Водорастворимый фуллеренол с оптимизированными гидроксильными группами усиливает двухфотонную фотодинамическую инактивацию инфекционных микробов

Аннотация

Успешно получен водорастворимый фуллеренол [C₆₀(OH)₄₆], демонстрирующий высокий квантовый выход единичного кислорода и эффективно генерирующий реактивные формы кислорода. Кроме того, водорастворимый C₆₀(OH)₄₆ с более высоким содержанием экспонированных гидроксильных групп обладает превосходной двухфотонной стабильностью и характеристиками по сравнению с аналогом с более низким содержанием таких групп. Следовательно, полученный фуллеренол может быть эффективным двухфотонным фотосенсибилизатором. Водорастворимый C₆₀(OH)₄₆ обладает благоприятными двухфотонными свойствами. В ходе двухфотонной фотодинамической терапии водорастворимый C₆₀(OH)₄₆ проявил существенную антимикробную активность против Escherichia coli на ультра-низком энергетическом уровне 211.2 нДж/пиксель при 800 сканированиях и длине волны фотоэкскации 760 нм.

Введение

За последние десятилетия синтезировано множество молекул фотосенсибилизаторов (ФС) [1]. Однако клиническое применение существующих ФС сопряжено с рядом проблем. Большинство ФС гидрофобны и легко агрегируются в водных средах, снижая свой квантовый выход (КВ) [2]. Более того, агрегированные ФС нельзя просто вводить внутривенно. Селективная аккумуляция молекул ФС в пораженных тканях также необходима для предотвращения повреждения здоровых клеток. Из-за этих проблем разработка эффективного носителя ФС остается главной задачей фотодинамической терапии (ФДТ). Соответственно растет интерес к использованию наночастиц как носителей ФС.

Прогресс в нанобиотехнологиях стимулировал интерес к биомедицинским приложениям нового класса наноструктур [3–11], состоящих исключительно из атомов углерода, а именно фуллерена C₆₀, которые являются сфероидными молекулами (диаметр 0.72 нм), нетоксичными и обладающими уникальными физико-химическими свойствами. Малый размер липофильных молекул C₆₀ отвечает за их стерическую совместимость с биологическими молекулами и способствует интеграции в гидрофобные области мембран [12, 13]. Благодаря расширенной π-конъюгированной системе своих молекулярных орбиталей фуллерен C₆₀ поглощает ультрафиолетово-видимый (УФ-Vis) свет и может генерировать реактивные формы кислорода (РФК) с почти 100% квантовым выходом единичного кислорода (Φ_Δ). Физико-химические свойства фуллерена C₆₀ позволяют ему генерировать РФК и служить ФС для ФДТ. Фуллерены также могут индуцировать прооксидантные эффекты, что может зависеть от используемого фуллерена, типа клеток и экспериментальной установки [14–17]. C₆₀ имеет крайне низкую растворимость в полярных растворителях, что значительно ограничивает его медицинские применения. Однако из-за наличия двойных связей C₆₀ легко модифицируется химическими группами для повышения водорастворимости. Поэтому водорастворимые производные C₆₀ открывают расширенные возможности для медицинских применений, включая нейропротекцию, доставку лекарств и генов, фотосенсибилизацию и биосенсирование.

Многофотонная лазерная микроскопия (также известная как двухфотонная лазерная микроскопия) предполагает использование локализованного «нелинейного» возбуждения для возбуждения флуоресценции только в тонкой растрированно-сканируемой плоскости. Двухфотонная лазерная микроскопия использовалась в различных визуализационных исследованиях [18]. Обычно она связывается с ближним инфракрасным (БИК) лазерным возбуждением для использования максимальной тканевой пропускания для биообраза; это потому, что БИК имеет преимущества: слабое рассеяние, низкое энергетическое поглощение, оптимальное проникновение излучения и уменьшенное фотобеленее образцов. Связывание двухфотонной лазерной микроскопии с БИК лазерным возбуждением стало предпочтительной техникой для флуоресцентной микроскопии в толстых тканях и более глубоких биологических образцах [19, 20] и широко применяется в других фотоэкскационных терапиях [21, 22]. Кроме того, благодаря своей ультра-низкой энергии и короткой фотоэкскации, двухфотонная лазерная микроскопия рассматривается как альтернативный подход к проведению ФДТ [23]. Хотя некоторые ФС токсичны [24, 25], приоритет отдается тем с высоким Φ_Δ для проведения ФДТ. Высокое значение Φ_Δ особенно желательно при использовании двухфотонных техник для оценки молекулярной активности в фотосвойствах и эффективном проведении нелинейных микроскопических исследований; такое значение желательно, потому что отношение поглощенной энергии к входному энергетическому потоку к образцу высоко, минимизируя возможный фотоваред образцу [26]. Однако в литературе нет исследований, рассматривающих использование материалов с двухфотонными свойствами для ФДТ. Для заполнения этого пробела в настоящем исследовании применялся водорастворимый гидроксилированный фуллеренол с сильной электроно-донорной способностью и большой π-конъюгированной системой для повышения эффективности зарядопереноса, тем самым улучшая двухфотонные свойства. Конкретно, водорастворимый гидроксилированный C₆₀(OH)₄₆ был получен и применен как двухфотонный ФС для эффективного удаления микробов с использованием ультра-низкоэнергетического фемтосекундного лазерного облучения и только 800 сканирований под двухфотонным возбуждением (ДФВ; длина волны возбуждения, 760 нм). Для ультра-низкоэнергетического фемтосекундного лазерного облучения энергия составляла 211.2 нДж/пиксель, мощность — 2.112 мВт (расчет мощности латера после объектива см. в разделе «Материалы и методы» и рис. 1a, где x–y фокальная точка и z-осевое разрешение лазерной системы составляют примерно 0.37538 и 0.90159 мкм соответственно); для процесса сканирования общее эффективное время экспозиции составляло примерно 3.2621 с, скорость сканирования 4.0776 мс/сканирование, площадь сканирования 200 × 200 мкм² (подробности расчета см. в разделе «Материалы и методы»). Водорастворимый гидроксилированный C₆₀(OH)₄₆ достиг почти 100% элиминации Escherichia coli (E. coli, грамотрицательный бактериальный штамм). Кроме того, водорастворимый C₆₀(OH)₄₆ с более высоким составом гидроксильных групп проявил превосходные двухфотонные фотосвойства по сравнению с тем, что с более низким составом гидроксильных групп под ДФВ; поэтому полученный водорастворимый C₆₀(OH)₄₆ можно считать обладающим значительным потенциалом для использования в одновременной ФДТ для элиминации злокачественных микробов.

