Биогенный синтез, характеристика и оценка антибактериального потенциала наночастиц оксида меди против Escherichia coli

Введение

Местные травы и пряные растения обладают ценными антиоксидантными и антибактериальными свойствами, которые используются при лечении людей и в ветеринарии [1]. Лекарственные растения, обладающие противомикробными свойствами, включают чеснок, имбирь, ним, куркуму, тулси и т. Д., И среди них чеснок и имбирь известны своим лечебным действием [2]. Zingiber officinale широко известный как имбирь - это корень местного растения, принадлежащего к семейству Zingiberaceae. Он содержит гингерол, шогаол, куркумин и парадол как важные фитохимические вещества [3]. Противомикробная активность против широкого круга микробов проявляется в водных экстрактах имбиря из-за его фенольного содержания терапевтического характера [4]. Allium sativum широко известный как чеснок, содержит фенольные соединения, проявляющие антибактериальную активность широкого спектра действия даже против бактерий МЛУ [5]. Allium sativum проявил антибактериальную активность широкого спектра действия против ряда грамположительных и различных грамотрицательных бактерий [6].

Использование знаний о нанотехнологиях на молекулярном и атомном уровнях служит основой для применения интегративного подхода к разработке новых соединений с уникальными свойствами для использования в приложениях широкого спектра [7]. Применение наночастиц в медицинских, сельскохозяйственных, пищевых консервантах и ​​косметических целях из-за их непревзойденных присущих свойств привело к более активным исследованиям исследователей [8, 9]. Были успешно продемонстрированы различные биологические применения наночастиц оксида меди, в том числе потенциальные противомикробные препараты, эффективные терапевтические соединения, носители для доставки лекарств, фотокатализаторы, газоанализ, фотоэлектрическая стабильность, эффект квантового ограничения и биологические зонды [10,11,12,13,14]. Генерация активных форм кислорода (АФК) запускается наночастицами из-за их полупроводниковой природы, вызывая окислительные и дегенеративные преобразования на клеточном уровне, приводящие к разрушению стенок бактериальных клеток и высвобождению клеточного содержимого [15]. Для синтеза наночастиц было применено множество методов:химический, физический и биологический синтез [16]. Восстановление металлических соединений приводит к производству наночастиц с использованием любых биохимических веществ или микроорганизмов, растений или их экстрактов [17].

кишечная палочка ( E. coli ), естественный обитатель кишечника и часть кишечной флоры, занимает особое место в микробиологическом мире благодаря своим потенциальным вирулентным свойствам [18]. Существование вирулентности зависит от количества генов в E. coli изолятов и, в некоторых случаях, также был выявлен горизонтальный перенос генов устойчивости [19, 20], что может создавать проблемы для здоровья людей и животных [21] и создавать проблемы для безопасности пищевых продуктов [22]. Э. coli является возбудителем мастита у дойных коров и буйволов и был признан ответственным за значительное снижение надоев и, как следствие, экономические потери [23, 24], которые привели к развитию генов устойчивости, то есть β-лактамаз расширенного спектра (БЛРС) или чрезмерного экспрессируются цефалоспориназы (AmpC) [25]. Неэффективность лечения, связанная с E. coli инфекции рассматриваются как латентная угроза, ведущая к множественной лекарственной устойчивости как у людей, так и у ветеринарных лекарств [26].

Наночастицы с их характерными антимикробными свойствами могут убить около 600 клеток, в отличие от способности антибиотика лечить лишь несколько заболеваний инфекционного происхождения [27]. Настоящее исследование направлено на изучение, оценку и сравнение возможного антимикробного потенциала зеленых и химически синтезированных наночастиц CuO и экстрактов корней обычных трав Allium sativum (AS) и Zingiber officinale (ZO), против патогенного E. coli в качестве альтернативы антибиотикам для преодоления возникающих проблем с резистентностью.

Методы

Настоящее исследование было направлено на изучение бактерицидного действия фитохимически восстановленных НЧ CuO против корней травы Allium sativum (AS) и Zingiber officinale (ZO), изолят мастита крупного рогатого скота.

Материалы

Химически полученные наночастицы CuO были закуплены у Sigma-Aldrich, тогда как корни ZO и AS были приобретены на местном рынке фруктов и овощей в Лахоре, Пакистан. Корни ZO и AS сушили в тени до равномерного веса. Среда для выращивания E. coli химические вещества аналитической чистоты использовались без изменений.

