Лиганд-допированные наночастицы медного оксид-гидроксида: эффективная антимикробная стратегия

Аннотация

Бактериальная резистентность к антимикробным терапиям — растущая клиническая проблема. Это так же верно для топикальных применений как и для системной терапии. Топикально, медные ионы могут быть эффективными и дешевыми антимикробными агентами, действующими через множественные пути, тем самым ограничивая возможности бактерий для резистентности. Однако химия меди не поддается легким формулировкам, которые будут легко высвобождать медные ионы при биологически совместимых pH. Здесь мы разработали наночастичатый медный гидроксид адипат тартрат (CHAT) как дешевый, безопасный и легко синтезируемый материал, который должен обеспечивать антимикробное медное ионное высвобождение в инфицированной раневой среде.

Во-первых, мы синтезировали CHAT и показали, что это имеет дисперсные акватированные размеры частиц 2–5 нм и средний дзета-потенциал −40 мВ. Затем, когда разбавлен в бактериальной среде, CHAT продемонстрировал похожую эффективность к хлориду меди против Escherichia coli и Staphylococcus aureus, с доза-зависимой активностью происходящей в основном вокруг 12,5–50 мг/л меди. Действительно, на этих уровнях CHAT очень быстро растворялся и, как подтверждено бактериальным медным биосенсором, показывал идентичное внутриклеточное загрузку к медным ионам из хлорида меди. Однако когда сформулирован при 250 мг/л в топикально применяемой матрице, а именно гидроксиэтил целлюлозе, преимущество CHAT над хлоридом меди стало очевидным. Первый давал быстрый устойчивый выпуск меди в бактерицидном диапазоне, но хлорид меди, который формировал нерастворимые осадки при такой концентрации и pH, достиг максимума выпуска 10 ± 7 мг/л меди к 24 ч.

Мы предоставляем практическую формулировку для топикальной медной антимикробной терапии. Дальнейшие исследования, особенно in vivo, заслуживают внимания.

Введение

Микробные инфекции вносят вклад в миллионы смертей глобально [1]. Часто неэффективность антимикробного лечения обусловлена микробной резистентностью к конвенциональным антибиотикам [2–5]. Как таковые, новые антимикробные агенты с нетерпением ищутся. Медь давно признана за свои антимикробные эффекты и может иметь потенциал для большей клинической долговечности чем стандартные антибиотики, поскольку она кажется действующей через множественность механизмов против бактерий, включая взаимодействие с бактериальными белками и ДНК, производство реактивных форм кислорода (ROS) и разрушение мембранной целостности [6, 7]. По той же причине предполагается, что потенциал антимикробной резистентности патогенных бактериальных штаммов к меди и другим металлам ограничен [7–9]. Кроме того, медь относительно дешева и имеет низкую токсичность для людей, поскольку ее существенность на следовом уровне обеспечила эволюцию жесткого гомеостатического контроля [10–12]. Поэтому общее использование этого металла для профилактических инфекционных мер, в основном для избегания бактериальной биопленки формирования на поверхностях в высокорисковых зонах таких как больницы и дома престарелых [13, 14]. В противовес, медь не нашла значительного терапевтического использования в топикальных антимикробных формулировках, в отличие от серебра которое широко применяется [15].

Бактерии восприимчивы к медно загрузке в их внутриклеточной среде, и эффективность медного источника связана с его способностью высвобождать медные ионы [16, 17]. В этом отношении значительный вызов для медных антимикробных средств — достижение концентрированной формулировки, позволяющей устойчивый выпуск антимикробной меди при эффективных концентрациях в жидкостях таких как раневой экссудат. Это потому что медь — гидролитический металл-ион и по мере увеличения его концентрации при pH типичных топикальных формулировок (то есть около нейтрального), так и ее склонность индуцировать гидролиз и формировать нерастворимые оксо-гидроксиды [18]. При физиологических pH эти оксо-гидроксиды не являются хорошими субстратами для высвобождения растворимых или, следовательно, потенциально эффективных медных ионов [16, 19, 20].