Материалы и методы

Приготовление и характеристика водорастворимых фуллеренолов, C₆₀(OH)₂₁ и C₆₀(OH)₄₆ [27]

Сырой фуллерен получен коммерчески (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, MO, США), и предшественник C₆₀(OH)₁₂ производили, как описано ранее. Во-первых, 30% раствор перекиси водорода (100 мл; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, MO, США) добавляли к исходному материалу, 0.5–1.0 г C₆₀(OH)₁₂, и смесь интенсивно перемешивали при 60 °C под воздухом. После охлаждения в раствор добавляли смесь растворителей, состоящую из 2-пропанола, диэтилового эфира и гексана (100–200 мл каждого; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, MO, США), затем центрифугировали и декантировали. Оставшееся твердое тело дважды промывали 200 мл диэтилового эфира через центрифугацию и декантацию. Наконец, конечные продукты водорастворимого C₆₀(OH)₂₁ и C₆₀(OH)₄₆ получали сушкой остатка в вакууме при комнатной температуре на ночь соответственно. Масса конечного продукта калибровалась термогравиметрическим анализом. Морфологию конечного продукта наблюдали с помощью высокоразрешающей передаточной электронной микроскопии (HR-TEM, JEOL 3010, Акишима, Токио, Япония) с разрешением примерно 1.11 ± 0.03 нм и 1.13 ± 0.04 нм для C₆₀(OH)₂₁ и C₆₀(OH)₄₆ соответственно. Динамическое рассеяние света (DLS, Malvern Nano-ZS90, Вустершир, Вест Мидлендс, UK) также использовали для определения размера материалов. Экспонированные функциональные группы полученных материалов впервые изучали фурие-преобразованием инфракрасной (FTIR) спектроскопии (RX1, PerkinElmer, Уолтем, MA, США). УФ-Vis спектроскопия материалов проводили с помощью спектрометра (U-4100, Hitachi, Чиёда-ку, Токио, Япония). Поверхностную химию фуллеренола изучали рентгеновской фотоэлектронной спектроскопией (XPS, PHI 5000 спектрометр (VersaProbe, Чанхассен, MN, США)). Молекулярную массу фуллеренола определяли методом полево-десорбционной (FD) масс-спектрометрии (AccuTOF, GCx-plus, JEOL, Акишима, Токио, Япония), и число гидроксильных групп подтверждали как 21 и 46 соответственно на основе результатов.

Бактериальные культуры [28]

E. coli, полученные из нашей лаборатории, выращивали на питательной агаре LB (на литр: триптон 10 г, дрожжевой экстракт 5 г, хлорид натрия 8 г, агар 15 г, pH настроен на 7.5) (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, MO, США) и инкубировали при 37 °C.

Анализ биосовместимости методом подсчета колониеобразующих единиц (КОЕ) [28]

E. coli (OD₆₀₀ ~ 0.05) добавляли с материалом (0–9 мкг/мл) и инкубировали 3 часа при 37 °C (Дополнительный файл 1: Рис. S1). После инкубации смесь центрифугировали и бактериальные пеллеты разбавляли (OD₆₀₀ ~ 0.05). Затем проводили разбавление с фактором 10⁻⁵ до 10⁻⁸ в инкубированных бактериях и высевали на агаровые пластинки. Пластинки оставляли в термостате (при 37 °C) на ночь. Число выживших бактерий определяли и выражали в процентах (%), соответствующих единицам КОЕ/мл после инкубации. Данные — среднее ± SD (n = 6).

Измерение ψ_Δ [29, 30]

Согласно предыдущему исследованию, ψ_Δ можно получить. Измерения ψ_Δ проводили в D₂O при 355 нм, используя meso-тетра(4-сульфонатофенил)порфин дигидрохлорид (TSPP; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, MO, США) как референс (ψ_Δ = 0.64).

Измерение квантового выхода флуоресценции [31, 32]

Относительный фотолюминесцентный (ФЛ) КВ контрастного агента обычно является отношением излученных фотонов к поглощенным фотонам и задается как:

$$ \mathrm{QY}={\mathrm{QY}}_{\mathrm{ref}}\ \left({\eta}^2/{\eta_{\mathrm{ref}}}^2\right)\left(I/A\right)\left({A}_{\mathrm{ref}}/{I}_{\mathrm{ref}}\right) $$ (1)

где QY_ref = 0.28 — КВ Cy5.5, растворенного в диметилсульфоксиде (DMSO; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, MO, США) как референс, η — коэффициент преломления ddH₂O = 1.33 (η_ref DMSO = 1.48), I — интегральная флуоресцентная интенсивность, A — абсорбция на длине волны возбуждения. Однофотонное возбуждение (ОФВ) или ДФВ дают тот же КВ.

Фемтосекундная лазерная оптическая система для измерения двухфотонного поглощения (ДФП) и двухфотонной люминесценции (ДФЛ) [23, 28, 33–38]

Использовали домашнюю фемтосекундную титан-сапфировую (ti-sa) лазерную оптическую систему (частота повторения 80 МГц; Tsunami, Spectra-Physics, Санта-Клара, CA, США) согласно предыдущим исследованиям.

Измерение ДФП

Со скоростью гальванометрического сканера 2 м/мс измеряли спектр возбуждения 720–820 нм при мощности возбуждения 2.8 мВт [это мощность до объектива; мощность после объектива (или на образце) составляет 0.9856 мВт или 98.56 нДж/пиксель]. Таким образом, измеряли относительные спектры ДФП в зависимости от длины волны возбуждения для фуллеренолов.

