два аргумента. Одно из заявлений о том, что ГО может вызывать цитотоксичность, зависит от концентрации. Например, Чаттерджи и др. сообщили о токсической реакции с дифференциальной зависимостью от дозы для ГО [53]. Пинто и др. сообщили, что только низкие концентрации ГО могут быть безопасно включены в PLA для облегчения клеточной адгезии и пролиферации [6]. Другие утверждают, что даже большее количество ГО будет иметь хорошую биосовместимость и улучшит как механические свойства субстратов, так и поведение клеток. Шин и др. исследовали, что скелетные миобласты C2C12 были усилены на гибридных матрицах PLGA-GO-коллаген, чем на матрицах PLGA, PLGA-коллаген [54]. И Луо и др. сообщили, что каркасы из нановолокон PLGA, легированные GO, могут усиливать остеогенную дифференцировку МСК [22]. В этом исследовании GO был выбран на основе первого аргумента. Ограниченное количество добавлено в композитные каркасы для нецитотоксичности и улучшения механических свойств. Конъюгация ГО в каркасы nHAC / PLGA значительно усиливала рост и пролиферацию клеток. Хотя количество ячеек как в nHAC / PLGA, так и в nHAC / PLGA с небольшим количеством GO, например, nHAC / PLGA / GO (0,5 мас.%), Более или менее одинаково, количество ячеек в nHAC / PLGA / GO (1,5 мас.%) Каркас был выше, чем каркас nHAC / PLGA. Эти результаты указывают на то, что каркасы nHAC / PLGA / GO являются биофункциональными и способны усиливать рост и пролиферацию клеток MC3T3-E1. Таким образом, отличная биосовместимость и биофункциональность позволяют использовать nHAC / PLGA / GO в качестве эффективных каркасов для регенерации костей.

Природа биоматериала и процесс изготовления очень важны для свойств каркаса [28]. К настоящему времени биоматериалы были тщательно изучены, включая металлы [55], керамику [56], стекло [57], химически синтезированные полимеры [58], природные полимеры [59] и комбинации этих материалов для образования композитов [60]. . Изменение компонентов композитных каркасов вызовет свойство каркасов. Например, чтобы изготовить биомимический каркас из натуральной кости, в этом исследовании был использован коллаген I типа. В настоящее время семейство коллагенов включает более 20 различных типов коллагена, присутствующих в коже, костях, хрящах и т. Д. Заменяя коллаген типа I другими типами, можно изготавливать различные композитные каркасы для различных целей. Например, коллаген типа II является одним из коллагенов, образующих фибриллы, и преобладающим типом коллагена в хрящах. Координирование коллагена типа II в каркасе может способствовать регенерации хрящевой кости [61]. Кроме того, коллаген при правильном отжиге может дополнительно укрепить каркасы, что может создать новый композитный материал с функциональными структурами. Помимо природы биоматериалов, обработка также определяет функции каркасов, например, различные методы обработки. Химический состав и обработка материалов определяют максимальные функциональные свойства, а также то, как клетки взаимодействуют с каркасом. Каркасы свойств и требований в инженерии костной ткани были тщательно исследованы, включая деградацию [62], механические свойства [63], доставку цитокинов [64] и комбинации каркасов и клеток [65].

Выводы

Таким образом, каркасы nHAC / PLGA / GO с различным количеством GO (0,0, 0,5, 1,0 и 1,5 мас.%) Были изготовлены методом сублимационной сушки. Изготовленные каркасы nHAC / PLGA / GO имеют пористую структуру. Кроме того, механические свойства и гидрофильность каркасов улучшаются за счет добавления PLGA и GO. Исследование in vitro показывает, что пористые каркасы способствуют адсорбции, росту и пролиферации клеток. Эти каркасы nHAC / PLGA / GO могут быть многообещающим кандидатом для применения в костной ткани.

Методы

Материалы

Очищенный лиофилизированный коллаген типа 1 был получен от Tianjin Saining Biological Engineering Technology Co., Ltd. PLGA с соотношением лактид:гликолид 75:25 и Mw 95000 г / моль был приобретен у Shandong Medical Appliance Factory (Китай). GO был приобретен у Shanghai Aladdin biochemical Polytron Technologies Inc. Клетки остеобластов MC3T3-E1 были предоставлены банком клеток Шанхайской китайской академии наук. Фетальная бычья сыворотка (FBS), антибиотик-антимикотик, CCK-8 и среда Eagle, модифицированная Дульбекко (DMEM), были получены от Tianjin Nobuo Letter Technology Co., Ltd. 1,4-диоксан, фосфатно-солевой буфер (PBS, 0,1 M, PH 7,4), а все другие химические вещества были аналитической чистоты и использовались в том виде, в котором они были получены, без дополнительной очистки.

Подготовка композитных каркасов nHAC Power и nHAC / PLGA / GO

О способе составления порошка nHAC сообщалось ранее [66,67,68]. Вкратце, коллаген растворяли в уксусной кислоте (0,5 моль / л), получая раствор с концентрацией 4 г / л. CaCl ₂ и H ₃ ЗП ₄ (Ca / P =1.66) растворы добавляли отдельно по каплям. Скорость капания - 100 капель в минуту. Раствор осторожно перемешивали и титровали при 37 ° C раствором аммиака до pH 9. Через 24 часа отложения nHAC собирали центрифугированием и сублимационной сушкой. Для приготовления композитных каркасов nHAC / PLGA / GO, GO был равномерно диспергирован в диоксане с использованием ультразвуковой дробилки клеток, с получением конечной концентрации 0,0, 0,5, 1,0 и 1,5 г / л соответственно. Затем PLGA добавляли к растворам GO, получая конечную концентрацию 10% (м / об). Затем растворы GO / PLGA осторожно перемешивали при комнатной температуре в течение 12 часов. Конечный раствор был сформирован путем добавления мощности nHAC к раствору GO / PLGA при массовом соотношении nHAC:PLGA 1:1. Образованный раствор nHAC / PLGA / GO затем перемешивали и обрабатывали ультразвуком в течение 4 часов. После замораживания при -20 ° C в течение ночи композитные каркасы nHAC / PLGA / GO получали лиофилизацией для удаления диоксана.

