Повышение противоопухолевой эффективности и фармакокинетики буфалина с помощью пегилированных липосом

Фон

Раковые заболевания имеют огромное глобальное значение, поскольку ежегодно увеличивающаяся популяция онкологических больных может вырасти вдвое к 2020 году [1]. Из-за наличия гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и множественной лекарственной устойчивости опухоль глиомы является одним из наиболее опасных для жизни заболеваний, при отсутствии эффективных терапевтических средств клинически [2]. Буфалин был выделен и идентифицирован из Venenum Bufonis , которые представляют собой секреты кожи и околоушных ядовитых желез жабы Bufo bufo гаргаризаны Кантора или Bufo melanostictus Шнайдер [3]. Сообщается, что он обладает сильными фармакологическими эффектами, включая кардиотоническое, противовирусное, иммунорегулирующее и особенно противоопухолевое действие [4,5,6,7]. Однако плохая растворимость затрудняет диспергирование в водном растворе и ограничивает возможности применения [8].

Липосомы рассматриваются как новая система доставки лекарств для улучшения плохой растворимости лекарств в водном растворе, повышения биодоступности, повышения терапевтической эффективности и уменьшения побочных эффектов [9]. В основном это может быть полезно для агентов, загруженных для прохождения через ГЭБ и доставки в мозг [10]. Однако одним из основных недостатков липосомальной композиции является ее быстрое выведение из крови из-за абсорбции белка плазмы фосфолипидной мембраной липосом, что впоследствии запускает распознавание и захват липосом мононуклеарной фагоцитарной системой. К счастью, когда полиэтиленгликоль (ПЭГ) модифицируется на поверхности липосом, этот вид фагоцитоза может протекать медленно. Следовательно, необходимо изучить нагруженные буфалином ПЭГилированные липосомы как липосомы с длительной циркуляцией, чтобы повысить их растворимость в воде и улучшить фармакокинетику [11].

На сегодняшний день исследованиям фармакокинетики буфалина еще не уделялось особого внимания. Некоторые отчеты сосредоточены только на фармакокинетике свободного буфалина в водном растворе per os. В настоящем исследовании мы разработали ПЭГилированные липосомы в качестве системы доставки буфалина и сравнили фармакокинетические различия между загруженными буфалином ПЭГилированными липосомами, загруженными буфалином липосомами и буфалиновым веществом в водном растворе при внутривенном введении крысам.

Методы

Химические вещества и реагенты

Буфалин (чистота ≥ 98%) был приобретен у BaoJi Chenguang Technology Development Co., Ltd. (Баоцзи, Шэньси, Китай). L-α-фосфатидилхолин, холестерин и 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N- [метокси (полиэтиленгликоль) -2000] (соль аммония; DSPE-PEG ₂₀₀₀ ) были приобретены у Sigma Chemical Co., Ltd. (Сент-Луис, Миссури, США) (молекулярные формулы этих веществ показаны в Дополнительном файле 1:Рисунок S1). Использованный ацетонитрил был спектроскопической чистоты и был закуплен в компании Honeywell (Америка). Хлороформ и спирт (аналитическая чистота) были приобретены у Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. (Китай). Все химические вещества были чистыми для аналитической или высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Вода была деионизирована с помощью системы очистки воды Millipore (Милфорд, Массачусетс, США) и профильтрована через мембрану 0,22 мкм.

Животные и клетки

Это исследование было проведено в строгом соответствии с рекомендациями Руководства по уходу и использованию лабораторных животных Национального института здоровья. Протокол был одобрен Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию Четвертого военно-медицинского университета (Шэньси, Китай) (утверждение 2015-1013-R). Все операции проводились под анестезией пентобарбиталом натрия, и были приложены все усилия, чтобы свести к минимуму страдания. Самцы крыс Sprague-Dawley, первоначально массой 250 ± 20 г, были получены из Четвертого военно-медицинского университета (Сиань, Китай). Клеточные линии SW620, PC-3, MDA-MB-231, A549, U251, U87 и HepG2 были соответственно приобретены в Shanghai Cell Bank или Центре экспериментальных животных Четвертого военного медицинского университета, культивированы в RPMI 1640 с добавлением 10% ( v / v ) фетальная бычья сыворотка (FBS) и 1% антибиотики (100 Ед / мл пенициллина G и 0,1 мг / мл стрептомицина). Клетки поддерживали в фазе экспоненциального роста в атмосфере 5% CO ₂ . и относительной влажности 90% при 37 ° C.