Измерение спектров ДФЛ

Материал экспонировали ДФВ от фемтосекундного лазера при длине волны возбуждения 760 нм, площади сканирования 200 × 200 мкм², частоте 10 кГц, времени экспозиции 1.638 с/(сканирование, пиксель) = 100 мкс, 128 × 128 пикселей/сканирование, площадь пикселя 1562.5 × 1562.5 нм². Площадь фокального пятна рассчитывалась как πd²/4, где d = 0.61 λ/числовая апертура (NA) — полovina ширины на половине максимума талии пучка. Например, в фокальном пятне x–y оси при 760 нм возбуждении и ×40 масляном объективе с NA 1.3, d = 0.61 × 800 нм/1.3 = 375.38 нм = 0.37538 мкм, а z-осевое разрешение измеряли как 0.90159 мкм. Для 760 нм возбуждения время экспозиции на сканирование для отдельного наноматериала выражается как (площадь фокального пятна/площадь пикселя) × 100 = 4.0776 мс, и общее время экспозиции t = 4.0776 мс × число сканирований. Использовали ×40 масляной объектив (NA 1.3) для сбора сигналов, диапазон детекции спектрофотометра составлял 300–695 нм.

Дополнительно, расчеты лазерной мощности (мВт или нДж/пиксель), используемой на образце, были следующими. Для ×40 масляного объектива (NA 1.3) коэффициент пропускания при 760 нм в этой оптической системе составляет примерно 88%, и лазерная мощность от выхода до объектива составляет только 40% исходной выходной мощности из-за потерь мощности. В результате рассчитанная энергия после объектива (на образце) равна P_output (мВт)*40%*88% = 0.352 × P_output (мВт). Например, P_output = 2.8 мВт, рассчитанная энергия после объектива (на образце) составляет 3.0 мВт*40%*88% = 0.9856 мВт. При 10 кГц скорости сканирования (каждый импульс держится 0.1 мс/пиксель), рассчитанная энергия на образце (Дж/пиксель) составляла около P_output (мВт)*40%*88%*0.1 мс = 0.0352*P_output (Дж/пиксель). Например, P_output = 2.8 мВт, энергия (Дж/пиксель) на образце = 2.8 мВт*40%*88%*0.1 мс = 0.09856 мкДж/пиксель = 98.56 нДж/пиксель. Мощность после объектива (на образце) использовалась и отмечалась во всей работе.

Измерение абсолютного сечения ДФВ [24, 36–48]

Абсолютное сечение ДФВ измеряли люминесцентный сигнал через фемтосекундную лазерную оптическую систему согласно предыдущим исследованиям. ДФЛ флуоресцеина и родamina B (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, MO, США) должны были быть верифицированы. Результаты показаны на рис. 1b и получены путем измерения зависимости интенсивности излучения при диапазоне мощности возбуждения от 704 нДж/пиксель (7.04 мВт) до 2816 нДж/пиксель (28.16 мВт). Квадратичная зависимость с показателями 2.03 для флуоресцеина и 2.02 для родamina B измерялась для увеличения мощности возбуждения для определения люминесценции от ДФВ. Согласно предыдущим исследованиям, сечения действия ДФВ для флуоресцеина и родamina B составляют 36.4 и 68.0 GM (1 GM = 10⁻⁵⁰ см⁴ с фотон⁻¹) соответственно для 760 нм возбуждения. Также ссылались на бесплатный сайт https://www.drbio.cornell.edu/cross_sections.html, любезно предоставленный проф. Chris Xu (Cornell University, NY, USA). Сечения действия ДФВ для флуоресцеина и родamina B рассчитывали как 36.5 и 66.1 GM соответственно (таблица 1), что указывало на погрешность менее 5% по сравнению с данными лаборатории проф. Xu. В этом исследовании родamin B выбирали как стандартный референс для определения сечения, и рассчитанные абсолютные сечения ДФВ для водорастворимого C₆₀(OH)₂₁ и C₆₀(OH)₄₆ фуллеренолов составляли примерно 1230.51 GM и 1037.21 GM соответственно. Измеренные параметры для расчета абсолютных сечений ДФВ образцов показаны в таблице 3. Партионное вариация не наблюдалась для материалов в двухфотонных свойствах и двухфотонной фотодинамической способности.

Фемтосекундная лазерная оптическая система (для микроскопии времени жизни флуоресценции, FLIM) [39, 45]

Использовали домашнюю фемтосекундную ti-sa лазерную оптическую систему (частота повторения 80 МГц; Tsunami, Spectra-Physics, Санта-Клара, CA, США) согласно предыдущим исследованиям. Данные времени жизни и параметры генерировали с помощью тройной экспоненциальной аппроксимации при мониторинге излучения под ДФВ (Ex, 760 нм).

Расчет радиативных и нерадиативных скоростей затухания [46]

ФЛ КВ и время жизни — основные параметры при исследовании эмиссионных характеристик флуоресцентных красителей в различных средах. КВ (Q) можно выразить как:

$$ Q=\frac{\varGamma }{\varGamma +k} $$ (2)

где Γ — радиативная скорость затухания, k — нерадиативная скорость затухания. Время жизни флуоресценции обычно определяется как среднее время, необходимое электрону в возбужденном состоянии для затухания в основное состояние. Время жизни ДФЛ τ также может быть связано со скоростями затухания и описывается как:

$$ \tau =\frac{1}{\varGamma +k} $$ (3)

Следуя уравнениям (2) и (3), можно рассчитать радиативные и нерадиативные скорости затухания.

При поглощении фотона один из слабо связанных электронов флуоресцентной молекулы — флуорофора — переходит на более высокий энергетический уровень. Флуорофор тогда находится в возбужденном состоянии, A*. Это состояние метастабильно; поэтому флуорофор вернется в свое стабильное основное состояние, A. Он может сделать это либо радиативно, излучая фотон флуоресценции hν

$$ A\ast \rightarrow A+ h\nu $$

либо нерадиативно, рассеивая энергию возбужденного состояния в виде тепла:

$$ A\ast \rightarrow A+\mathrm{тепло} $$

Депопуляция возбужденного состояния зависит от доступных путей деэкскатации. Флуоресценция — радиативная деактивация низшего вибрационного уровня первого электронно-возбужденного синглетного состояния, S₁, обратно в электронное основное состояние, S₀. Синглетные состояния — энергетические уровни, которые могут быть населены слабо связанным электроном без переворота спина. Процессы поглощения и излучения иллюстрируются диаграммой энергетических уровней, названной в честь Александра Яблонского.

