Биосовместимые наночастицы FePO4:доставка лекарств, стабилизация РНК и функциональная активность

Введение

Среди различных неорганических наночастиц, таких как золото, диоксид кремния и квантовые точки, наночастицы на основе железа (Fe-NP) широко исследуются для биомедицинских приложений, таких как контрастные вещества, средства доставки лекарств и термические терапевтические средства [1,2,3]. Благодаря магнитным свойствам, высокой биоадаптивности и известному эндогенному метаболизму железа Fe-NP являются желательными кандидатами для биомедицинских приложений. Таким образом, Fe-NP составляют большую часть одобренных FDA неорганических наномедицин [1, 2]. К ним относятся INFeD, DexFerrum, Ferrlecit, Venofer, Feraheme и Injectafer, которые коммерчески доступны для применения при железодефицитной анемии и дефиците железа при хронической болезни почек [1]. Точно так же внутривенное введение хелатного глюконата железа является хорошо переносимым вмешательством при анемии [4]. Анемия является одним из наиболее распространенных в мире пищевых продуктов, связанных с дефицитом питательных веществ, и наночастицы на основе железа, такие как FePO ₄ и FeSO ₄ использовался в обогащении пищевых продуктов для предотвращения анемии. Обогащение пищевых продуктов - это процесс добавления питательных микроэлементов в пищу с целью преодоления дефицита питательных веществ у населения [5]. FePO ₄ НЧ представляют особый интерес для обогащения пищевых продуктов из-за их биосовместимости, высокой биодоступности и превосходных сенсорных характеристик, которые не вызывают неблагоприятных органолептических эффектов [6,7,8,9]. Perfecto et al. продемонстрировали FePO ₄ Интернализация НЧ в клетках кишечника человека происходит в основном через транспортер-1 двухвалентного металла (ДМТ-1) и поэтому легко абсорбируется [9, 10]. Feridex® и Revosit® на основе железа - широко используемые контрастные вещества для магнитно-резонансной томографии (МРТ) для МРТ с контрастным усилением [11,12,13,14,15,16]. В свете этих выдающихся отчетов FePO ₄ НП позиционируют себя как хорошее средство доставки. Здесь мы исследовали FePO ₄ в качестве средства доставки лекарственного средства путем загрузки противоопухолевого препарата доксорубицин (DOX). Ион трехвалентного железа (Fe ³⁺ ) может образовывать комплекс с молекулой DOX, чему способствует электростатическое взаимодействие между электронодефицитным Fe в FePO ₄ и обогащенная электронами группа –ОН в DOX с образованием FePO ₄ , нагруженного DOX НЧ:FePO ₄ -DOX НП. Мы оценили физико-химические свойства FePO ₄ . и FePO ₄ -DOX NPs и оценили их профиль биосовместимости и цитотоксичности, соответственно, в клеточной линии остеосаркомы мыши K7M2 и фибробластов NIH / 3T3.

Наряду с этим, неорганические наночастицы показали себя многообещающими в стабилизации и доставке нуклеиновых кислот [17,18,19]. В этом отношении наночастицы золота широко изучаются из-за их способности иммобилизовать олигонуклеотиды на своей поверхности, что предотвращает агрегацию и деградацию молекул [17, 20]. Однако золото не является эндогенным элементом и, таким образом, может ограничивать его трансляционное применение. Здесь наночастицы на основе Fe, такие как FePO ₄ наночастицы могут представлять первоочередной интерес для изучения стабилизации РНК из-за их эндогенной природы и установленного профиля биосовместимости. Существует два предложенных механизма взаимодействия нуклеиновой кислоты (РНК / ДНК) с Fe-NP для стабилизации - (1) образование водородных связей и электростатическое взаимодействие между фосфатной группой основной цепи нуклеиновой кислоты и Fe-NP, приводящее к адсорбции нуклеиновых кислот. кислота в Fe-NPs, и (2) нуклеиновая кислота может адсорбироваться на поверхности Fe-NPs посредством взаимодействия пар нуклеотидных оснований [19, 21, 22]. Исследование показало потенциал наночастиц фосфата кальция для стабилизации и доставки ДНК-вакцины [23]. В связи с этим мы исследовали стабилизацию РНК и функциональную активность другой наночастицы на основе фосфата, FePO ₄ , чтобы исследовать многофункциональный потенциал FePO ₄ на основе наночастиц, при доставке и стабилизации грузов.