Синтез липосом, содержащих буфалин

Липосомы получали партиями объемом 10 мл с использованием гомогенизации под высоким давлением. Количество используемого буфалина было одинаковым для всех липосом. Вкратце, обычные липосомы, нагруженные буфалином, были приготовлены с композицией из буфалина, холестерина и L-α-фосфатидилхолина в молярном соотношении 10:30:60; Нагруженные буфалином ПЭГилированные липосомы были синтезированы с композицией буфалина, холестерина, L-α-фосфатидилхолина и DSPE-PEG ₂₀₀₀ в молярном соотношении 10:30:55:5 соответственно.

Вышеуказанные смеси фосфолипидов полностью диспергировали в 3 мл хлороформа, а затем хлороформ полностью улетучивали с помощью роторного испарителя при 50 ° C в условиях декомпрессии. Затем остаточный растворитель (если таковой имеется) сушили, помещая в вакуум-эксикатор на ночь, а затем приготовленную сухую тонкую пленку регидратировали, используя вортекс, в 10 мл предварительно нагретой до 50 ° C деионизированной воды с концентрацией фосфолипида 10 ммоль / мл в течение 15 мин. Образовавшуюся таким образом смесь дополнительно обрабатывали гомогенизацией под высоким давлением. Было оптимизировано давление и время гомогенизации, которые составили 500 бар при 35 ° C, и процесс был повторен 10 раз. Полученную суспензию липосом немедленно экструдировали с помощью экструдера Lipex (ATS, Канада) дважды с использованием поликарбонатных мембран (размер пор 0,2 мкм, Whatman, Maidstone, UK) с образованием однослойных липосом. Пустая липосомная суспензия была также приготовлена ​​тем же способом, что описана ранее, с исключением стадии добавления буфалина.

Характеристика липосом, содержащих буфалин

Размер частиц и дзета-потенциал

Размер частиц и дзета потенциал липосом определяли методом динамического светорассеяния с использованием дзета анализатор потенциала (Delsa ™ Nano, Beckman Coulter, Калифорния, США). Все липосомы буфалина были разбавлены фосфатно-солевым буфером (PBS) до подходящей концентрации перед определением распределения по размерам и zeta потенциал. Измерения проводились в полностью автоматическом режиме.

Просвечивающая электронная микроскопия высокого разрешения

Липосомы буфалина были дополнительно охарактеризованы с помощью просвечивающей электронной микроскопии высокого разрешения (HR-TEM). Суспензия липосом буфалина, нанесенная на медную сетку размером 300 меш, была отрицательно окрашена 1% ( w / v ) фосфорновольфрамовая кислота. Прямая визуализация морфологии была выполнена при ускоряющем напряжении 200 кВ с использованием ПЭМ (Hitachi H-7650, Токио, Япония).

Эффективность ловушки

Содержание буфалина анализировали методом ВЭЖХ. Система ВЭЖХ Shimadzu (Киото, Япония) была оснащена насосом LC-20AT, детектором с диодной матрицей SPO-M20A, термостатом колонок CTO-10AS VP и автосамплером SIL-10AF. Все разделения проводили на колонке SinoChrom ODS-BP C18 (250 мм × 4,6 мм, 5 мкм, Yillite) (Yillite, Далянь, Китай). Объем впрыска составлял 20 мкл, и выход из колонки контролировали при 296 нм. Данные были получены и обработаны с помощью программного обеспечения ClassVP. Подвижная фаза состояла из смеси ацетонитрил:0,1% дигидрофосфата калия (с фосфорной кислотой для доведения значения pH до 3,8) с градиентным элюированием (50:50, v / v ). Хроматографию проводили при скорости потока 1,0 мл / мин. Для определения эффективности захвата 1,0 мл липосомальной суспензии буфалина добавляли в колонку с Sephadex G50 и элюировали PBS. Голубоватую часть вытекающего потока собирали и доводили до 10,0 мл (конечный объем) путем добавления PBS. Сумма ( Вт ₁ ) буфалина в липосомальной суспензии определяли методом ВЭЖХ. PBS был добавлен в другую часть 1,0 мл липосомальной суспензии буфалина, чтобы достичь конечного объема до 10,0 мл, и количество ( W ₂ ) содержащегося буфалина определяли тем же способом. Процент буфалина, захваченного липосомами буфалина, рассчитывали по формуле:

Испытание стабильности in vitro

Эффективность улавливания проверена методом хроматографии на сефадексе, а размер частиц определен с помощью zeta анализатор потенциала применяли для оценки профиля стабильности после хранения при 4 ° C в дни 0, 7, 15, 30 и 90. В пять временных точек отсасывали 200 мкл суспензии липосом для определения степени липосомальной утечки. Сразу же свободный буфалин из 200 мкл суспензии липосом отделяли с помощью колоночной хроматографии на Sephadex G50 и количество свободного буфалина определяли методом ВЭЖХ. Коэффициент липосомальной утечки рассчитывали по формуле:

Высвобождение буфалина in vitro

Характеристики высвобождения буфалина из липосом in vitro оценивали с использованием методики диализного мешка при 37 ° C, как описано ранее с некоторыми изменениями. В качестве высвобождающей среды использовали PBS (pH =7,4), содержащий 10% фетальной телячьей сыворотки. Свободное лекарственное средство удаляли из липосом буфалина путем исчерпывающего диализа в течение 4 ч против буфера PBS при 4 ° C. Вкратце, 1,0 мл липосомальной суспензии буфалина переносили пипеткой в ​​диализную трубку (Spectrumlabs, США; MWCO 30 кДа) при легком горизонтальном встряхивании (120 об / мин) при комнатной температуре. Пробирку для диализа содержали в 50 мл PBS (pH =7,4), содержащем 10% эмбриональной телячьей сыворотки, и температуру поддерживали на уровне 37 ° C. Диализат извлекали из среды и заменяли равным объемом свежего PBS в разное время, а именно. часов 0, 0,5, 1, 2, 4, 6, 12, 24 и 48. Концентрацию высвободившегося буфалина измеряли с помощью ВЭЖХ, как описано ранее.

Цитотоксичность

Исследования цитотоксичности in vitro проводились с использованием теста МТТ (3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолий бромид) на нескольких типах линий опухолевых клеток, включая SW620, PC-3, MDA-MB- 231, A549, U251, U87 и HepG2. Кроме того, клетки U87 и U251 были отобраны для измерения цитотоксических эффектов липосом, нагруженных буфалином, и липосом, нагруженных буфалином, и пегилированных липосом на опухолевые клетки глиомы. Клетки U87 и U251 высевали соответственно в 96-луночные планшеты для микротитрования в концентрации 1,0 × 10 ⁵ . клеток / лунку и дать прилипнуть (37 ° C, 5% CO ₂ ) в течение 24 ч, после чего среду аспирировали и заменяли 0,1 мл свежей среды. Буфалиновое соединение, холостые липосомы, холостые ПЭГилированные липосомы, нагруженные буфалином липосомы и нагруженные буфалином ПЭГилированные липосомы разбавляли полной средой и добавляли к клеткам в общем объеме 0,1 мл для достижения желаемой конечной концентрации; для контроля не добавляли тестовый раствор. Холостые липосомы и холостые ПЭГилированные липосомы оценивали для проверки токсичности эксципиентов, используемых при получении липосом буфалина. Через 24 часа жизнеспособность клеток оценивали путем инкубации в ростовой среде, содержащей 5 мг / мл МТТ, в течение 4 часов при 37 ° C. После аспирации культуральной среды образовавшиеся кристаллы формазана солюбилизировали 200 мкл органического растворителя. Поглощение измеряли на считывающем устройстве для микропланшетов при длине волны 570 нм.

Фармакокинетическое исследование липосом буфалина in vivo с использованием метода ВЭЖХ

Фармакокинетическое исследование проводилось для оценки абсорбции, распределения, метаболизма и выведения буфалина из обычных липосом или липосом с длительной циркуляцией, а также для выявления различий в биодоступности буфалина с использованием метода ВЭЖХ.

В этом эксперименте молодые здоровые взрослые самцы крыс Sprague-Dawley весом 250 ± 20 г были приобретены в Четвертом военном медицинском университете (Сиань, Китай). Крыс содержали в хорошо вентилируемых клетках при комнатной температуре (24 ± 2 ° C) и относительной влажности 40–60% при обычном 12-часовом цикле свет-темнота. Перед экспериментом животные были акклиматизированы минимум за 3 дня. Процедуры на животных выполнялись в соответствии с рекомендациями Комитета по этике животных Четвертого военно-медицинского университета.