Время жизни флуоресценции, τ, — среднее время, в течение которого флуорофор остается в электронно-возбужденном состоянии S₁ после возбуждения. τ определяется как обратная величина суммы скоростных параметров для всех процессов депопуляции возбужденного состояния: уравнение (3), где нерадиативная скоростная константа k есть сумма скоростной константы внутренней конверсии k_ic и скоростной константы межсистемного перехода в триплетное состояние k_isc такая, что k = k_ic + k_isc. Флуоресцентное излучение всегда происходит с низшего вибрационного уровня S₁, правило, известное как правило Каши, указывающее, что флуорофор не имеет памяти своего пути возбуждения; например, ОФВ и ДФВ дают тот же флуоресцентный спектр, КВ и время жизни.

Определение скоростей жизнеспособности бактерий после лазерного облучения [28]

Метод подсчета КОЕ

Бактерии (OD₆₀₀ ~ 0.05) добавляли с материалом (3 или 6 мкг/мл) инкубируя 3 часа при 37 °C в темноте. После инкубации смесь центрифугировали и бактериальные пеллеты разбавляли (OD₆₀₀ ~ 0.05) и экспонировали ДФВ мощности 211.2 нДж/пиксель с 800 сканированиями (примерно 3.2621 с общего эффективного времени экспозиции; Ex, 760 нм). Затем проводили разбавление с фактором 10⁻⁵ до 10⁻⁸ в инкубированных бактериях и высевали на агаровые пластинки. Пластинки оставляли в термостате (при 37 °C) на ночь. Число выживших бактерий определяли и выражали в процентах (%), соответствующих единицам КОЕ/мл после инкубации. Данные — среднее ± SD (n = 6).

Набор LIVE/DEAD

Бактерии (OD₆₀₀ ~ 0.05) добавляли с материалом (3 или 6 мкг/мл) инкубируя 3 часа при 37 °C в темноте. После инкубации смесь центрифугировали и бактериальные пеллеты разбавляли (OD₆₀₀ ~ 0.05) и экспонировали ДФВ мощности 211.2 нДж/пиксель с 800 сканированиями (примерно 3.2621 с общего эффективного времени экспозиции; Ex, 760 нм). Затем пеллеты окрашивали с помощью набора LIVE (SYTO 9, отображается зеленой флуоресценцией)/DEAD (пропидиев йодид, PI, отображается красной флуоресценцией) (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, MA, США) согласно инструкции. Жизнеспособность бактерий kvantифицировали для антимикробных тестов, которые показали почти все наноматериал-обработанные бактерии мертвыми после лечения. Подобная жизнеспособность kvantифицировали методом подсчета КОЕ для определения эффективных антибактериальных эффектов материалов в ФДТ. Данные представлены как среднее ± SD (n = 6).

Обнаружение РФК [23, 29, 34, 35, 49–55]

Единичный кислород (¹O₂)

(a) Материал (3 или 6 мкг/мл) обрабатывали с бактериями (OD₆₀₀ ~ 0.05), затем подвергали 3-часовой инкубации при 37 °C в темноте. Затем смесь экспонировали ДФВ фотоэкскации (211.2 нДж/пиксель, 800 сканирований; Ex, 760 нм) и наконец смешивали с реагентом Singlet Oxygen Sensor Green (SOSG) (1 мкМ; Thermo Fisher Scientific, Уолтем, MA, США) (Ex/Em: 488/525 нм). Для измерений использовали флуоресцентный спектрометр. Для нейтрализации РФК смесь смешивали с 30 ppm антиоксиданта α-токоферол/метил линолеат (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, MO, США) в темноте и экспонировали ДФВ фотоэкскации с тем же лечением. (b) Материал (3 или 6 мкг/мл) обрабатывали с бактериями (OD₆₀₀ ~ 0.05), затем подвергали 3-часовой инкубации при 37 °C в темноте. Затем смесь экспонировали ДФВ фотоэкскации (211.2 нДж/пиксель, 800 сканирований; Ex, 760 нм) и наконец смешивали с 10 мкМ транс-1-(2′-метоксивинил)пирен (t-MVP, Thermo Fisher Scientific, Уолтем, MA, США)/0.10 М SDS (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, MO, США) (Ex/Em: 352/465 нм). Для нейтрализации РФК смесь смешивали с 30 ppm антиоксиданта α-токоферол/метил линолеат (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, MO, США) в темноте. Реакция t-MVP с ¹O₂ дает диоксетановый промежуточный продукт, который флуоресцирует, пока разлагается на 1-пиренкарбоксальдегид. Более того, этот высокоселективный флуоресцентный зонд не реагирует с другими активированными видами кислорода, такими как гидроксильные радикалы, супероксид или перекись водорода. Для измерений использовали флуоресцентный спектрометр. Нейтрализация РФК проводилась с тем же описанным выше лечением.

Супероксид-радикальный анион (O₂^•−)

(a) Материал (3 или 6 мкг/мл) обрабатывали с бактериями (OD₆₀₀ ~ 0.05), затем подвергали 3-часовой инкубации при 37 °C в темноте. Затем смесь экспонировали ДФВ фотоэкскации (211.2 нДж/пиксель, 800 сканирований; Ex, 760 нм) и наконец смешивали с 2,3-бис(2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-2H-тетразолий-5-карбоксанилид (XTT, 0.45 мМ; Sigma-Aldrich, Сент-Луис, MO, США). Цель этого материала — он взаимодействует с O₂^•− и производит XTT-формазан, давая сильное поглощение (470 нм по длине волны). УФ-Vis спектрометр использовали для мониторинга этого поглощения. Для нейтрализации РФК смесь смешивали с 30 ppm антиоксиданта α-токоферол/метил линолеат (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, MO, США) в темноте и экспонировали ДФВ фотоэкскации с тем же лечением. (b) Материал (3 или 6 мкг/мл) обрабатывали с бактериями (OD₆₀₀ ~ 0.05), затем подвергали 3-часовой инкубации при 37 °C в темноте. Затем смесь экспонировали ДФВ фотоэкскации (211.2 нДж/пиксель, 800 сканирований; Ex, 760 нм) и наконец смешивали с 50 мМ бикарбонатным буфером (pH 8.60) и глутатионом (γ-L-глутамил-L-цистеинil-глицин, GSH, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, MO, США)/0.80 мМ бикарбонатным буфером (тест Эллмана для обнаружения O₂^•−). Затем проводили следующие эксперименты согласно процедуре в предыдущем исследовании. Потеря GSH (%) рассчитывали как разность абсорбции между образцом и негативным контролем, деленную на абсорбцию негативного контроля. Сигнал сгенерированного O₂^•− получали как описано в предыдущем расчете. Данные — среднее ± SD (n = 6).