Недавно, с целью нахождения биодоступного железа добавки, проблема эффективного выпуска феррических ионов из концентрированного оксо-гидроксидного источника под физиологическими условиями была решена через структурную модификацию первичных частиц. В той работе железо осаждали в присутствии кристалл-допирующих GRAS лигандов, а именно адипиновой и тартарной кислот, для намеренной дестабилизации финальной феррической оксо-гидроксидной структуры. Эта стратегия имела преимущество (a) предотвращения необратимой агломерации феррических оксо-гидроксидных частиц и (b) значительного увеличения их лабильности (легкости растворимости) под подходящими физиологическими условиями. Этот материал был назван «железо [оксо-]гидроксид адипат тартрат» или IHAT [21, 22]. По аналогии мы рассматривали здесь, может ли медь [оксо-]гидроксид адипат тартрат (CHAT) быть синтезирован и сформулирован при высоких концентрациях но все еще высвобождать медные ионы при эффективных антимикробных уровнях. В частности, цель этой работы — разработать дешевый и масштабируемый синтетический процесс, производящий медные оксо-гидроксид наночастицы, которые, в отличие от ранее сообщенных материалов, должны легко высвобождать биоцидные концентрации медных ионов в симулированной раневой среде.

Таким образом, в этом исследовании мы синтезировали CHAT и характеризовали его способность доставлять биодоступную медь и, следовательно, демонстрировать антимикробную активность. Мы сфокусировались на штаммах Escherichia coli как «индикатор» виде для грам-негативных бактерий [19, 23] но дополнительно продемонстрировали принцип-действующие эффекты против Staphylococcus aureus, как грам-позитивных бактерий, которые часто обретают мультидруг резистентность. Следовательно, исследование целилось оценить ценность развития CHAT дальше для клинических применений в топикальной антимикробной терапии.

Методы

Если не указано иное, все эксперименты выполнялись используя ультра-высокую чистоту (UHP) воду (обратный осмос очистка; 18,2 МОм/см), при комнатной температуре (20 ± 2 °C), и все реактивы приобретались в Sigma Aldrich.

Медные формулировки и CHAT наночастицы

Хлорид меди стоки (40 мМ медь) приготовлены растворением CuCl₂·2H₂O в воде. Медный оксид наночастицы (CuO NPs; Sigma 544868) стоки приготовлялись из коммерческого порошка, свободного от примесей, с первичным размером частицы 34 нм (диапазон 10–50 нм), и ранее тестировались как антимикробный агент [24–26]. Эти стоки готовились при 1,3 г/л меди диспергированием порошка в воде с вигороусной агитацией. Коллоидные суспензии CHAT наночастиц синтезировались ко-выпадением методом [27]. Кратко, хлорид меди, тартраная кислота и адипиновая кислота растворяли в воде для достижения молярного соотношения меди/тартрат/адиплат в финальной суспензии 2:1:1 и медной концентрации 2,5 г/л. Начальный pH смеси всегда был ниже 2,5, и медь полностью растворялась. pH затем медленно повышали капельным добавлением концентрированного NaOH раствора (5 M) с постоянной агитацией до pH 8,2 ± 0,2.

Медное содержание и фазовое распределение CHAT суспензий

Медное содержание в коллоидных суспензиях определяли индуктивно-связанной плазмой-оптической эмиссионной спектрометрией (ICP-OES, Jobin Yvon 2000, Horiba). Все образцы разбавляли до концентраций ниже 100 мг/л в 5% HNO₃ (v/v) по крайней мере за 24 ч до анализа для обеспечения полной растворимости меди. Калибровочные стандарты (0,1 до 100 мг/л меди) были матрично-согласованы в 5% HNO₃, и медная квантификация проводилась на 324,754 нм. Фракционирование меди в проценты агломерированных, наночастичатых и растворимых меди достигалось фильтрацией и ультrafильтрацией CHAT стоков. Суспензии фильтровали (200 нм отсечка), и ретентат считался агломерированной фракцией. Для изоляции растворимой меди и отличия ее от наночастичатой меди, коллоидная суспензия ультrafильтровали через 3-кеД фильтр (Sartorius Vivaspin 500 VS0192; 16 000×g, 5 мин) так как это соответствует отсечке ниже 1 нм (Zetasizer Software 7.11, Malvern Instruments Ltd). Медное содержание всех фракций (общее, 200 нм фильтрат, 3 кД ультrafильтрат) определяли ICP-OES, и фракции выражались в процентах относительно общего медного содержания следующим образом:

$$ {\displaystyle \begin{array}{l}\%\mathrm{Растворимая}\ \mathrm{Медь}\ \left(<1\mathrm{нм}\right)\%\kern0.5em =\frac{\kern0.5em {Cu}_{3\mathrm{кД}}}{Cu_{\mathrm{Total}}}\times 100\\ {}\%\mathrm{Агломерированная}\ \mathrm{Медь}=\frac{\ {Cu}_{\mathrm{Total}}-{Cu}_{<200\mathrm{нм}}\kern0.5em }{Cu_{\mathrm{Total}}}\kern0.5em \times 100\\ {}\%\mathrm{Наночастичатая}\kern0.5em \mathrm{Медь}\kern0.5em =100-\%\mathrm{Агломерированная}\ \mathrm{медь}-\%\mathrm{Растворимая}\ \mathrm{медь}\end{array}} $$

Определение медного содержания и медно-лигандных соотношений в сухих CHAT наночастицах

CHAT наночастицы агломерировали и выпадали для восстановления и удаления несвязанных компонентов. Для этого этанол добавляли к коллоидным суспензиям CHAT (2,5 г/л меди) в соотношении 2:1 этанол/суспензия (v/v), и получившиеся CHAT агломераты восстанавливали центрифугированием (4500×g × 15 мин в Mistral 6000). Растворная фаза, содержащая несвязанные лигандные виды, утилизировалась. Определение медного содержания в твердой фазе CHAT было следующим. Порошок производился духовкой сушкой этанольного выпавшего пеллета до постоянного веса при 45 °C. Это затем мельчили и 35,2 ± 0,3 мг (n = 2) переваривали в 11 ± 1 г 70% HNO₃, с точными весами записанными. После полного переварки этот раствор разбавляли 20-кратно в воде и медная концентрация определялась ICP-OES. Лиганд-медные соотношения определялись прямо из сухих, этанольно-выпавших CHAT агломератов. Агломераты сначала ресуспендировали в воде к их исходному объему для облегчения растворения с меньшими количествами HCl — требование для высокопроизводительной жидкостной хроматографии (HPLC) анализа. Аликвоты либо растворяли в 5% HNO₃ для ICP-OES анализа меди (как описано выше) или в 80 мМ HCl для HPLC анализа лигандов (тартратовой и адипиновой кислот). Лиганд анализ проводился в стандартной обратной фазовой хроматографической системе (C18 колонка в Waters Alliance 2690/5 с 2998 PDA детектором; дальнейшие детали даны в Дополнительном файле 1).

Физико-химическая характеристика CHAT суспензий

Гидродинамическое частичное распределение размера определяли динамическим рассеянием света (DLS; Zetasizer NanoZS, Malvern Instruments Ltd). Аликвоты CHAT коллоидных суспензий (2,5 г/л меди) переносили в 1-ml одноразовую кювету, и измерения (n = 3) проводились при 25 ± 2 °C. Опять же, точные настройки показаны в Дополнительном файле 2. Дзета-потенциал CHAT суспензий определяли лазерным допплеровским микро-электрофорезом (Zetasizer NanoZS, Malvern Instruments Ltd) используя одноразовые сложенные капиллярные ячейки (DTS1070) и предполагая диэлектрическую постоянную 78,5 и вязкость 0,89 цП. Трансляционная электронная микроскопия (TEM) характеристика проводилась применением капли CHAT суспензии к дырявым углеродным перфорированным сеткам и сушкой при 50 °C на ночь. Сетки затем образывали на ТЭМ (FEI-Philips CM100) при 120 кВ в ярком-поле режиме.

Антимикробная активность медных формулировок

Анализы проводились в тяжелом металле MOPS (HMM) среде, признанной металл-ион совместимой средой (Дополнительный файл 3), дополненной 0,4% глюкозы и 0,1% казеиновой кислотной гидролизатом, и pH скорректирован к 7,2 ± 0,2 [28]. До добавления медных соединений, Escherichia coli (NCTC11100) и Staphylococcus aureus RN4220 [29] выращивали на ночь при 30 °C под постоянным взбалтыванием в Infors HT Minitron инкубаторе при 80 об/мин. После этого бактериальные суспензии разбавляли до оптической плотности 0,05–0,1 (ок. 10⁶ клеток/мл) на 595 нм для E. coli (Multiskan RC 351 Labsystem) или 600 нм для S. aureus (Multiskan пластинчатый ридер, ThermoFisher Scientific). Далее, стоки хлорида меди и коллоидного CHAT разбавляли в HMM и добавляли к бактериальным суспензиям для получения финальных медных концентраций между 0,4 и 100 мг/л. Инкубация затем происходила на период 6 до 9 ч, и бактериальный рост определяли мониторингом оптической плотности как меры бактериальной биомассы.