Характеристики

Композитные каркасы были покрыты золотом и наблюдались с помощью SEM (JSM-7100F). Мы распыляем золото в течение 20 с для подготовки образцов для электронной микроскопии. Топография и механические свойства матриц характеризовались методом атомно-силовой микроскопии (AFM, Multimode VIII, Bruker, Германия) на воздухе. Анализ изображений выполнялся с использованием программного обеспечения для анализа Gwyddion и Nanoscope. Композиционный анализ композитных каркасов nHAC / PLGA / GO выполняли с помощью ИК-Фурье спектрофотометра (VECTOR22, Bruker, Германия). Все спектры записаны в режиме поглощения в диапазоне длин волн 1000–2200 см ⁻¹ . с разрешением 4,0 см ⁻¹ и 16-кратное сканирование. Углы смачивания образцов измеряли с помощью системы измерения угла смачивания методом лежащей капли (EasyDrop, модель DAS30, Kruss, Германия). Картины XRD были измерены с использованием рентгеновского дифрактометра (D8 DISCOVER). Излучение Cu-Kα (λ =0,154 нм) составляет 40 кВ и 30 мА. Скорость сканирования измерений составляет 8 ° мин ⁻¹ в диапазоне 2θ от 5 до 80 ° при КТ. Пористость каркасов измерялась автоматическим анализатором площади поверхности и пористости (ASAP 2460, Micromeritics, Джорджия, США).

Культура клеток

Клетки остеобластов MC3T3-E1 инкубировали в среде DMEM с добавлением 10% FBS и 3% раствора антибиотика-антимикотика при 37 ° C и 5% CO ₂ в инкубаторе клеток. Первоначальное прикрепление и пролиферацию тестировали с использованием CCK-8 в соответствии с инструкциями производителя, в которых количество жизнеспособных клеток было прямо пропорционально продуктам метаболической реакции, полученным в анализе CCK-8 [69]. Вкратце, клетки остеобластов MC3T3-E1 высевали с плотностью 2,5 × 10 ⁴ . клеток на лунку на матрицах nHAC / PLGA, nHAC / PLGA / GO (0,5 мас.%), nHAC / PLGA / GO (1,0 мас.%) и nHAC / PLGA / GO (1,5 мас.%), встроенных в 48-луночную культуру клеток тарелка. Клетки инкубировали с раствором CCK-8 в последние 2 часа периодов культивирования (1, 3, 5 и 7 дней) для пролиферации при 37 ° C в темноте. Оптическую плотность измеряли при длине волны 450 нм с помощью ридера для ELISA (DNM-9602).

Образцы клеток для измерения с помощью SEM фиксировали формальдегидом, а затем образцы дегидратировали с помощью градиентной серии этанола (30, 50, 75, 95 и 100%) в течение 15 минут при каждой концентрации. Затем образцы сушили путем сушки до критической точки с помощью анализатора диоксида углерода (Hitachi, HCP-2). Finally, the samples with gold coating were observed by SEM.

Cytotoxicity Test

The fibroblasts cells concentration was adjusted to 1 × 10 ⁴ /ml and was inoculated into 96-well plates at 200 ul per well. Then, the well plates were incubated at 37 °C in a 5% CO₂ incubator for 24 h. The samples (nHAC/PLGA, nHAC/PLGA/GO (0.5 wt%), nHAC/PLGA/GO (1.0 wt%) and nHAC/PLGA/GO (1.5 wt%)) were powdered to make a 100 mg/ml suspension. The experiment group with 100 ul suspension and control group with equal volume of DMEM complete medium were incubated for 24 h and were further incubated for 4 h after the CCK-8 was added to the incubator. The cell viability was obtained by measuring the absorbance at the wavelength of 450 nm using an ELISA reader. The cell viability was calculated by using the following formula,

Where A (experiment) represents absorbance of wells with cells, CCK-8 solution and power samples solution; A (blank) represents absorbance of wells with medium and CCK-8 solution without cells and A (control) represents absorbance of wells with cells, CCK-8 solution without power samples solution.

Статистический анализ

Quantitative results were expressed as the mean value from at least triplicate samples ± standard deviation (SD). Student’s t test was used to the statistical analysis. A value of p  < 0.05 was considered statistically significant. Data are marked ** to indicate p  < <0.01.

Сокращения

3D:

Трехмерный

AFM:

Атомно-силовая микроскопия

CCK-8:

Cell counting kit-8

CTD:

Computational topology design

DMEM:

Dulbecco’s modified Eagle media

EDS:

X-ray spectroscopy

FBS:

Fetal bovine serum

FT-IR:

Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье

GO:

Graphene oxide

HA:

Hydroxyapatite

MC3T3-E1:

Osteoblast cells

MSCs:

Mesenchymal stem cells

nHAC:

Nano-hydroxyapatite/collagen

NIH-3T3:

Fibroblast cells

PBS:

Phosphate-buffered saline

PLA:

Poly(lactic acid)

PLGA:

poly(lactic-co-glycolic acid)

QNM-AFM:

Quantitative nano-mechanical atomic force microscope

SD:

Standard deviation

SEM:

Сканирующий электронный микроскоп

SFF:

Olid free-form fabrication

XRD:

Рентгеновская дифракция