Анализ поглощения [35]

E. coli (OD₆₀₀ ~ 0.05) инкубировали с 3 мкг/мл материалом. Абсорбция количества 3 мкг/мл материала записывали УФ-Vis спектроскопией (Abs, примерно 203 нм). Материалы смешивали с E. coli (OD₆₀₀ ~ 0.05) при 37 °C с 1-го по 10-й час соответственно, и центрифугировали (1200 об/мин) для удаления излишков материалов и сохранения супернатанта и измерения его абсорбции. Разность абсорбции между собранным супернатантом и исходными материалами оценивали, получая процент поглощения в каждую временную точку. Данные — среднее ± SD (n = 6).

Статистический анализ [56]

Статистическая значимость определялась дисперсионным анализом. p-значение считалось статистически значимым для всех обработок.

Результаты и обсуждение

Характеристика водорастворимого фуллеренола

Водорастворимый C₆₀(OH)₄₆ (фуллеренол), определенный как круглый и монодисперсный, синтезировали в соответствии с предыдущим исследованием [27]. Средний боковой размер фуллеренола составлял примерно 1.13 ± 0.04 нм, как определили с помощью низкоувеличенных (рис. 2a) и HR-TEM изображений (рис. 2b). Кроме того, фуллеренол проявлял благоприятную кристалличность вместе с хорошим решетковым интервалом, соответствующим d-интервалу решетки фуллеренола {1\( \overline{1} \)00}. Однако эти частицы могли формировать агрегаты через водородные связи в водном растворе при pH 7.0. Средний размер сформированных агрегатов составлял примерно 130 нм, как показал DLS анализ. Более того, агрегаты оставались высокостабильными в течение 3 месяцев в различных физиологических средах, таких как водный раствор pH 7.0, 1× фосфатно-буферный раствор и питательная среда (Дополнительный файл 1: Таблица S1). В УФ-Vis спектре абсорбции фуллеренола наблюдались пики абсорбции примерно при 216 и 309 нм, которые атрибутировали к π–π* переходу ароматических C=C связей и n–π* переходам плеча C=O соответственно. π-электронный переход в фуллереноле содержал кислород (рис. 2c), как обычно наблюдается для водных дисперсий, тем самым подтверждая наличие фуллеренола. Дополнительные характеристики проводили с помощью FTIR, XPS и масс-спектрометрии для подтверждения свойств подготовленных материалов. FTIR использовали для анализа экспонированных функциональных групп подготовленных материалов. Результаты анализа показали следующие характерные полосы материала: полосу валентных колебаний C–O примерно при 1109 см⁻¹ (полоса 1), фенольную полосу валентных колебаний C–OH примерно при 1271 см⁻¹ (полоса 2), третичную спиртовую полосу валентных колебаний C=O примерно при 1422 см⁻¹ (полоса 3), полосу валентных колебаний C=C примерно при 1674 см⁻¹ (полоса 4), полосу валентных колебаний C=O примерно при 1721 см⁻¹ (полоса 5), и полосу межмолекулярных водородных связей C–H и карбоксилатных O–H примерно при 3318 см⁻¹ (полоса 6). Кроме того, наблюдалась полоса интерференции CO₂. Эти полосы 드러нали экспонированные гидроксильные и карбонильные группы, а также ароматические C=C связи (рис. 2d). XPS проводили для изучения поверхностной химии фуллеренола, который преимущественно содержит атомы углерода в общем. Деконволютированные C(1s) спектры фуллеренола показали неокисленный кольцо (C–C/C=C, 286.1 эВ), C–O связь (286.9 эВ) и C=O связь (288.0 эВ). Кроме того, отношение O(1s)/C(1s) составляло примерно 35.8% (рис. 2e). Молекулярная масса фуллеренола также определяли с помощью FD масс-спектрометрии (Дополнительный файл 1: Рис. S2); число гидроксильных групп (C–OH) подтверждали как 46, что согласуется с атомными соотношениями и составом связей фуллеренола, суммированными на рис. 2. Эти результаты характеристики подтверждают успешный синтез фуллеренола.