Водная экстракция корней ZO и AS

Высушенные корни ZO и AS измельчали ​​до мелкодисперсных порошков, которые затем хранили в герметичных емкостях. Интенсивное перемешивание в течение 30 минут при 70 ° C для смешивания тонкоизмельченных корней с дистиллированной водой - DIW проводили в соотношении 1:10. Фильтрацию приготовленных растворов проводили с использованием фильтровальной бумаги Whatman № 1 после охлаждения растворов, а хранение фильтрата проводили при 4 ° C для следующего эксперимента [28], как показано на рис. 1а.

Обзор a водная экстракция Zingiber officinale и Allium sativum корни, b зеленый синтез НЧ CuO

Зеленый синтез CuO

Тетрагидрат нитрата меди (0,1 М) смешивали с различными концентрациями, то есть с 3 мл, 6 мл и 12 мл экстрактов ZO и AS, при непрерывном перемешивании. NaOH (2 M) использовали для поддержания pH 12 перемешиваемого раствора в течение 2 ч при 90 ° C для образования осадков. Центрифугирование осадков проводили при 10000 об / мин в течение 20 минут с последующей промывкой деионизированной водой и сушкой в ​​течение ночи в сушильном шкафу с горячим воздухом при 90 ° C [29], как показано на рис. 1b.

Характеристика

УФ-видимый спектрофотометр GENESYS-10S был использован для проверки спектров поглощения наночастиц CuO и водных экстрактов ZO и AS в диапазоне длин волн от 200 до 500 нм [30]. Структурный и фазовый анализ НЧ CuO проводили с использованием рентгеновской дифракции (XRD) BRUKER D2 Phaser с 2 θ =(10 ° –80 °) с излучением Cu Kα λ =1,540 Å [31]. Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (ATR-FTIR) была проведена для анализа функциональных групп в НЧ CuO и водных экстрактах ZO и AS [31]. Сканирующая электронная микроскопия (JSM-6610LV SEM) в сочетании с детектором EDS была предпринята для наблюдения элементарного и морфологического состава НЧ CuO. Изображения ПЭМ высокого разрешения и картины SAED были получены с использованием микроскопа JEOL JEM-2100F [32].

E. coli Изоляция и идентификация

Коллекция образцов

Коровы и буйволы, страдающие клиническим маститом, были отслежены и идентифицированы на различных животноводческих фермах для сбора образцов молока.

E. coli Изоляция

Агар МакКонки использовали для штриховки и культивирования молока в трех экземплярах для выделения очищенных колоний E. coli [33]. Дисковые диффузии отличительных колоний E. coli были оценены для проверки чувствительности к определенным антибиотикам с соблюдением рекомендаций Национального комитета по клиническим лабораторным стандартам (NCCLS) для выделения E. coli .

Идентификация E. coli

Идентификация и подтверждение E. coli колонии отбирали на основании окрашивания по Граму; различение морфологических признаков и биохимических тестов, то есть тестов с метиловым красным и каталазой, с точки зрения Руководства по систематической бактериологии Берджи. Культивирование изолятов на агаре с эозин-метиленовым синим (EMB) проводили для E. coli отличимость и ратификация от родственных грамотрицательных маститогенов.

Оценка антибактериального потенциала НЧ CuO in vitro в отношении E. coli

Был проведен ряд экспериментов по оценке in vitro антибактериальный потенциал НЧ CuO, допированных экстрактом, против патогенных E. coli . In vitro испытания проводились с использованием 10 репрезентативных патогенных E. coli изоляты для оценки антибактериального потенциала НЧ CuO. Оценка диско-диффузионного метода была использована для оценки in vitro антимикробный потенциал. С чашек Петри были взяты мазки с активированным ростом E. coli 1,5 × 108 КОЕ / мл (0,5 Макфарланд стандарт) на агаре МакКонки [34]. Для приготовления лунок диаметром 6 мм в чашках Петри использовали стерильный пробковый сверлильный станок. Водные экстракты ЗО и АС , вместе с зелеными легированными экстрактами и химически синтезированными наночастицами оксида меди в различных концентрациях вносились в лунки. Антимикробный потенциал водных экстрактов ZO и AS, а также экстрактов с добавками зеленых примесей и химически синтезированных наночастиц оксида меди оценивали путем аэробной инкубации чашек Петри при 37 ° C в течение ночи путем измерения зон ингибирования (мм) с помощью штангенциркуля Вернье. Статистический анализ зон ингибирования (мм) проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа и визуализации ( p <0,05).