Медная растворимость во времени в бактериальной среде роста определялась разбавлением хлорида меди и коллоидных CHAT стоков в HMM до 12,5, 25 и 50 мг/л меди и определением фракции растворимой меди в 0, 2, 4 и 8 ч через ультrafильтрацию (3 кД) и ICP-OES анализ, как описано выше.

Внутриклеточная биодоступность медных формулировок

Рекомбинантные биолюминесцентные Cu-сенсорные бактерии, E. coli MC1061 (pSLcueR/pDNPcopAlux), которые реагируют на суб-токсичные количества биодоступной меди увеличением своей биолюминесценции использовались для квантификации биодоступности медных соединений [30]. Бактериальные суспензии готовились как описано для антимикробного активности анализа и инкубировали с серией разбавлений хлорида меди и CHAT (0 до 50 мг/л меди) на 96-колодчатых микропластинках на 4 ч. Биолюминесценция измерялась Orion II Plate Люминометром (Berthold Detection Systems), и индукция биолюминесценции рассчитывалась следующим образом:

$$ Bioluminescence\ induction, Fold\ Change=\frac{ Bioluminescence\ in\ Cu\ exposure}{Bioluminescence\ without\ Cu\ } $$

Внутриклеточный стресс индуцированный медными формулировками

Способность медных соединений индуцировать внутриклеточные супероксидные анионы и одиночно-цепочечные ДНК разрывы оценивалась с рекомбинантными биолюминесцентными бактериями, E. coli K12::soxRSsodAlux и E. coli MC1061 (pDEWrecAlux) соответственно [17]. Бактериальные культуры готовились как описано для антимикробного анализа, и бактерии экспонировали к серии разбавлений хлорида меди и CHAT (0 до 50 мг/л меди) на белых 96-колодчатых микропластинках за 4 ч. Биосенсоры производительности контролировали экспонируя бактерии к супероксид-анион-индуцирующему химическому мендиону (0,04–30 мкг/л) или к перекиси водорода (0,1–150 мг/л) как положительные контролы для E. coli K12::soxRSsodAlux или E. coli MC1061 (pDEWrecAlux) соответственно. Снова бактерии инкубировали на белых 96-колодчатых микропластинках и биолюминесценция измерялась Orion II Plate Люминометром и индукция биолюминесценции рассчитывалась как в Уравнении 5.

Включение медных формулировок в гидроксиэтил целлюлозные гели

Стоки хлорида меди, CHAT и коммерческих, немодифицированных медных оксид наночастиц (CuO NPs) разбавляли в UHP воде до 250 мг/л меди. Полученные суспензии CHAT и CuO NPs были при близком к нейтральному pH и могли быть включены прямо в гель, но хлорид меди раствор все еще был кислым после разбавления и поэтому скорректировали к pH 7,0 ± 0,2. Гидроксиэтилцеллюлоза (HEC) затем растворяли прямо (2% w/v) в различные разбавленные стоки используя роликовый миксер (Denley Spiramix 5) до однородных гелей. Десять граммов каждого геля переносили в Falcon трубки и оставляли осесть на ночь. Затем 10 мл свежеприготовленного 50 мМ натрий бикарбонат буфера (растворенного из NaHCO₃ порошка и скорректированного к pH 7,0 ± 0,2) переносили в каждую трубку с заботой минимизировать возмущения на гель-жидкость интерфейсе (специфическая площадь поверхности 7,1 см²). Аликвоты затем собирали и анализировали ICP-OES для определения медного выпуска во времени.