Генерация РФК водорастворимым фуллеренолом под ДФВ

ФС поглощает и передает энергию света другим непоглощающим молекулам для генерации РФК, которые убивают мишеневые клетки, повреждают опухолевую васкулатуру и активируют антиопухолевой иммунный ответ. ФС имеют особое расположение электронов в своих молекулярных орбиталях. Как и почти все молекулы, в основном (синглетном) состоянии ФС имеют пары электронов с противоположными спинами в низкоэнергетических молекулярных орбиталях. Поглощение света подходящей длины волны поднимает электрон на высокоэнергетический орбитал без изменения его спина. Это короткоживущее (наносекунды) возбужденное синглетное (S₁) состояние, и ФС может потерять свою энергию и вернуться в основное состояние, излучая свет (флуоресценция) или тепло. Альтернативно, в состоянии S₁ может произойти межсистемный переход, при котором спин возбужденного электрона инвертируется. Эта инверсия спина электрона отвечает за относительно долгую жизнь (микросекунды) возбужденного триплетного (T₁) состояния. Радиативные триплет-синглет переходы ингибированы, потому что они требуют изменения спина электрона, что является медленным процессом. Из состояния T₁ ФС может вернуться в основное состояние, излучая свет (фосфоресценция) или передавая энергию другой молекуле. Он также может потерять энергию через внутреннюю конверсию или безрадиационные переходы при столкновениях с другими молекулами. Чем дольше жизнь ФС в состоянии T₁, тем выше его шансы столкнуться с другой молекулой, приводя к производству РФК [57–59]. Фотосенсибилизация водорастворимых фуллеренолов приводит к их переходу в долгосрочное состояние T₁ и последующей передаче энергии или электрона к молекулярному кислороду, давая РФК такие как ¹O₂ и O₂^•−, которые играют главные роли в ФДТ. Поэтому ¹O₂ и O₂^•−, производимые водорастворимым C₆₀(OH)₄₆, должны быть обнаружены непосредственно с помощью лазерного облучения. Для обнаружения образования ¹O₂ и O₂^•− во время ФДТ в этом исследовании ФДТ инициировали комбинацией возбужденного триплетного водорастворимого C₆₀(OH)₄₆, кислорода и света, настроенного на подходящую длину волны и энергию, а также введением реагентов SOSG, t-MVP, XTT и GSH [33, 34, 49–51]. Для использования потенциала бактерицидной способности материалов длина волны примерно 760 нм определили как наиболее эффективную для получения относительного максимального отношения ДФП водорастворимого C₆₀(OH)₄₆ под ДФВ (рис. 3a); это атрибутируется межзонным переходам [52]. Эта длина волны использовалась в последующих экспериментах. Водорастворимый C₆₀(OH)₄₆ фотоэкскатировали через ДФВ при мощности 211.2 нДж/пиксель с 800 сканированиями (Ex, 760 нм; общее эффективное время экспозиции ~ 3.2621 с) и вносимой дозе 3 или 6 мкг/мл (Дополнительный файл 1: Таблица S2). Кроме того, для подтверждения участия РФК в эффектах ФДТ водорастворимого C₆₀(OH)₄₆, использовали α-токоферол для нейтрализации РФК [49, 53]. Количество сгенерированных РФК снижалось после добавления α-токоферола, но наблюдаемая бактериальная жизнеспособность увеличивалась как ожидалось. Кроме того, количество сгенерированных РФК зависело от вносимой дозы. Для предотвращения производства ¹O₂ и O₂^•−, возможно вызванного случайной экспозицией водорастворимого C₆₀(OH)₄₆ к белому свету — что могло бы компрометировать эксперименты [60] — последующие эксперименты ФДТ проводили в темноте. Это исследование фокусировалось на количествах сгенерированных ¹O₂ и O₂^•−. Водорастворимый C₆₀(OH)₄₆ проявил значительные антибактериальные эффекты, демонстрируя свой потенциал для применения в ФДТ. Замечательно, что после того же эксперимента водорастворимый C₆₀(OH)₂₁ (Дополнительный файл 1: Рис. S3, S4; Рис. 3a) был менее эффективен в формировании ¹O₂ и O₂^•− по сравнению с водорастворимым C₆₀(OH)₄₆ (Дополнительный файл 1: Таблица S2). Водорастворимый C₆₀(OH)₄₆ генерировал больше ¹O₂ и O₂^•−, чем водорастворимый C₆₀(OH)₂₁; дополнительно, водорастворимый C₆₀(OH)₄₆ и водорастворимый C₆₀(OH)₂₁ имели значения Φ_Δ примерно 0.93 и 0.85 соответственно (для референса, Φ_Δ = 0.64 — КВ TSPP, растворенного в D₂O [29, 30]).

Определение антимикробной способности с использованием ДФВ

Перед выполнением антимикробных экспериментов токсичность водорастворимых фуллеренолов должна быть изучена для исключения факторов, способствующих бактериальной элиминации и запутывающих экспериментальные результаты. Кроме того, для предотвращения возможного производства РФК, вызванного случайной экспозицией экспериментальных материалов к белому свету, что могло бы запутать результаты [35], эксперименты ФДТ должны проводиться в темноте. В этом исследовании применяли грамотрицательную E. coli как экспериментальный шаблон. Анализ КОЕ проводили для определения числа выживших бактерий (выраженного здесь в процентах, соответствующих КОЕ/мл). Бактерии обрабатывали двумя типами подготовленных водорастворимых фуллеренолов (диапазон дозы 0–9 мкг/мл) и инкубировали в темноте 3 часа при 37 °C для определения абсорбции при 600 нм (OD₆₀₀ ~ 0.05; Дополнительный файл 1: Рис. S1). Уровни роста бактерий, обработанных водорастворимыми фуллеренолами, сначала мониторили измерением абсорбции при 600 нм. Начальная абсорбция составляла 0.05 OD₆₀₀, и абсорбция, ассоциированная с обоими материалами, достигала примерно 0.37 со временем. Следовательно, ни один материал не ингибировал бактериальное размножение. Более того, материалы вызывали почти 0 log₁₀ снижение числа выживших бактерий (рис. 3b), соответствующее жизнеспособности примерно 100% (рис. 3c). Таким образом, материалы определили как обладающие отличной биосовместимостью с бактериями. Следовательно, материалы, подвергшиеся 3-часовой инкубации в темноте при 37 °C, использовали для проведения экспериментов. Хотя водорастворимый фуллеренол мог генерировать РФК, взаимодействия между материалами и реагентами (т.е. SOSG, t-MVP, XTT и GSH) могут приводить к ложноположительным сигналам РФК, тем самым запутывая результаты ФДТ [52]. Поэтому для исключения этой возможности бактерии вводили и обрабатывали материалами в настоящем исследовании. Наблюдали количество РФК, генерируемых фотоэкскатированными материал-обработанными E. coli. Таблица 2 представляет наблюдаемое количество РФК, раскрывающее похожий тренд, как в таблицах S2–S3 (Дополнительный файл 1: материалы в одиночестве и материал-обработанные грам-позитивные Bacillus subtilis (B. subtilis)); эти результаты были согласованы с фосфоресцентным сигналом ¹O₂, излучаемым материалами при 1270 нм (рис. 3d). ФДТ против E. coli проводили с облучением низкой дозой энергии (211.2 нДж/пиксель с 800 сканированиями, общее эффективное время экспозиции ~ 3.2621 с; Ex, 760 нм). Эффекты ФДТ на жизнеспособность E. coli, обработанных двухфотонно фотоэкскатированными материалами, затем определяли (рис. 4). Бактерицидные эффекты не наблюдались на бактериях в одиночестве (с или без лазерного облучения) или на панели материал-обработанных бактерий без лазерного лечения (рис. 4a). После ДФВ бактериальная жизнеспособность была относительно низкой; конкретно, жизнеспособность, наблюдаемая для панели, обработанной водорастворимым C₆₀(OH)₂₁, составляла почти 15%, соответствующую примерно 0.823 log₁₀ снижению (рис. 4b). В противовес, бактериальная жизнеспособность для панели, обработанной водорастворимым C₆₀(OH)₄₆, составляла примерно 0 (100% эффективность элиминации, соответствующая ~ 7.736 log₁₀ снижению). При увеличении дозы полные бактерицидные эффекты наблюдались для обоих материалов (рис. 4c, d). Однако антимикробные эффекты не различались по типу бактерий (грамотрицательная E. coli или грам-позитивная B. subtilis) после фотоэкскации (Дополнительный файл 1: Рис. S5). Кроме того, касательно фуллеренолов, элиминировавших бактерии, более высокий состав гидроксильных групп увеличивал бактерицидную способность по сравнению с более низким составом при идентичных условиях лечения.