С быстрым утверждением мРНК-вакцины против COVID19, наночастицы мРНК-вакцины представляют большой интерес, поскольку РНК подвержена быстрому гидролизу и потере функциональной экспрессии, наночастицы должны улучшить эти критические характеристики. Здесь мы показываем FePO ₄ НЧ стабилизируют РНК и поддерживают функциональную трансляцию мРНК. Учитывая эти отличные характеристики, FePO ₄ НЧ могут быть рассмотрены для обогащения пищевых продуктов, доставки лекарств и РНК, открывая захватывающие биомедицинские приложения.

Результаты и обсуждение

FePO ₄ Синтез НЧ, характеристика и анализ биосовместимости

Простая одностадийная химическая реакция между (NH ₄ ) ₃ ЗП ₄ и Fe (NO ₃ ) ₃ дает FePO ₄ в виде осадка, диспергированного в биосовместимом поверхностно-активном веществе липид-ПЭГ, который помогает стабилизировать FePO ₄ наночастицы и предотвращают агрегацию. FePO ₄ НЧ показали гидродинамический размер 175 ± 5 нм с индексом полидисперсности (PDI) 0,150 ± 0,01, что свидетельствует о хорошей однородности частиц и узком распределении по размерам. Анализ дзета-потенциала показал отрицательный поверхностный заряд FePO ₄ НЧ с дзета-потенциалом - 19,1 ± 8 мВ. Отрицательный поверхностный заряд дополнительно помогает стабилизировать частицы в коллоидах, тем самым предотвращая опсонизацию белков, механизм, который предотвращает нацеливание на клетки и изменяет фармакокинетику [24,25,26]. FePO ₄ был дополнительно охарактеризован с помощью FTIR. На рис. 1в показаны спектральные характеристики FePO ₄ . наночастицы и их предшественник - Fe (NO ₃ ) ₃ и (NH ₄ ) ₃ ЗП ₄ . FePO ₄ спектры показывают отчетливый резкий пик на 1030 см ⁻¹ что можно отнести к полосе валентных колебаний P – O, небольшому пику при 520 см ⁻¹ соответствует антисимметричному изгибу O – P – O и имеет широкий диапазон от 3000 до 3500 см ⁻¹ представляет собой изгибные и валентные колебания воды от молекул адсорбированной воды [27, 28]. FePO ₄ спектры показали присутствие PO ₄ ^3– группы и аналогичны пику FTIR, полученному в других исследованиях, что подтверждает образование FePO ₄ наночастицы [27,28,29]. Fe (NO ₃ ) ₃ спектры показали характерные пики валентных полос N – O при 1326 и 813 см ^-1 [30]. Пик на уровне 1625 может быть отнесен к изгибной вибрации –OH, а широкий пик около 3000 см ⁻¹ можно отнести к изгибным и валентным колебаниям воды [30]. Аналогичным образом (NH ₄ ) ₃ ЗП ₄ показал характерные пики для группы аммония около 1500 см ^-1 и фосфатная группа около 1000 см ^-1 [31]. Отсутствие пиков нитрата и аммония в FePO ₄ наночастицы позволяют предположить, что в продукте отсутствуют побочные продукты, и подтверждают чистоту синтеза.

Характеристика и биосовместимость FePO ₄ наночастицы. а Гидродинамическое распределение FePO ₄ по размерам НП, б измерение дзета-потенциала FePO ₄ НЧ, показывающие поверхностный заряд, c FTIR FePO ₄ НЧ и его предшественник-Fe (NO ₃ ) ₃ и (NH ₄ ) ₃ ЗП ₄ , и d биосовместимость FePO ₄ НЧ на линии клеток остеосаркомы K7M2 мыши и фибробластов мыши NIH / 3T3. НЧ обрабатывали при различных концентрациях в течение 48 ч ( a, b данные представляют собой среднее ± стандартное отклонение; нет =3 повторности. г представляет среднее ± стандартное отклонение, n =6 повторов).