Нагруженные буфалином липосомы, нагруженные буфалином ПЭГилированные липосомы и буфалин в водной суспензии солюбилизацией этанолом получали, как описано ранее, и затем вводили внутривенно в эквивалентной дозе 0,5 мг / кг соответственно. Образцы крови собирали из глазной ямки крыс под анестезией легким эфиром в микропробирки, содержащие гепарин в качестве антикоагулянта, через 2, 5, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 240, 360, 600 минут после операции. дозирования, а затем центрифугировали при 3500 об / мин в течение 15 минут при 4 ° C. Отделенную плазму хранили замороженной при -20 ° C перед анализом.

Пример предварительной обработки

Для экстракции буфалина и внутреннего стандарта из крови крыс использовали простой метод жидкостно-жидкостной экстракции. К 200 мкл добавляли раствор внутреннего стандарта (20 мкл 100 мкг / мл рабочего раствора цинобуфагина), эквивалентный 10,0 мкг, и перемешивали в течение 10 с на цикломиксере с последующей экстракцией 3,0 мл этилацетат:петролейный эфир, 1:1 ( v / v ) и смесь. Смесь встряхивали в течение 5 мин с последующим центрифугированием в течение 15 мин при 4000 об / мин на Sigma 3-16k (Франкфурт, Германия). Аликвоту 3,0 мл органического слоя отделяли и упаривали досуха в атмосфере азота, а затем остаток повторно растворяли в 200 мкл ацетонитрила. Двадцать микролитров надосадочной жидкости вводили в аналитическую колонку для анализа после 15-минутного центрифугирования при 12000 об / мин.

Фармакокинетический анализ

Наблюдаемая максимальная концентрация в крови ( C _макс ) и период полураспада ( T _1/2 ) были получены при визуальном осмотре экспериментальных данных. Данные были подвергнуты некомпартментному фармакокинетическому анализу с использованием лекарств и статистики (DAS 2.1.1), редактируемому профессиональным математическим фармакологическим комитетом Китайского фармакологического общества для клинической оценки лекарств. Данные были проанализированы в соответствии с двухкамерной открытой моделью.

Статистический анализ

Все результаты были выражены как среднее ± стандартное отклонение ( n =3), и различия между составами сравнивали с помощью одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 5. P <0,05 означает значимость во всех случаях.

Результаты

Физико-химические свойства

Регидратация пленки в сочетании с технологией гомогенизации под высоким давлением использовалась для получения липосом, нагруженных буфалином, и липосом, нагруженных буфалином, ПЭГилированных. Регидратация пленки - один из традиционных методов синтеза липосом со зрелыми и контролируемыми процессами улавливания липофильных лекарств. Кроме того, количество циклов гомогенизации играет ключевую роль в достижении однородной и стабильной липосомальной суспензии.

Морфология липосом, нагруженных буфалином, и липосом, нагруженных буфалином, или ПЭГилированных, либо почти сферических, либо овальных, как показано с помощью ПЭМ, как показано на рис. обе липосомы были ниже 200 нм. Средний размер частиц липосом, нагруженных буфалином, и липосом, нагруженных буфалином, был равен 127,6 ± 3,64 нм и 155,0 ± 8,46 нм соответственно (рис. 1c), измеренный с помощью zeta анализатор потенциала (Delsa ™ Nano, Beckman Coulter, Калифорния, США). По сравнению с липосомами, нагруженными буфалином, ПЭГ-илированные липосомы, нагруженные буфалином, демонстрировали отрицательный поверхностный заряд, что свидетельствует об отличной стабильности (липосомы, нагруженные буфалином, 2,24 мВ; нагруженные буфалином липосомы, подвергнутые воздействию ПЭГ, -18,05 мВ, дополнительный файл 2:Таблица S1). Более того, распределения zeta потенциал можно увидеть на рис. 1б. Однако эффективность захвата буфалина липосомами, нагруженными буфалином, и липосомами, нагруженными буфалином, ПЭГ-илированными, определенная с помощью ВЭЖХ, составляет 76,31 ± 3,40% и 78,40 ± 1,62% соответственно.