Результаты

Как описано в разделе «Методы», CHAT синтезировали похожим образом к его железному аналогу IHAT [21, 22], допируя медный оксо-гидроксид (2,5 г/л меди) тартратовой и адипиновой кислотами. Это дало стабильные коллоидные суспензии, в которых вся медь проходила через 200-нм фильтр но очень мало (5%) проходило 3-кД фильтр. Это указывало на то, что большинство меди было наночастичатым (95%; Рис. 1a) с малым «свободным» медом и никакими детектируемыми крупными агломератами — снова как IHAT аналог [21, 22]. Когда выпадали в этаноле, для удаления несвязанных лигандных видов, и затем сушили, CHAT содержал 31 ± 1% меди (w/w) по ICP-OES анализу. Медные-лигандные молярные соотношения, последние определенные HPLC, были 2:1 для меди к тартрату и 2:0,3 для меди к адиплату. CHAT частицы казались почти монодисперсными с диаметрами 2–3 нм по ТЭМ образам (Рис. 1b). Эти находки согласовывались с гидродинамическими размерными данными для CHAT плюс гидратационная оболочка так как медианный диаметр по объему в UHP воде был 3,4 нм (Рис. 1c) и распределение размера было узким (2,4–5,6 нм для 80% объема) когда оценивали динамическим рассеянием света. Средний дзета-потенциал был −39 мВ (Рис. 1d), согласованный с наночастицами формирующими стабильную акватированную дисперсию [27], и действительно CHAT сток суспензия показана была стабильной на несколько лет (Дополнительный файл 4).

Характеризация CHAT сток раствора. a Медное фазовое распределение при 2,5 г/л CHAT: растворимая (< 3 кД) и наночастичатая процент. b Наночастица дисперсия образы ТЭМ. c Гидродинамическое частичное распределение размера свежеприготовленных частиц, определенное динамическим рассеянием света. d Дзета-потенциал распределение (n = 3; ошибки полосы представляют стандартные отклонения)

Далее мы рассмотрели антимикробную активность CHAT когда стоковые суспензии разбавляли в бактериальных средах роста к концентрациям ассоциированным с антимикробной активностью медных солей. Для CHAT и хлорида меди кривая ингибирования роста была очень похожа для обоих E. coli и S. aureus с большинством активности происходящей при общих медных концентрациях между 12,5 и 50 мг/л диапазон (Рис. 2). Полная E. coli рост ингибиция наблюдалась при инкубации с 18,8 (CuCl₂) и 25 (CHAT) мг/л меди, в то время как для S. aureus полная рост ингибиция получалась при 75 (CuCl₂) и 100 (CHAT) мг/л меди (Рис. 2; Процент роста ингибиции против медной концентрации предоставлен в Дополнительном файле 5).

Escherichia coli (верх) и Staphylococcus aureus (низ) рост кривые, представленные здесь как оптическая плотность, при экспозиции к разным концентрациям хлорида меди (лево) или CHAT (право) в дополненном HMM.

Действительно, на этих антимикробных концентрациях как минимум 94% CHAT быстро растворился (внутри 15 мин), снова как судилось ультrafильтрацией и ICP-OES анализом (Рис. 3a). Мы поэтому ожидали, что антимикробная эффективность CHAT была связана с этой химической лабильностью, с быстрым растворением наночастиц позволяющим внутриклеточному бактериальному приобретению медных ионов. Для теста этого мы вызвали Cu-сенсорный E. coli, MC1061 (pSLcueR/pDNPcopAlux), в котором биолюминесценция увеличивается в ответ на суб-токсичные концентрации внутриклеточных медных ионов [30], с 0 до 50 мг/л меди как CHAT или хлорид меди. Увеличивающиеся концентрации в культуральной среде обоих источников меди вели к увеличивающейся биолюминесценции в E. coli медном сенсорном штамме (Рис. 3b), согласованной с ростом внутриклеточной меди. Наклон дозы-ответной кривой был идентичным до 6,25 мг/л для обоих источников меди подтверждая, что биодоступная медь из CHAT была сравнима с полностью растворимым источником. После этого, при концентрациях до 50 мг/л меди, люминесценция не увеличивалась из-за токсичности обоих медных соединений (Рис. 3b).