Результаты и обсуждение

УФ-видимая спектроскопия допированных НЧ CuO и водных экстрактов ZO и AS была проведена для исследования оптического поведения, как показано на рис. 2a, b. Для последующего образования НЧ CuO было замечено постепенное изменение цвета от винного до угольно-черного, в то время как была предпринята оптимизация синтезированных НЧ с помощью сводчатых акустических экстрактов. Наблюдали пики поглощения водных экстрактов ZO и AS при 275 и 280 нм. Результаты показаны λ _макс для CuO, легированного ZO и AS, при 250 нм, что соответствует соотношению 6 мл:1 с характерными красными смещениями и синими смещениями соответственно [35]. Широкие пики указывают на кластеры частиц и переход электронов в зоны проводимости из валентной фазы с концентрированными экстрактами в CuO, что проявляется в сильных полосах поглощения [36]. В синтезированных зеленым цветом НЧ CuO снижение абсорбции наблюдалось при увеличении или уменьшении объема экстракта в дополнение к оптимизированному значению (6 мл:1).

Спектры поглощения НЧ CuO, легированных a ZO b Экстракт АС и спектры ФЛ НЧ CuO с c ZO и d Экстракты AS, соответственно

Кроме того, было замечательно наблюдать, что полупроводниковые структуры подтвердили свои физические особенности по сравнению с существующими нанометрическими квантово-размерными эффектами. Спектры ФЛ наночастиц CuO, легированных ZO и AS, с длиной волны возбуждающего УФ-излучения 300 нм представлены на рис. 2в, г. Три пика излучения при 418, 561 и 664 нм были представлены на каждом графике чистой и легированной ФЛ CuO (УФ-область) [37]. Фиолетово-синяя полоса света при 418 нм представляет собой стандартный пик излучения CuO на ближнем крае полосы [38, 39]. На длине волны 430 нм край плеча может быть связан с вакансиями CuO, который является полупроводником p-типа. Желтовато-зеленый край отвечает за дефекты глубины при низких температурах 561 нм. Красные пики излучения при 664 нм отвечают за различные состояния меди или наличие отдельных вакансий ионизированного кислорода [40, 41]. Разнообразие видимых излучений в фиолетово-синем, желто-зеленом и красном спектре указывает на то, что исследуемые частицы CuO имеют высокое отношение объема к поверхности и множество состояний поверхности к объему и дефектов (вакансий или междоузлий), которые создают диапазоны между ловушками и выбросами [40, 42].

XRD был выполнен для оценки кристаллической структуры, состава и масштаба наночастиц CuO, как показано на рис. 3a, d, легированных ZO и AS, соответственно. Увеличение кристалличности было продемонстрировано пиками, обнаруженными при 2 θ =38,7 °, 48,6 °, 53,5 °, 58,3 °, 61,7 ° и 66,2 ° с соответствующими кристаллическими плоскостями (111), (-202), (020), (202), (-113) и (022) соответственно. Обнаруженные пики подтверждали присутствие моноклинной фазы CuO, что синхронизировано с картой JCPDS №:00–002–1040 [43]. Характерный размер кристаллитов, измеренный с использованием D =0,9 λ / β cos θ Было установлено, что для CuO, легированного ZO и AS, 24,7 и 47,6 нм соответственно, а размер кристаллитов исходного образца составлял 27,4 нм. Некоторые натуральные продукты были идентифицированы как покрывающие и восстанавливающие агенты для среднего размера кристаллитов в экстрактах AS и ZO [44].

Картины XRD НЧ CuO без и с легированием a AS b ZO

Функциональные группы НЧ CuO, допированных экстрактом AS и ZO, были исследованы с помощью FTIR, как показано на рис. 4a, b, соответственно. Широкий пик на 3314 см ⁻¹ подтверждено присутствие гидроксильной группы, а ширина пика представляет собой прямой C =O с (N – H) аминами [45]. Интенсивный пик на 1638 см ⁻¹ соответствует каналу ₂ –OCH ₃ группа, содержащаяся в 6-сногале и 6-гингероле ZO, обнаружила значительное снижение CuO. Типичные одинарные связи Cu – O при 478,8 см ^-1 скручивания были вызваны сильными модами колебаний [46]. Все пики предполагают, что спиртовые, аминные и кетоновые группы привели к хелатированию и кэппированию флавоноидов, химических веществ и белков растений [47].