Физико-химические свойства липосом, нагруженных буфалином, и липосом, нагруженных буфалином, ПЭГилированных. а Изображения ПЭМ нагруженных буфалином липосом и нагруженных буфалином ПЭГилированных липосом почти сферической или овальной формы. б Типичный размер частиц и распределение липосом, нагруженных буфалином, и липосом, нагруженных буфалином, ПЭГ-илированных, как измерено с помощью динамического светорассеяния. c Типичная поверхность zeta потенциал липосом, нагруженных буфалином, и липосом, нагруженных буфалином, ПЭГ-илированных

Испытание стабильности in vitro

Профили стабильности липосом, нагруженных буфалином, и липосом, нагруженных буфалином, ПЭГилированных, показаны в таблице 1. Кроме того, также был рассчитан коэффициент липосомальной утечки. Для липосом, нагруженных буфалином, результаты составили соответственно 0,0, 16,7, 25,2, 27,9 и 30,6% при 4 ° C в дни 0, 7, 15, 30 и 90. Для липосом, нагруженных буфалином ПЭГ, результаты были соответственно 0,0 , 5,0, 8,8, 14,5 и 18,0% при 4 ° C в дни 0, 7, 15, 30 и 90.

Профиль выпуска In vitro

Профиль высвобождения буфалина из липосом, нагруженных буфалином, или липосом, нагруженных буфалином, представлен на рис. 2. Исходя из экспериментальных данных, в тех же средах растворения буфалин мог быстро без ограничений диффундировать в PBS, содержащий 10% фетальной телячьей сыворотки, вслед за буфалином. липосомы, нагруженные буфалином, и, наконец, липосомы, нагруженные буфалином, ПЭГилированные

Высвобождение буфалина in vitro из обычных липосом, нагруженных буфалином, и липосом, нагруженных буфалином, ПЭГ-илированных в фосфатном буфере среды для растворения, pH 7,4. Данные представляют собой средние значения ± стандартное отклонение, n =3

Цитотоксичность

Жизнеспособность нескольких видов опухолевых клеточных линий, на которые воздействует буфалин, показана на рис. 3а при тестировании методом МТТ, а их половина от максимальной ингибирующей концентрации (IC ₅₀ ) также рассчитываются в Дополнительном файле 2:Таблица S2. Буфалин вызывал ингибирование роста множества опухолевых клеток дозозависимым образом, в то время как результаты IC ₅₀ показали, что буфалин был более чувствителен к злокачественным клеткам глиомы U251 и U87, чем другие протестированные раковые клетки, соответственно. При применении с буфалиновым соединением, липосомами, нагруженными буфалином, и липосомами, нагруженными буфалином, пегилированными, жизнеспособность клеток U251, определенная с помощью анализа МТТ, показана на фиг. 3b. При культивировании в течение 12 ч жизнеспособность клеток буфалинового соединения, липосом, нагруженных буфалином, и липосом, нагруженных буфалином, ПЭГ-илированных проявлялась по-разному, в то время как жизнеспособность клеток холостых липосом и холостых липосом-ПЭГ не изменялась. Как описано, при одном и том же уровне концентрации жизнеспособность клеток U251 в группе нагруженных буфалином ПЭГилированных липосом всегда была ниже, чем в группе липосом, нагруженных буфалином; Между тем влияние буфалинового соединения на жизнеспособность клеток было минимальным.

Цитотоксичность холостых липосом, холостых пегилированных липосом, буфалинового соединения, липосом, нагруженных буфалином, и липосом, нагруженных буфалином, и липосом, нагруженных буфалином, против опухолевых клеток in vitro. а Жизнеспособность клеток нескольких видов линий опухолевых клеток при различных концентрациях буфалинового соединения. б Жизнеспособность клеток U251 при различных концентрациях холостых липосом, холостых пегилированных липосом, буфалинового соединения, липосом, нагруженных буфалином, и липосом, нагруженных буфалином, пегилированных

Фармакокинетическое исследование in vivo

Проверка метода

Калибровочная кривая была построена на основе анализа линейной регрессии возражений против отношения площади пика внутреннего стандарта ( y ) от концентраций ( x , мкг / мл) буфалина в стандартном растворе в семи различных концентрациях. Уравнение регрессии было y =0,4238 x + 0,2429 (линейный диапазон 0,05–10,0 мкг / мл) и коэффициенты корреляции ( R ² ) составили 0,9965. Предел обнаружения (LOD) составлял 0,01 мкг / мл, который был рассчитан как количество введенного образца, которое дало отношение сигнал / шум 3 (S / N =3).