a Растворение профиль CHAT в дополненном HMM при 12,5, 25 и 50 мг/л меди. Доза-ответ биолюминесценции индукции рекомбинантных люминесцентных бактерий: b внутриклеточный медный ион-отвечающий E. coli MC1061 pSLcueR/pDNPcopAlux бактерии, c ДНК повреждение-отвечающий E. coli MC1061 (pDEWrecAlux), и d супероксид анион-отвечающий E. coli K12::soxRSsodAlux при экспозиции на 4 ч в дополненном HMM к хлориду меди, CHAT (концентрация в мг Cu/л), и соответствующим контролям (мендион в c и H₂O₂ в d)

Параллельно изучению внутриклеточной меди в E. coli экспонированных растворам приготовленным с CHAT или хлоридом меди, мы также тестировали способность этих растворов триггерить внутриклеточные супероксидные анионы или вызывать бактериальные ДНК повреждения в разных E. coli-базированных биосенсорах. В ничем случае не было значительно наблюдаемого эффекта, несмотря на сенсоры отвечающие на релевантные положительные контролы, а именно перекись водорода и мендион соответственно (Рис. 3c, d). Взятые вместе, эквивалентные отклики трех бактериальных биосенсоров к растворам приготовленным из разных химических форм меди сильно поддерживают представление что в обоих случаях бактерии были экспонированы к той же растворимой меди, несмотря на одну формулировку начинавшуюся как наночастичатая.

Финально, как отмечалось выше, преимущество CHAT над растворимыми медными солями было бы очевидно только если концентрированная формулировка позволяла бы первому сохранить свою химическую лабильность в отличие от последнего. Используя гидроксиэтил целлюлозу (HEC), обычную водную базу для топикальных формулировок [31–33], мы включили 250 мг/л меди как либо хлорид меди, CHAT, или как коммерческие CuO NPs. Когда 10 мл 50 мМ NaHCO₃ буфера, как упрощенный раневой экссудат, добавляли к 10 г каждого из медных-включенных HEC гелей (то есть 2,5 мг меди), был устойчивый выпуск меди из CHAT-содержащего препарата, до более 60 мг/л к 24 ч (Рис. 4). Более того, выпуск был относительно быстрым с антимикробно активными концентрациями достигаемыми к 2–4 ч. В противовес, pH-нейтрализованный хлорид меди был плохим субстратом для медного выпуска, как предвиделось его склонностью к гидролизу и формированию агломератов медных оксо-гидроксидов, так что к 24 ч только 10 ± 7 мг/л меди было достигнуто в растворе (Рис. 4). Коммерческие CuO NPs не дали никакого различимого медного выпуска вообще (Рис. 4).

Медный выпуск из HEC матриц содержащих CHAT, хлорид меди или медные оксид наночастицы (CuO NPs), все при 250 мг/л меди

Обсуждение

Мы показываем здесь что медный-базированный наноматериал, а именно CHAT, может быть сформулирован при высоких концентрациях, в отличие от ранее описанных медных-базированных наночастиц [34, 35], сохраняя свои свойства как лабильный источник биодоступной меди с антимикробной эффективностью. Как отмечалось выше, синтез CHAT был вдохновлен после многих лет предыдущей работы на железном аналоге IHAT [21, 22]. Это, в свою очередь, было вдохновлено природным решением быстрого минерального обмена in vivo для эффективного рециклинга существенных металл-ионов, где органические молекулы используются для дестабилизации кристаллической структуры первичных минеральных частиц [21, 22]. В синтетических версиях GRAS лиганды включаются в металл оксо-гидроксиды как они формируются в растворе из перекрестно-связывающих полимеров [21, 22]. Через структурную дестабилизацию это обеспечивает лабильность финальной минеральной фазы и также генерирует высоконегативные наночастицы — как демонстрировано дзета-потенциал измерением — которые отталкивают агломерацию и агрегацию, таким образом производя наночастичные суспензии стабильные на годы. Здесь, и как ранее показано для IHAT, тартрат был доминирующим лигандом в достижении этих физико-химических изменений к медной оксо-гидроксидной структуре поскольку его включение было около 3-кратного большим чем адиплат — последний вел себя более как буфер во время синтеза [21, 22].