С гарантией успешного синтеза, чистоты, хорошей однородности по размеру и стабильного заряда поверхности FePO ₄ НЧ мы продолжили анализ биосовместимости FePO ₄ НП. Для этой цели мы использовали раковые и нераковые клетки:мышиную остеосаркому K7M2 и мышиный фибробласт NIH / 3T3 и проанализировали биосовместимость НЧ при различных концентрациях с точки зрения жизнеспособности клеток с помощью теста МТТ. FePO ₄ НЧ показали зависящую от концентрации биосовместимость в обеих клеточных линиях - K7M2 и NIH / 3T3 в диапазоне концентраций от 20 до 600 мкг / мл (рис. 1d). FePO ₄ НЧ показали хорошую биосовместимость до концентрации 80 мкг / мл при жизнеспособности клеток более 70%. Биосовместимость была относительно выше в нераковых клетках NIH / 3T3 по сравнению с раковыми клетками K7M2.

Загрузка доксорубицина в FePO ₄ и цитотоксичность FePO ₄ -DOX

Доксорубицин загружается в FePO ₄ с помощью метода совместной инкубации-осаждения, в котором раствор доксорубицина смешивают с предшественником FePO ₄ что приводит к образованию загруженного DOX FePO ₄ . Как описано в методах, используются три различных состава для загрузки DOX. Состав 1 показал наилучшую эффективность загрузки 26,81% ± 1, тогда как состав 2 показал эффективность загрузки 8,83% ± 2, а состав 3 не показал никакой загрузки (фиг. 2a). Для загрузки мы добавили раствор DOX к прекурсору Fe (NO ₃ ) ₃ в составе 1 и в (NH ₄ ) ₃ ЗП ₄ в составе 2, тогда как в составе 3 мы добавили раствор DOX в FePO ₄ НП напрямую. Данные загрузки ясно показали, что добавление DOX к FePO ₄ НЧ не удерживают DOX, тогда как добавление DOX к любому из предшественников:Fe (NO ₃ ) ₃ и (NH ₄ ) ₃ ЗП ₄ раствор помогает в загрузке и удержании DOX. Это можно объяснить тем, что Fe ³⁺ из Fe (NO ₃ ) ₃ может образовывать комплекс с богатой электронами кислородной группой, присутствующей в доксорубицине [32, 33]. Fe ³⁺ -DOX комплекс затем осаждают добавлением (NH ₄ ) ₃ ЗП ₄ в результате получается FePO ₄ -DOX, который характеризуется изменением цвета от бледно-желтого до бледно-коричневого (рис. 2b). Несмотря на изменение цвета, эмиссионные спектры FePO ₄ не изменились. -DOX, который показал максимумы испускания при 590 нм, аналогичные таковому для Free DOX при возбуждении на 480 нм (рис. 2c). FePO ₄ -DOX НЧ показали гидродинамический размер 187 ± 7 нм и PDI 0,143 ± 0,02, аналогичный таковому у FePO ₄ (Рис. 2d). Однако имелась значительная разница в поверхностном заряде FePO ₄ . -DOX НЧ (-8,89 ± 5 мВ) по сравнению с FePO ₄ NP (-19,1 ± 8 мВ) (рис. 2д). Изменение дзета-потенциала предполагает функциональные изменения поверхностных свойств наночастиц. Здесь снижение дзета-потенциала с -19,1 до -8,89 мВ может быть связано с комплексообразованием DOX, которое добавляет катионному свойству в комплекс.

Загрузка доксорубицина (DOX) в FePO ₄ НЧ и характеристика FePO ₄ -ДОКС. а Эффективность загрузки DOX в трех различных составах FePO ₄ НП и ДОКС, b графическое изображение изменения цвета с желтого на коричневый после загрузки DOX в FePO ₄ для составления FePO ₄ -DOX, c характеристика спектров излучения загруженного DOX FePO ₄ НЧ (FePO ₄ -DOX) после возбуждения на 480 нм, d гидродинамическое распределение FePO ₄ по размерам -DOX NP и e характеристика дзета-потенциала FePO ₄ -DOX NPs, показывающие поверхностный заряд (данные представляют собой среднее ± стандартное отклонение; n =3 повтора)