Специфика, точность и восстановление

Степень влияния эндогенных веществ оценивалась путем анализа хроматограмм, полученных из обработанных холостых проб плазмы. Дополнительный файл 3:На рисунке S2 представлены типичные хроматограммы холостой плазмы, холостой плазмы с добавлением буфалина, холостой плазмы с добавлением буфалина и резибуфогенина (в качестве внутреннего стандарта), образцов плазмы с добавлением резибуфогенина через 30 минут после внутривенного введения буфалина, образцов плазмы с добавлением резибуфогенин через 30 минут после внутривенного введения липосом, нагруженных буфалином, и образцы плазмы, содержащие резибуфогенин, через 30 минут после внутривенного введения нагруженных буфалином липосом, содержащих ПЭГ. Буфалин и резибуфогенин элюировались приблизительно через 7,191 и 10,131 мин соответственно. Не было обнаружено пиков мешающих материалов и липосомальных мембран во время удерживания буфалина или внутреннего стандарта. Результаты испытаний на точность и восстановление показаны в таблице 2.

Фармакокинетика

Профили концентрации в крови-времени липосом, нагруженных буфалином, липосом, нагруженных буфалином, и ПЭГ-илированных липосом, и их сравнение с буфалиновым веществом в водной суспензии показаны на рис. 4. Средние фармакокинетические параметры представлены в таблице 3. Результаты показали, что были между ними существенные различия по большинству этих параметров, и C _макс липосом, нагруженных буфалином, было меньше, чем составляющих буфалина, а липосом, нагруженных буфалином, ПЭГ было меньше всего. Кроме того, T _{1 / 2z} отношение загруженных буфалином ПЭГ-илированных липосом к буфалиновому субъекту и загруженных буфалином липосом к буфалиновому субъекту было примерно в 2,15 раза (87,84 мин / 40,52 мин) ( P <0,01) и в 1,34 раза (54,40 мин / 40,52 мин) ( P <0,05) соответственно. AUC _{(0– t )} Отношение загруженных буфалином ПЭГ-илированных липосом к буфалиновому субъекту и загруженных буфалином липосом к буфалиновому субъекту было примерно в 5,49 раза (139 157,83 нг / (мл мин) / 25 334,27 нг / (мл мин)) ( P <0,01) и в 2,28 раза (57 751,88 нг / (мл мин) / 25 334,27 нг / (мл мин)) ( P <0,01) соответственно. Выявлено, что буфалин быстро выводится из кровотока, а липосомный препарат увеличивает концентрацию препарата в плазме и выдерживает клиренс. Кроме того, этому эффекту может способствовать модификация ПЭГ.

Кривая концентрация-время буфалина в плазме у крыс

Обсуждение

В этом исследовании были успешно получены липосомы, нагруженные буфалином, и липосомы, нагруженные буфалином, с помощью метода регидратации пленки гомогенизации, оба из которых имели оптимальный размерный диапазон и низкую полидисперсность, и их можно было легко воспроизвести в большом размере партии. Это исследование показало, что липосомальный состав значительно улучшает растворимость буфалина.

Нагруженные буфалином ПЭГилированные липосомы проявляли отрицательный поверхностный заряд с большей абсолютной величиной, чем нагруженные буфалином липосомы с положительным поверхностным зарядом. дзеты потенциал в основном определяется свойствами поверхности. Немодифицированные нагруженные буфалином липосомы были нейтральными, и их потенциалы обычно находились в пределах ± 5 мВ. Однако DSPE не заряжается в нейтральных условиях, но процесс приготовления не может быть полностью нейтральным, поэтому DSPE заряжен отрицательно. Между тем, дзета потенциал макромолекулы ПЭГ примерно отрицательный на несколько милливольт, близкий к нейтральному отрицательному потенциалу. Следовательно, после модификации поверхности DSPE-PEG ₂₀₀₀ на липосомах, содержащих буфалин, дзета потенциал нагруженных буфалином ПЭГилированных липосом отрицательный. Эти данные свидетельствуют о том, что модификация поверхности DSPE-PEG ₂₀₀₀ изменяет поверхностные электрические потенциалы липосом, что увеличивает их стабильность. Это было подтверждено тестом на стабильность in vitro. Ли и др. [12] использовали липосомную систему совместной доставки, которая связывает mAb против CD40 с поверхностью ПЭГилированных липосом, обернутых буфалином. Липосомы были синтезированы с композицией буфалина, холестерина, EPC, DSPE-PEG ₂₀₀₀ , и DSPE-PEG ₂₀₀₀ -Mal в молярном соотношении 20:55:5:5:15 соответственно. Затем моноклональные антитела против CD40 конъюгировали с липосомами посредством реакции малеимид-тиол для получения заякоренных в липосомах буфалина анти-CD40. Что касается профиля стабильности, упоминается только, что отрицательный поверхностный заряд предполагает отличную стабильность без четкого и определенного описания данных.