FTIR-спектры a AS b НЧ CuO, легированные ZO

FE-SEM использовался для изучения характеристик поверхности и масштаба наночастиц CuO, легированных экстрактом ZO и AS, как показано на рис. 5a – d ′. Изображения FE-SEM показывают, что наночастицы CuO чрезвычайно агломерированы в сферической морфологии. Магнитная интерференция и соответствие полимеров между частицами может показать агломерацию между частицами [48]. Легирование ZO и AS CuO было очевидно по изображениям, показывающим образование кластеров, а размер частиц кажется <1 мкм, как показано на рис. 5b – d '.

Изображения НЧ CuO, сделанные с помощью FESEM a CuO, b - г ZO-легированный CuO и b ′ - г НЧ CuO, легированные AS, соответственно

Энергодисперсионная рентгеновская спектроскопия (EDS) проиллюстрировала химический состав с помощью элементарного исследования исходного образца и допированных наночастиц CuO с экстрактами корня ZO и AS застарелыми фазами CuO, как показано на рис. 6a – d ′. Три пика, соответствующих высокой чистоте Cu, подтвержденной EDS испытанных образцов, по сравнению с исходным кислородом между 1 и 10 кэВ. Поверхностный плазмонный резонанс (ППР) НЧ CuO привел к появлению пиков поглощения [49]. 83,7%, 15,2% и 0,6% наблюдались для атомной массы через спектры для Cu, O и Ca, соответственно, для контрольного образца, тогда как 82,8%, 14,8% и 2,4% для ZO-легированного и оптимизированного образца (6 мл:1) наблюдается через спектры для Cu, O и Zn соответственно. Аналогичным образом были найдены 65,3, 29,6 и 4,6 для Cu, O и S с легированием AS, соответственно. Дополнительные атомные соединения, появляющиеся в EDS, реагировали на держатель образца SEM, используемый во время анализа [50].

Спектры ЭДС НЧ CuO a чистый CuO b - г ZO-легированный CuO и b ′ - г НЧ CuO, легированные AS, соответственно

Эксклюзивная и характерная структура наночастиц CuO была дополнительно оценена с помощью HR-TEM при длине волны 50 нм, как показано на рис. 7a – l. Изображения HR-TEM выявили украшенные наночастицы, аналогичные изображениям FE-SEM, а также более высокую агломерацию при размере менее 50 нм. Присутствие фитохимических веществ в НЧ CuO, допированных ZO и AS, было также подтверждено изображениями HR-TEM [51]. В структуре интегральной решетки НЧ CuO, легированных ZO и AS, не наблюдалось ни несовершенства, ни какой-либо деформации [52]. Отфильтрованные микрофотографии были представлены результатами HR-TEM вместе с быстрым преобразованием Фурье [FFT] указанной области, изображенной желтым квадратом на рис. 7b, d, f, h, j, l, представляющих структурные и атомные характеристики с высоким разрешением. Средние размеры частиц HR-TEM точно соответствуют размерам кристаллитов, наблюдаемым во время анализа XRD и SEM [53].

а , b HR-TEM, a - е бахрома решетки из 3 мл, 6 мл и 12 мл CuO g, легированного ZO - l полосы решетки из 3 мл, 6 мл и 12 мл НЧ CuO, легированных AS, соответственно

Анализ XPS легированного CuO с Gi и Ga CAE, отображающий C 1 s и Cu 2 p спектр показан на рис. 8а, б. C1 s диапазон указывает на присутствие четырех различных пиков (рис. 8a) с различными функциональными группами, такими как C (H, C) (284,39 эВ), C (N) (285,6 эВ), C (O, =N) (287,0 эВ) и C – O –C (288,75 эВ) [54,55,56]. В основном на рис. 8b изображен Cu 2 p картина легированного CuO с пиками при энергиях связи 933,3 и 953,3 эВ, соответствующих Cu 2 p _3/2 и Cu 2 p _1/2 спиновая орбита указывает на двухвалентную степень окисления приготовленного образца. Соответствующие пики при 942,2 и 962 эВ относятся к сателлитным пикам Cu 2 p _3/2 и Cu 2 p _1/2 что казалось в основном из-за частично заполненных 3 d ⁹ орбиталь в двухвалентной степени окисления [57].