После физико-химической характеристики цитотоксичность FePO ₄ -DOX анализировали в клетках K7M2 и NIH / 3T3 и сравнивали со свободным DOX (фиг. 3). FePO ₄ -DOX показал более высокую цитотоксичность по сравнению со свободным DOX при эквивалентной концентрации DOX в обеих клеточных линиях. Значение IC50 снизилось примерно в 10 раз с FePO ₄ -DOX обработка, от 2,61 до 0,248 мкМ в NIH / 3T3 и от 1,01 до 0,107 мкМ в клетках K7M2. Столь резкое снижение значения IC50 в обеих клеточных линиях предполагает усиленный профиль цитотоксичности FePO ₄ -DOX НП. Эквивалент FePO ₄ концентрация в диапазоне концентраций IC50 FePO ₄ -DOX составляет 40 мкг / мл (0,107 мкМ в клетках K7M2) и 100 мкг / мл (0,248 мкМ в клетках NIH / 3T3), которые оба находятся в диапазоне биосовместимости FePO ₄ концентрация, с жизнеспособностью более 70% клеток. Следовательно, повышение содержания FePO ₄ Цитотоксичность -DOX можно отнести к Fe ³⁺ -DOX комплекс, а не индивидуальный вклад FePO ₄ и DOX. В литературе показан повышенный цитотоксический эффект антрациклина, подобного доксорубицину, в присутствии железа [34,35,36,37]. Эти сообщения дополнительно подтверждаются снижением цитотоксичности Fe-DOX за счет использования хелаторов железа [35,36,37]. Один из предложенных механизмов заключается в том, что комплекс Fe-DOX потенцирует токсичность образованных из DOX активных форм кислорода (АФК), трансформируя относительно безопасные АФК (O ^{2 ·} - и H ₂ О ₂ ) в гораздо более токсичные АФК, что приводит к повышенному повреждению ДНК и гибели клеток [34, 36]. Другой предполагаемый механизм - это взаимодействие DOX с функцией регуляторных белков железа и ферритина в присутствии избытка Fe, тем самым влияя на гомеостаз железа, что приводит к ROS-зависимым и независимым повреждениям и апоптотической гибели клеток [36, 38].

Цитотоксичность FePO ₄ -DOX НП. а, б Цитотоксичность свободного доксорубицина (DOX) и FePO ₄ -DOX NP в клеточной линии фибробластов NIH / 3T3 мыши и остеосаркомы K7M2, соответственно, при различных концентрациях эквивалента DOX. Цитотоксичность анализировали в процентах жизнеспособности клеток после обработки частицами в течение 48 часов. c, d Сравнение процентной жизнеспособности клеток FePO ₄ -DOX NPs и свободный DOX в клеточных линиях NIH / 3T3 и K7M2, соответственно, при эквивалентной концентрации DOX. На вставке в середине представлены значения IC-50 для свободного DOX и FePO ₄ -DOX NP в клетках NIH / 3T3 и K7M2 (данные представляют собой среднее ± стандартное отклонение; n =6 повторов)

Наряду с повышенной цитотоксичностью, FePO ₄ -DOX показал селективность в отношении раковых клеток с более высокой цитотоксичностью, аналогичной таковой у Free DOX. На рис. 3c показан FePO ₄ , эквивалентный 0,1 мкМ DOX. -DOX показал 53% жизнеспособности раковых клеток K7M2 по сравнению с 72% жизнеспособности нераковых клеток NIH / 3T3. Аналогичным образом, Free DOX также показал более высокую цитотоксичность в отношении раковых клеток:жизнеспособность клеток составляла 54% в клетках K7M2 по сравнению с 66% в клетках NIH / 3T3. Однако в случае FePO ₄ различия увеличились. -DOX, с 19% различиями в жизнеспособности раковых и нераковых клеток по сравнению с 12% в Free DOX. Анализ цитотоксичности показал, что комплексообразование Fe с DOX в FePO ₄ -DOX NP значительно повысили цитотоксичность и улучшили селективность в отношении раковых клеток.

Клеточная интернализация FePO ₄ -DOX НП

Поведение интернализации FePO ₄ -DOX NPs анализировали с помощью конфокальной микроскопии после исследования интернализации в зависимости от времени (рис. 4). Свободный DOX использовали в качестве положительного контроля. Оба FePO ₄ -DOX NPs и свободный DOX не показали значительной интернализации в начальные моменты времени инкубации 0,5 и 1 ч. Однако через 3 ч инкубации оба показали интернализацию, о чем свидетельствует красная флуоресценция DOX на конфокальном изображении. Синий цвет обусловлен окрашиванием ядра с помощью DAPI. Анализ показывает, что в течение 3 ч FePO ₄ НЧ -DOX интернализуются в клетки, следуя поведению интернализации, аналогичному поведению Free DOX. Важно отметить, что из-за изменения цвета FePO ₄ -DOX, который имеет коричневатый оттенок по сравнению с красным цветом Free DOX, мы не можем количественно сравнивать относительный профиль интернализации FePO ₄ -ДОКС. Тем не менее, анализ интернализации подтвердил, что FePO ₄ -DOX поглощается клетками в течение 3 часов. Учитывая хорошо изученный механизм обработки железа нашим организмом, предлагаемые НЧ могут иметь многообещающие перспективы в разработке противоопухолевых препаратов на основе железа, способных контролировать терапевтический ответ за один сеанс терапии.