Ли и др. [13] приготовили нагруженные буфадиенолидом липосомы (BU-липо), состоящие из 1,25% липоида E-80® и 0,06% холестерина. Эффективность захвата буфалина, цинобуфагина и резибуфогенина составила 86,5, 90,0 и 92,1% соответственно. Принимая во внимание стабильность фосфолипидов, для рецептуры BU-липо был выбран pH 6,5. Свойства BU-липо, такие как pH, PSD, zeta потенциал и эффективность улавливания не менялись в течение как минимум 3 месяцев при 2–8 ° C. Однако условия хранения необходимо строго контролировать. Необходимо изучить более стабильный препарат при нейтральном pH, чтобы снизить затраты на транспортировку и хранение, что следует учитывать при будущем клиническом применении.

В соответствии с рецептурой препарата в предыдущих исследованиях, мы повторили эксперименты с липосомами, нагруженными буфалином. Однако стабильность липосом не могла удовлетворить производственные потребности.

В настоящем исследовании нагруженные буфалином ПЭГилированные липосомы были синтезированы с композицией буфалина, холестерина, L-α-фосфатидилхолина и DSPE-PEG ₂₀₀₀ в молярном соотношении 10:30:55:5 соответственно. В особенности перед экструзией на экструдере Lipex с использованием поликарбонатных мембран, полученная таким образом смесь подвергалась дальнейшей обработке с гомогенизацией под высоким давлением.

При хранении при нейтральном pH при 4 ° C в течение 3 месяцев размер частиц обеих липосом незначительно увеличился, а эффективность захвата в целом умеренно снизилась, что будет удобно для использования в клинической практике. Фотография, полученная с помощью просвечивающего электронного микроскопа, показала, что толстая трехмерная облачная структура покрывает поверхность липосом, нагруженных буфалином, что указывает на то, что DSPE-PEG ₂₀₀₀ играет роль в стерической стабилизации благодаря своей амфифильной линейной полимерной структуре.

Исследование высвобождения in vitro показало, что высвобождение буфалина из липосом, нагруженных буфалином, и липосом, нагруженных буфалином, ПЭГ-илированных, задерживалось в одних и тех же средах растворения, в то время как соединение буфалина диффундировало в PBS быстро без ограничений. Модификация поверхности DSPE-PEG ₂₀₀₀ altered the barrier properties of the aqueous boundary layer and the permeability of the membrane, resulting in a low release velocity of bufalin from liposomes.

Regarding cytotoxicity study, bufalin caused an obvious inhibition of growth in multiple tumor cells in a dose-dependent manner, while the results of IC₅₀ indicated that bufalin was more sensitive to U251 and U87 glioma cancer cells than the other kinds of cancer cells, respectively. Moreover, we found that the blank liposome and blank PEGylated liposome were not toxic to cells, revealing the safety of excipients to some degree, whereas the bufalin-loaded liposomes and bufalin-loaded PEGylated liposomes showed concentration-dependent toxicity to U251 glioma cells. In addition, bufalin-loaded PEGylated liposomes showed slightly weaker cytotoxicities compared with bufalin-loaded liposomes and free bufalin. It is assumed that free bufalin was slowly released from bufalin-loaded PEGylated liposomes during incubation. And the release rate of bufalin was slower in bufalin-loaded PEGylated liposomes than bufalin-loaded liposomes. All the results might suggest that after internalization in the cells, free bufalin could be released from bufalin-loaded PEGylated liposomes and induce the apoptosis of U251 glioma cells.

The pharmacokinetic study found that significant differences of pharmacokinetic parameters among bufalin-loaded PEGylated liposomes, bufalin-loaded liposomes, and free bufalin entity did exist. After intravenous administration, free bufalin entity was swiftly cleared in the bloodstream with the highest peak concentration, whereas liposome preparation did obviously increase the drug concentration in plasma and withstood the clearance. Moreover, the surface modification of PEG could facilitate this effect. These results had provided us some information for understanding the properties of bufalin on pharmacokinetics and pharmacodynamics.