В отсутствии модификации, свежевыпавший металл оксо-гидроксид будет агломерировать и агрегировать и начнет стареть, где они конденсируют и постепенно увеличивают свою кристалличность. Эти размерные и минеральные фазовые переходы снижают способность структур участвовать в обратной реакции, то есть перерастворяться. Поэтому было неудивительно что когда медный оксо-гидроксид свеже формировался, из pH нейтрализации хлорида меди раствора, по крайней мере некоторая растворимая медь выпускалась в нашем гель-выпуск анализе (Рис. 4), тогда как для коммерческих CuO NPs, которые были агломерированы и состояли из более конденсированной минеральной фазы (то есть оксида меди), не детектировалось медного выпуска. Отсутствие растворения от коммерческих 30 нм наночастиц — которые независимо от их агрегации состояния представляли бы большую площадь поверхности для растворения — показывает что минеральная фаза ключевой драйвер в выпуске медных ионов и что, как отмечалось выше, модификация минеральных первичных частиц, достигнутая здесь через лигандное допирование, действительно требуется для приведения заметного сдвига в растворении характеристик. Более того, синтез CHAT проводился при комнатной температуре, так как высокие синтетические температуры благоприятствуют менее аморфным фазам которые следовательно могут снижать растворение скорости. Также комнатная температура синтеза имеет преимущество снижения энергетических затрат при производстве в масштабе.

Хотя могут быть другие способы формулировать высокие, стабильные концентрации меди позволяющие устойчивый выпуск и быстрое растворение ионов когда требуется, мы не можем представить другой синтез который был бы таким прямолинейным и стоимость товаров (для реактивов) такой низкой. Это важные факторы так как проблема топикальных инфекций и бактериальной резистентности никоим образом не ограничена развитыми странами. Развивающиеся страны все больше страдают от бактериальной резистентности проблем и так доступные эффективные решения срочно требуются [36, 37]. Хотя недостаточно исследований для достижения конкретных решений, есть доказательства что резистентность к токсичным металл-ионам сложнее для бактерий достичь чем резистентность к конвенциональным антибиотикам [7]. Теория основана на идее что медь и серебро вероятно не имеют дискретных путей антимикробной активности но скорее могут воздействовать множественные таргеты включая различные ферментные системы и тем самым дестабилизировать общую бактериальную клеточную структуру [17, 19, 38]. Действительно, показано что бактерии остаются восприимчивыми к меди и определенным другим металл-ионам несмотря на экспозиции веками [6, 7, 39]. Интересно, есть недавние доказательства что металл-базированные антимикробные агенты могут даже возвращать бактериальную чувствительность к конвенциональным антибиотикам несмотря на предварительную резистентность [40, 41].

Заключение

Здесь мы продемонстрировали что проблема биодоступных медных ионов при физиологических pH и высоких концентрациях может быть решена допированием медного наноминерала органическими кислотами, в похожей стратегии к ранее использованной для железных аналогов [21, 22]. Эти медные-базированные наночастицы (названные CHAT) легко растворялись в бактериальной среде, показывая эквивалентное внутриклеточное медное поглощение и антибактериальную активность растворимым медным сольям. Критически, однако, и в отличие от простых медных солей, CHAT может быть сконцентрирован в pH-нейтральной формулировке и сохранять свою лабильность в терминах медного ионного выпуска. Действительно, CHAT высвобождал медные ионы в бактерицидном диапазоне и мог бы быть базой для нового топикального антимикробного агента либо один или усиливающий эффективность резистентных антибиотиков. С растущей антибиотиковой резистентностью новые топикальные антимикробные агенты нужны и CHAT недорог, легко синтезируем и использует компоненты которые вообще признаны безопасными (GRAS). In vivo исследования заслуживают внимания.

Аббревиатуры

CHAT:

Медные [оксо]-гидроксид адипат тартрат наночастицы

CuO NPs:

Медные оксид наночастицы

DLS:

Динамическое рассеяние света

Escherichia coli:

E. coli

GRAS:

В целом признанные безопасные

HEC:

Гидроксиэтилцеллюлоза

HMM:

Тяжелый металл MOPS среда

HPLC:

Высокопроизводительная жидкостная хроматография

ICP-OES:

Индуктивно-связанная плазма-оптическая эмиссионная спектрометрия

IHAT:

Железо [оксо]-гидроксид адипат тартрат наночастицы

MOPS:

3-(N-морфолино) пропансульфоновкислота

Staphylococcus aureus:

S. aureus

UHP:

Ультра-высокая чистота