Исследование клеточной интернализации. Клеточная интернализация FePO ₄ -DOX NPs и свободный DOX на клетках K7M2 после 3 ч, 1 ч и 0,5 ч обработки. Клетки обрабатывали 200 мкл DOX с концентрацией 5 мкг / мл. Красный цвет, наблюдаемый в клеточной линии, обработанной наночастицами, означает успешную интернализацию наночастиц. Красный цвет обусловлен характеристикой флуоресценции DOX. В необработанной контрольной ячейке красный сигнал не наблюдается

Стабилизация РНК и экспрессия мРНК

Как видно на рис. 5a, в то время как наночастицы меди (Cu NP) и углеродные нанотрубки (CNT) ускоряют гидролитическую деградацию РНК (более низкая интенсивность полосы, чем в контрольном), FePO ₄ и контрольные наночастицы серебра (Ag) стабилизируют РНК, о чем свидетельствует относительно высокая интенсивность полосы при электрофорезе в РНК-агарозном геле (RAGE). FePO ₄ и контрольные наночастицы оксида цинка (ZnO NP) также придают некоторую устойчивость к деградации в сыворотке, о чем свидетельствует интенсивность полосы, которая немного выше, чем у контрольных образцов (фиг. 5b). Важно отметить, что функциональная активность, экспрессия мРНК выше, чем у контролей, не связанных с наночастицами, тогда как разлагающие РНК Cu NP вызывают потерю экспрессии мРНК, измеряемую относительными световыми единицами (рис. 5c). Эти результаты показывают, что FePO ₄ НЧ помогают стабилизировать РНК и могут использоваться в качестве стабилизирующего агента доставки для терапевтической доставки РНК. Более ранние предварительные эксперименты показали нормальный рабочий диапазон трансляции. Показанные два независимых эксперимента для контрольных образцов, не обработанных наночастицами, показывают 2393 и 2630 RLU / лунку, что является репрезентативным. Двукратное увеличение, согласующееся с приведенными выше данными, предполагает, что FePO44 NP поддерживает трансляцию, тогда как в соответствии с денатурацией / деградацией РНК, описанной выше, Cu NP подавляет трансляцию. Для стабилизации и доставки терапевтической РНК использовались различные системы неорганических наночастиц, в том числе; золото, серебро, медь, оксид железа, мезопористые наночастицы кремнезема (MSN), полимеры на основе углерода, композиты и другие [39–45]. Например, наша группа сообщила, что комплексообразование наночастиц с макромолекулярной РНК может заставить ее сопротивляться деградации РНКазой или нуклеазами, присутствующими в сыворотке и тканях. Вакцина мРНК COVID-19 возобновила интерес к таким методам лечения макромолекулярной РНК, выходящим за рамки вакцин, где наночастица должна не только защищать РНК от гидролиза и опосредованного нуклеазами расщепления, но и комплексообразование с NP должно сохранять функцию РНК, например , экспрессия мРНК. Ранее мы видели, как макромолекулярная РНК, образующая комплекс с наночастицами меди, вызывает денатурацию РНК [46]. Таким образом, мы исследовали эффекты комплексообразования NP с макромолекулярной РНК, используя дрожжевую РНК Torula (TY-РНК) или мРНК репортерной конструкции, экспрессирующую люциферазу.

Гидролиз РНК. а Использовали модельную РНК, которую мы использовали в ряде наших публикаций, аналогичную по размеру и составу последовательности большинству мРНК из дрожжевых грибов торула (TY-РНК). РНК инкубировали в бидистиллированной воде в течение времени в присутствии или в отсутствие наночастиц меди (Cu NP), фосфата железа (FePO4), серебра (Ag NP) или углеродных нанотрубок (CNT) при 37 градусах Цельсия и образцы удаляли при в тот же момент времени и анализировали с помощью электрофореза в РНК-агарозном геле (RAGE). Потеря интенсивности окрашивания полосы указывает на деградацию РНК, тогда как сохранение интенсивности окрашивания полосы РНК указывает на стабилизацию. б Как и выше, РНК инкубировали в 10% FBS / DMEM при комнатной температуре в присутствии оксида цинка (ZnO) NP или FePO ₄ NP по сравнению с контролем, который представлял собой только РНК в отсутствие наночастиц. Снова образцы удаляли с течением времени и анализировали с помощью RAGE. Присутствие окрашенной полосы РНК с течением времени снова указывает на стабильность и устойчивость к расщеплению нуклеазой или РНКазой из сыворотки. c мРНК, кодирующая люциферазу, транслировалась in vitro из стандартных ретикулоцитов кролика, и относительная люминесценция стандартизировалась по РНК в присутствии или в отсутствие фосфата железа (FePO ₄ ) или наночастицы меди (Cu)