As common primary intracranial tumors, 70% of glioma tumors were malignant, including astrocytoma and glioblastoma. The micro environment of the network of glioma was composed of tumor cells, immune cells and various cytokines secreted by them, which was complex and made glioma cells intracranial metastatic easily [2]. Therefore, operations are difficult to perform, and the incomplete surgery excision commonly resulted in the poor prognosis. To these patients, radiotherapy and chemotherapy play key roles in their treatments. Nowadays, the applications of three-dimensional conformal radiation therapy and intensity-modulated radiation therapy technology can not only increase precision, dosage and efficacy, but also reduce damage in cancer therapy, so as to improve their living quality. However, the accurate radiotherapy has great risk because of the particularity of brain tissues and brain functions. Hence, medication of chemotherapeutics is relatively instrumental in glioma cancer treatment, whereas most malignant and highly aggressive glioma tumors have high relapse rates due to BBB and drug resistance [14].

Consequently, selecting a highly sensitive drug to brain glioma and making it penetrate the BBB are becoming emerging scientific subjects to resolve.

In recent years, the researches concerning bufalin have been studied in various aspects, including pharmacology, pharmacodynamics, and pharmaceutics [12, 15,16,17,18,19,20]. Fortunately, some studies found that bufalin had a broad antitumor spectrum. It was sensitive to several kinds of tumor cell lines, including lung cancer, liver cancer, melanoma, and glioma cancer. However, low solubility, heavy toxicity, and short half-life led to a narrow therapeutic index by intravenous administration and easy decomposition by oral administration, which restricted clinical application of bufalin [6]. In addition, bufalin had been reported to be hydrophobic and could only dissolve in some suspending agent or auxiliary solvent including ethanol and tween 80, which might result in some toxic effects [21].

Nevertheless, as a new drug delivery system, the liposomal formulation was considered to be a low-toxic technology with considerable potential for encapsulating lipophilic drugs [12, 22]. Some studies showed that liposome could be easier to enter tumor focus by the process of phagocytosis. Meanwhile, the vascular endothelial cell gaps in the tumor lesion was enlarged, which enhanced this process (enhanced permeability and retention effect, EPR effect) [23, 24]. Moreover, the liposome could sustain releasing antitumor agents so as to extend action time, improve drug efficacy, and decrease adverse reaction [25]. Thus, liposome formulation has a wide prospect to encapsulate antitumor agents [9].

In the previous experiments, we found that the combination chemoimmunotherapy of anti-CD40 plus bufalin by liposomal carriers could enhance anticancer therapeutic efficacy while reducing systemic toxicity, due to the confined biodistribution and prolonged release of cargo [12]. In the present study, we found that bufalin entity has a broad spectrum of anticancer activity. It could inhibit the proliferation of several kinds of tumor cells, such as lung, liver, breast, and glioma cancer cells. As an active traditional Chinese monomer, bufalin is a promising anticancer drug. It was expected to be applied to further clinical study. However, anti-CD40 mAbs has not been approved as a pharmaceutical excipient by the FDA. The toxicity and side effect of anti-CD40 mAbs is still unclear to this day.

Nevertheless, the shortcomings of conventional liposome were obvious in the meantime. Lack of membrane stability, easy oxidation of phospholipid materials, and opsonification of plasma proteins limited its application [26, 27]. By surface-modifying DSPE-PEG₂₀₀₀ on bufalin-loaded liposomes, bufalin-loaded PEGylated liposomes extended its blood circulation, prolonged half-life, and expanded the therapeutic window for glioma.

Therefore, we adjusted the formulation of bufalin-loaded PEGylated liposomes. On this basis, we evaluated the physicochemical properties and comprehensive characterizations both in vitro and in vivo. We characterized pharmacokinetic properties of bufalin-loaded PEGylated liposomes and compared this type of liposome with raw bufalin and non-PEGylated liposomes. Our results revealed the unknown PK properties of this type of liposomes, which will be useful to recommend dosage in a further clinical study.

Our subjects lack some tissue distribution experiments in animals, so it is not known how the liposome formulation altered the distribution of bufalin in the body. Further studies with more experiments are needed.

Conclusions

The present study demonstrated that the solubility, antitumor efficacy, and pharmacokinetics of bufalin-loaded PEGylated liposomes are improved compared with those of bufalin entity. The results suggested that PEGylated liposomal bufalin has the potential to be a good drug delivery system for glioma cancer.