Наблюдение водорастворимым фуллеренолом обработанных E. coli с помощью TEM и исследование двухфотонных свойств

Для наблюдения разрушения материал-обработанных бактерий после фотоэкскации выбирали водорастворимый C₆₀(OH)₄₆ с высокой эффективностью ФДТ, и бактерии образовывали с помощью TEM. Голые E. coli (рис. 5a) инкубировали с водорастворимым фуллеренолом 3 часа, в результате чего наблюдалось существенное адсорбирование материалов на бактериальных поверхностях. Тем не менее, необычных морфологий не наблюдалось, указывая на нормальную живую бактериальную морфологию (рис. 5b). Результаты анализа поглощения показали адсорбирование материалов на бактериальной поверхности, при соответствующей скорости прорыва примерно 85% в течение первых 3 часов инкубации (рис. 5c); скорость насыщалась с 3-го по 10-й час. Следовательно, материалы адсорбировались и формировали внешний барьер на бактериальной поверхности. Однако E. coli проявляла искаженную внешность и серьезные морфологические изменения за 3 дня инкубации (рис. 5d), что приводило к 0.940 log₁₀ снижению, соответствующему почти 18% жизнеспособности (рис. 5f; Дополнительный файл 1: Рис. S6). Адсорбирование и покрытие материалов на бактериальной поверхности подавляли поглощение питательных веществ, необходимых для микробного роста, и вызывали изменения проницаемости мембраны (стенки), тем самым индуцируя внутренние осмотические дисбалансы и ингибируя микробный рост. Другими словами, водорастворимый фуллеренол имел антибактериальные (бактериостатические или бактерицидные) эффекты после 3 дней инкубации. Кроме того, фотоэкскатированные материал-обработанные бактерии, особенно E. coli, проявляли уникальные морфологии с серьезными повреждениями после 3 часов инкубации (рис. 5e, f; Дополнительный файл 1: Рис. S6). Тепловые пузыри, сгенерированные на бактериальной поверхности, не образовывались, указывая на то, что водорастворимый фуллеренол не имел фотопермальных свойств после фотоэкскации (Дополнительный файл 1: Рис. S7). Жизнеспособность E. coli также определяли через флуоресценцию и квантификацию (рис. 6). Зеленая флуоресценция, указывающая на живые бактерии на рис. 6a, показывает, что бактерии, экспонированные только лазерному лечению, в значительной степени не повреждены, что согласуется с результатами на рис. 5a. Мертвые бактерии обнаруживались после лечения материалами и лазерной экспозицией (красная флуоресценция на рис. 6b), что также согласуется с рис. 5e. Бактериальная жизнеспособность kvantифицировали для дальнейшего антимикробного тестирования. Почти полная элиминация материал-обработанных бактерий (рис. 6c) наблюдалась. Жизнеспособность также kvantифицировали с помощью анализа КОЕ (рис. 4a, b и 5f, и Дополнительный файл 1: Рис. S6) для демонстрации антибактериальной эффективности водорастворимого C₆₀(OH)₄₆ в ФДТ. Согласно результатам на рис. 4, 5 и 6; таблице 2; и таблице S2 (Дополнительный файл 1), E. coli, обработанные водорастворимым C₆₀(OH)₄₆, были восприимчивы к фотоэкскации, приводящей к более высокой смертности, увеличенному генерированию РФК и более серьезному морфологическому коллапсу по сравнению с E. coli, обработанными водорастворимым C₆₀(OH)₂₁. В общем, абсолютное сечение ДФВ делает флуорофоры эффективными для нелинейных микроскопических исследований, потому что отношение поглощенной энергии к входному энергетическому потоку к образцу высоко, тем самым минимизируя возможный фотоваред образцам [39, 40]. Когда двухфотонные техники используются для визуализации молекулярной активности в живых биологических препаратах и мутных тканях, благоприятное сечение желательно [61]. В настоящем исследовании абсолютное сечение ДФВ, рассчитанное для водорастворимого C₆₀(OH)₄₆, составляло примерно 1037 GM (единица Гёпперт-Майер, 1 GM = 10⁻⁵⁰см⁴с фотон⁻¹) при длине волны возбуждения 760 нм (флуоресцеин был стандартным референсом для сечения [39, 40]; рис. 1b и таблицы 1 и 3); абсолютное сечение, рассчитанное для водорастворимого C₆₀(OH)₂₁, составляло примерно 1230 GM, что аналогично значениям, полученным в соответствующих исследованиях [62, 63]. Эти абсолютные сечения могут облегчить двухфотонный процесс. Кроме того, флуоресценция водорастворимого C₆₀(OH)₄₆ освещалась через двухфотонный процесс (рис. 1b). Относительный флуоресцентный КВ составлял примерно 0.02 (КВ Cy5.5 в диметилсульфоксиде [31] служил референсом: QY_ref = 0.28); аналогично, абсолютный КВ [64] составлял примерно 0.01, и те же КВ получались для ОФВ и ДФВ [31]. В противовес, водорастворимый C₆₀(OH)₂₁ имел более низкие относительные и абсолютные КВ (0.06 и 0.05 соответственно). Кроме того, это исследование изучало время жизни фуллеренолов. Эффекты радиативных и нерадиативных скоростей затухания на КВ и время жизни рассчитывали. Среднее время жизни водорастворимого C₆₀(OH)₄₆ составляло примерно 7.797 нс, рассчитанное из наблюдаемых времен жизни 0.149, 1.775 и 19.679 нс; среднее время жизни водорастворимого C₆₀(OH)₂₁ составляло примерно 5.251 нс (рис. 7 и таблица 4). Следовательно, отношение радиативной к нерадиативной скорости затухания водорастворимого C₆₀(OH)₄₆ составляло примерно 0.020 (полученное из скоростей примерно 2.565 × 10⁶ с⁻¹ до 1.257 × 10⁸ с⁻¹), тогда как для водорастворимого C₆₀(OH)₂₁ оно составляло примерно 0.064 (примерно 1.143 × 10⁷ с⁻¹ и 1.790 × 10⁸ с⁻¹; Дополнительный файл 1: Таблица S4). Это открытие атрибутируется существованию гидроксильной группы на поверхности водорастворимого фуллеренола, которая индуцировала нерадиативную рекомбинацию электрон-дырочных пар, приводя к ингибированию внутренней эмиссии состояния. Однако гидроксильные группы на краю водорастворимого фуллеренола могут иметь высокоокупированную молекулярную орбиталь. Это может быть приписано сильному орбитальному взаимодействию между гидроксильными группами, что таким образом может повысить эффективность межсистемного перехода (вместо генерации флуоресценции) и генерировать многочисленные триплетные состояния наноматериала с высоким составом гидроксильных групп; следовательно, это приведет к высокому значению Φ_Δ для водорастворимого фуллеренола и заставит фуллеренол реагировать с кислородом согласно диаграмме Яблонского [65]. Следовательно, двухфотонная ФДТ может быть эффективно проведена с использованием ультра-низкой энергии в экстремально короткое время, предоставляя альтернативный подход к убийству злокачественных видов.