Заключение

FePO ₄ Наночастицы были успешно синтезированы с помощью простой методики совместной инкубации-осаждения, что привело к образованию частиц однородного размера 175 ± 5 нм. FTIR-анализ подтвердил наличие фосфатной группы и отсутствие примесей-предшественников в наночастице. Анализ биосовместимости выявил биосовместимость, зависящую от концентрации, с более чем 70% жизнеспособностью клеток до 80 мкг / мл. Далее, DOX эффективно загружался в FePO ₄ . в результате получается FePO ₄ -DOX НЧ, которые показали сходные физико-химические свойства с FePO ₄ . Анализ цитотоксичности показал, что комплексообразование Fe с DOX в FePO ₄ -DOX NP усиливают цитотоксичность с примерно 10-кратным улучшением IC50 и улучшают селективность в отношении раковых клеток. Кроме того, анализ интернализации показал FePO ₄ НЧ -DOX эффективно интернализовались в клетках через 3 часа инкубации. Исследование стабилизации РНК показало, что FePO ₄ наночастицы эффективно стабилизируют РНК, предотвращают быструю деградацию и поддерживают функциональную активность, демонстрируя перспективы доставки терапевтической РНК. Учитывая хорошую однородность размера, диапазон биосовместимости, эффективность загрузки лекарственного средства, улучшенный профиль цитотоксичности, свойство стабилизации РНК и эффективное клеточное поглощение, FePO ₄ НЧ показали желательные характеристики для средств доставки лекарств и РНК. Кроме того, результаты показали многообещающие перспективы использования FePO ₄ . -лекарственные НП в пищевых добавках для разработки платформы пищевых продуктов.

Методы

Синтез и характеристика FePO ₄ Наночастицы

FePO ₄ наночастицы были синтезированы методом оптимизации метода химического осаждения Соколовой и соавт. [47]. Вкратце, фосфат аммония ((NH ₄ ) ₃ ПО _4, 16 мг / мл) и нитрата железа (Fe (NO ₃ ) _3, 8 мг / мл) раствора. К 1 мл Fe (NO ₃ ) ₃ , 1 мл (NH ₄ ) ₃ ЗП ₄ добавляли по каплям при постоянном перемешивании, что приводило к осаждению фосфатов железа (FePO ₄ ). Превышение (NH ₄ ) ₃ ЗП ₄ было использовано так, чтобы все Fe из Fe (NO ₃ ) ₃ осадок в виде FePO ₄ Образовавшийся таким образом раствор фосфатов железа промывали водой 3 раза для удаления побочных продуктов центрифугированием при 300 g в течение 2 мин. Наконец, FePO ₄ осадок диспергировали раствором DSPE-PEG-COOH (10% мас. / мас.) в воде с получением FePO ₄ наночастицы. FePO ₄ НЧ были охарактеризованы по размеру и свойствам поверхности с использованием динамического рассеяния света (DLS), а спектральные характеристики с использованием инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (FTIR).

Загрузка доксорубицина (DOX) на FePO ₄ Наночастицы

Доксорубицин был загружен в FePO ₄ наночастицы методом совместной инкубации-преципитации. Три разных DOX-FePO ₄ Составы НЧ были исследованы для оптимизации максимальной эффективности загрузки. В первой рецептуре DOX-FePO ₄ НЧ были приготовлены путем добавления 100 мкг DOX в 1 мл Fe (NO ₃ ) ₃ (8 мг / мл) с последующим добавлением 1 мл (NH ₄ ) ₃ ЗП ₄ (16 мг / мл) по каплям при постоянном перемешивании. Во втором составе 100 мкг DOX сначала добавляли к 1 мл (NH ₄ ) ₃ ЗП ₄ (16 мг / мл) с последующим добавлением 1 мл Fe (NO ₃ ) ₃ (8 мг / мл) по каплям при постоянном перемешивании. В третьих составах к FePO ₄ было добавлено 100 мкг DOX. Раствор НП. Таким образом сформулирован FePO ₄ -DOX НЧ трижды промывали водой и количеством доксорубицина в FePO ₄ -DOX определяли количественно спектрофлуориметрически путем измерения возбуждения и испускания DOX при 490 нм и 595 нм.