а , b XPS-анализ допированных НЧ CuO a C1s b Cu 2p

Метод диффузии лунок был применен для оценки бактерицидного потенциала водных экстрактов ZO и AS и синтезированных НЧ CuO путем измерения площадей ингибирования после инкубации чашек Петри в течение 24 часов, как показано на рис. 9a – d, дополнительный файл 1:рис. S1 и Табл. 1. Результаты показали, что зоны концентрации НЧ и зоны ингибирования реагируют синергетически. Зоны значительного ингибирования, обнаруженные для образца 1 (3 мл:1), образца 2 (6 мл:1) и образца 3 (12 мл:1), составляли (1,05–1,85 мм) и (1,85–2,30 мм) при уменьшении (↓) и увеличенные (↑) концентрации, соответственно, для наночастиц CuO, легированных ZO ( p <0,05), рис. 9а. Аналогичным образом, НЧ, легированные AS, проявляли зоны ингибирования (0,65–1,00 мм) только при максимальной концентрации, рис. 9б. НЧ, допированные AS, продемонстрировали нулевую эффективность против патогенных E. coli при минимальных концентрациях. Экстракт ZO продемонстрировал эффект при пониженной (↓) концентрации по сравнению с повышенной (↑) концентрацией, показывающей зону 1,55 мм, аналогично, не было обнаружено антибактериального эффекта экстрактов AS как при пониженной (↓), так и при повышенной (↑) концентрациях. Контрольный положительный результат, обработанный ципрофлоксацином, показал зону 4,25 мм, тогда как контрольный отрицательный результат, обработанный DIW, показал 0 мм. % Возрастной бактерицидной эффективности был увеличен с 24,7 до 43,5% и 43,5–54,1% для НЧ, допированных ZO, при минимальной и максимальной концентрациях, соответственно (рис. 9c). Аналогичным образом, эффективность 15,3–23,5% при максимальной концентрации достигается только для НЧ, допированных AS (рис. 9d). Таким образом, CuO с добавкой экстракта ZO и оптимизированной концентрацией 6 мл:1 демонстрирует более высокий бактерицидный потенциал против патогенных E. coli происхождения мастита крупного рогатого скота ( p <0,05), как показано на рис. 9а, б.

а - г Антибактериальная активность НЧ CuO a in vitro с допингом ZO при дозах ↓ и ↑, b с добавкой АС в дозах ↓ и ↑ соответственно, c эффективность% возраст с допингом ZO и d эффективность% возраст с допингом АС

Бактерицидный потенциал наночастиц зависит от размера наночастиц, морфологической структуры и отношения поверхности к массе. Считается, что активные формы кислорода (АФК) ответственны за образование зон ингибирования наночастицами CuO [58, 59]. Денатурация клеточного белка происходит в результате образования вредных активных форм кислорода (АФК) [60]. Некоторые реактивные частицы, такие как гидроксильные и супероксидные радикалы и дырки, играли важную роль в фотокатализе [61]. Синтез активных форм кислорода (АФК) и высвобождение ионов металлов являются основными признаками, проявляющими структурные изменения ферментов и белков, которые, как следствие, приводят к непоправимому повреждению ДНК и последующей гибели бактерий [62]. Точно так же окислительный стресс, вызванный активными формами кислорода (АФК), считается основным фактором фотокатализа [63]. Производство АФК обратно пропорционально размеру наночастиц, т.е. чем меньше размер НЧ, тем выше продукция АФК, которая, как следствие, повреждает бактериальную мембрану, что приводит к экструзии цитоплазматического содержимого и деградации ДНК, что приводит к бактериальному взрыву, как показано на рис.10. В то же время положительно заряженная Cu электростатически взаимодействует с отрицательно заряженной бактериальной мембраной, что приводит к распаду клеток и, в конечном итоге, к разрушению бактерий [58, 64, 65]. Два ответа были предложены как потенциальные для бактерицидного механизма наноструктур. Один предполагает лучшую связь между катионами Cu ²⁺ и бактериальные клетки, что приводит к образованию негативных участков и возможному коллапсу. Другой - электронное возбуждение поверхности валентной полосы CuO посредством возбуждения. Кроме того, электрический O ₂ реакция дает O ^2- радикалы, приводящие к образованию H ₂ О ₂ . Сгенерированный O ²⁻ виды жизненно важны для расщепления липидных или белковых молекул на внешней клеточной мембране бактерий [58, 66].

Иллюстрация бактерицидного действия НЧ CuO