Заключение

Это исследование показало, что водорастворимый фуллеренол с более высоким составом гидроксильных групп имел превосходные фотосвойства по сравнению с фуллеренолом с более низким составом гидроксильных групп; превосходные фотосвойства можно атрибутировать уменьшению лазерной экспозиции и материалов, используемых для лечения. Кроме того, водорастворимый фуллеренол с более высоким составом гидроксильных групп проявил высокое ДФП, благоприятное абсолютное сечение ДФВ и высокую двухфотонную стабильность. Следовательно, этот фуллеренол имеет потенциал как двухфотонный ФС в двухфотонной ФДТ, связанной с ДФВ. Это свойство, вероятно, обусловлено наличием гидроксильной группы на поверхности водорастворимого фуллеренола, которая вызвала нерадиативную рекомбинацию электрон-дырочных пар, приводя к ингибированию внутренней эмиссии состояния. Более того, гидроксильные группы на краю водорастворимого фуллеренола могут иметь высокоокупированную молекулярную орбиталь; это может быть атрибутировано сильному орбитальному взаимодействию между гидроксильными группами, тем самым повышая эффективность межсистемного перехода (вместо генерации флуоресценции) и генерируя многочисленные триплетные состояния материала с высоким составом гидроксильных групп. Следовательно, водорастворимый фуллеренол будет иметь высокое значение Φ_Δ и реагировать с кислородом согласно диаграмме Яблонского. Следовательно, двухфотонная ФДТ может быть эффективно проведена с использованием ультра-низкой энергии в экстремально короткое время. Соответственно, этот эффективный альтернативный подход к управлению злокачественными видами представляет возможности для будущих клинических применений.

Доступность данных и материалов

Все наборы данных представлены в основной статье.

Аббревиатуры

ФС:

Фотосенсибилизаторы

КВ:

Квантовый выход

ФДТ:

Фотодинамическая терапия

УФ-Vis:

Ультрафиолетово-видимый

РФК:

Реактивные формы кислорода

ψ_Δ:

Квантовый выход единичного кислорода

БИК:

Ближний инфракрасный

ДФВ:

Двухфотонное возбуждение

E. coli:

Escherichia coli

HR-TEM:

Высокоразрешающая передаточная электронная микроскопия

DLS:

Динамическое рассеяние света

FTIR:

Фурие-преобразование инфракрасной

XPS:

Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия

FD:

Полево-десорбционная

КОЕ:

Колонияобразующие единицы

TSPP:

Meso-тетра(4-сульфонатофенил)порфин дигидрохлорид

ФЛ:

Фотолюминесценция

DMSO:

Диметилсульфоксид

ОФВ:

Однофотонное возбуждение

ДФП:

Двухфотонное поглощение

ДФЛ:

Двухфотонная люминесценция

ti-sa:

Титан-сапфировый

NA:

Числовая апертура

FLIM:

Микроскопия времени жизни флуоресценции

¹O₂:

Единичный кислород

SOSG:

Singlet Oxygen Sensor Green

t-MVP:

Транс-1-(2′-метоксивинил)пирен

O₂^•−:

Супероксид-радикальный анион

XTT:

2, 3-Бис (2-метокси-4-нитро-5-сульфофенил)-2H-тетразолий-5-карбоксанилид

GSH:

Глутатион, γ-L-глутамил-L-цистеинil-глицин

S₁:

Синглет

T₁:

Триплет

B. subtilis:

Bacillus subtilis

GM:

Гёпперт-Майер

Оптимизация поликристаллических Ga₂O₃ фотодетекторов на сапфире: влияние последовой отжига на электрические х… Усиление фотонного поглощения в квантово-точечных инфракрасных фотодетекторах за счет поверхностных плазмо…