Эффективность загрузки DOX рассчитывалась по следующему уравнению:

Биосовместимость FePO ₄ НЧ и цитотоксичность FePO ₄ -DOX НП

Биосовместимость FePO ₄ НЧ и цитотоксичность FePO ₄ НЧ -DOX анализировали в остеосаркоме мыши K7M2 и фибробласте мыши NIH / 3T3 с использованием анализа МТТ в соответствии с установленным протоколом [48, 49]. Вкратце, 10000 клеток высевали в 96-луночные планшеты и инкубировали в течение 24 часов при 37 ° C и 5% CO ₂ . инкубатор. Затем среду удаляли и свежие среды с различными концентрациями наночастиц обрабатывали клетки и оставляли для инкубации на 48 часов. Контрольные клетки поддерживали только средой. FePO ₄ Концентрация НЧ составляет от 20 до 600 мкг / мл, а концентрация DOX - от 0,05 до 5 мкМ. После инкубации NP среду удаляли и клетки инкубировали с раствором МТТ (0,5 мг / мл) в бессывороточной среде в течение 2 часов, чтобы обеспечить образование кристаллов формазана. Раствор МТТ удаляли, кристаллы формазана растворяли в ДМСО и оставляли на 15 мин при комнатной температуре для надлежащего перемешивания. Затем измеряли оптическую плотность раствора ДМСО при 550 нм с помощью считывающего устройства для микропланшетов (BioTek, Synergy H1 Hybrid Reader) и рассчитывали процент жизнеспособности клеток.

Клеточная интернализация с помощью конфокальной микроскопии

Клеточная интернализация FePO ₄ -DOX NPs анализировали в клетках остеосаркомы мыши K7M2 с помощью конфокальной микроскопии [49,50,51]. Вкратце, 12000 клеток высевали в 8-луночные планшеты и инкубировали в течение 24 часов при 37 ° C и 5% CO ₂ . инкубатор. Затем 200 мкл DOX с концентрацией 5 мкг / мл в среде обрабатывали в течение 3 часов и клетки фиксировали 4% параформальдегидом для визуализации. Ядро окрашивали DAPI, и клетки наблюдали под конфокальным лазерным сканирующим микроскопом (Carl Zeiss, LSM-700). Здесь максимум эмиссии DOX при 560 нм можно использовать для отслеживания его интернализации, которая дает красный цвет в конфокальной микроскопии. С использованием того же протокола был проведен зависимый от времени анализ интернализации путем инкубации FePO ₄ -DOX NP и свободный DOX на 0,5, 1 и 3 часа соответственно.

Стабильность и экспрессия РНК

РНК дрожжей Torula (Sigma-Aldrich) растворяли в концентрации 1 мг / мл в стерильной деионизированной воде и аликвоты по 2 мкг подвергали воздействию наночастиц 20 мкг / мл (CNT, Cu, Ag, ZnO NP или FePO ₄ ) инкубировали при 37 ° C и анализировали с помощью электрофореза в РНК-агарозном геле, как мы ранее сообщали [42, 52]. Момент времени, показанный на рис. 5, приходится на ночь. Точно так же РНК с наночастицами или без них подвергали воздействию 10% FBS / DMEM и снова анализировали с помощью RAGE, как указано выше. мРНК fLuc получали от Trilink Biotechnologies, 2 мкл инкубировали в ретикулуазате кролика с добавлением метинина, цистеина и лейцина (ProMega Corp) в течение 30 градусов в течение 1,5 ч с наночастицами 20 мкг / мл или без них, с добавлением стандартного реагента люциферина и измерением люминесценции. снято на планшет-ридере Biotek Synergy H1 в стандартных условиях.

Статистический анализ

Все данные представляют не менее трех независимых повторов и выражены как среднее ± стандартное отклонение. когда возможно. Cell viability data includes six replicates.

Availability of Data and Materials

The datasets used and/or analyzed during the current study are available from the corresponding author on reasonable request.