Улучшение HIFU-терапии рака с помощью сонодинамических микропузырьков N₂O

Аннотация

Высокоинтенсивный фокусированный ультразвук (HIFU) — представительный неинвазивный метод лечения рака, но его низкая терапевтическая эффективность и риск повреждения окружающих здоровых тканей сдерживают дальнейшее клиническое развитие. Сонодинамическая терапия (SDT) убивает опухолевые клетки реактивными кислородными молекулами, вырабатываемыми соносенсибилизаторами при ультразвуковом облучении. SDT может усилить эффективность HIFU, как и микропузырьки. В работе разработаны наномасштабные микропузырьки N₂O (N₂O-mbs) улучшенным методом механической осцилляции. Микропузырьки проявили хорошую биосовместимость и связывание с опухолевыми клетками. Соносенсибильность N₂O-mbs определена как внеклеточно, так и внутриклеточно через детектирование генерации реактивных форм кислорода (РФК). Оценены токсические эффекты этих сонодинамических микропузырьков на опухолевые клетки и синергетический эффект на HIFU-лечение. Значительный а폽тоз вызван РК, вырабатываемыми N₂O-mbs при ультразвуковом облучении. N₂O-mbs в сочетании с HIFU увеличили некроз и а폽тоз опухолевых клеток in vitro, а также объем коагулятивного некроза и эхоинтенсивность в мишени печени быка ex vivo. Эти сонодинамические микропузырьки также эффективно ингибировали рост опухоли in vivo. N₂O-mbs оказывают значительное влияние на лечение и аблиацию HIFU благодаря преимуществам микропузырьков и исключительной соносенсибильности. Результаты указывают, что N₂O-mbs могут быть новым вспомогательным агентом для ультразвука, способствующим HIFU термической аблиации опухолей.

Введение

Злокачественные опухоли — одно из главных заболеваний, угрожающих жизни и здоровью [1]. HIFU — новая техника неинвазивной локальной аблиации опухолей. Успешно применяется при лечении bénigner и злокачественных солидных опухолей печени, почки, поджелудочной железы, простаты, молочной железы, кости и матки [2, 3]. Однако внутренние ограничения HIFU — затухание ультразвуковой энергии, ослабление накопления энергии в мишени, повреждение немишневых здоровых тканей — снижают терапевтический эффект [4, 5]. Фокальное поле HIFU мало (миллиметры). Аблиация крупных опухолей требует длительного облучения, повышая температуру тела до 39,2°C. С увеличением глубины опухоли растет необходимая энергия аблиации [6]. Это повышает риск физического повреждения пациента и снижает эффективность и безопасность HIFU. Поэтому исследователи ищут способы повысить терапевтическую эффективность HIFU [7–9]. Микропузырьки могут синергетически улучшить эффективность HIFU [7, 10]. Газ в микропузырьке — высокоак импедансный материал. Микропузырьки увеличивают рассеяние и отражение ультразвука в мишневой зоне [11, 12], повышают температуру мишени и усиливают тепловой эффект за счет накопления энергии HIFU [13]. Как экзогенные кавитационные ядра микропузырьки снижают кавитационный порог тканей и усиливают кавитационный эффект HIFU при прохождении через кровоток в опухоль [14]. В последние годы показано, что SDT синергеistically усиливает эффективность HIFU [15, 16]. Взаимодействие соносенсибилизаторов и ультразвука производит реактивные формы кислорода (РФК), включая синглетный кислород и гидроксил-радикалы, убивающие опухолевые клетки и ингибирующие рост опухоли через а폽тоз и некроз [17]. SDT حقق большой прогресс в неинвазивном лечении опухолей. Оно позволяет снизить дозу лекарства и мощность HIFU по сравнению с монотерапией. Для использования преимуществ обоих методов в данном исследовании сочетаны микропузырьки и сонодинамический эффект для дальнейшего повышения эффективности HIFU.

Соносенсибилизаторы — важная часть SDT [18, 19]. Большинство изучаемых традиционных соносенсибилизаторов происходят от фотосенсибилизаторов. N₂O — фотосенсибилизатор [20, 21], производящий токсичные вещества при УФ-облучении. В данной работе впервые изучена соносенсибильность N₂O. Ранее мы обнаружили, что применение N₂O в наarkозе при HIFU-операциях усугубляло степень повреждения тканей, включая утолщение брюшной стенки и кожной конгестии [22]. Комбинированное использование N₂O и HIFU имело синергетический эффект на тканевые повреждения. Но биологический эффект N₂O в HIFU-лечении неясен. N₂O — относительно стабильный маломолекулярный газ без биотрансформации и тканевой специфичности, широко распределяется в тканях без токсического эффекта [23, 24]. Поэтому это привлекательная перспектива как соносенсибилизатор. В работе приготовлены наномасштабные микропузырьки (N₂O-mbs) из липид-обернутого N₂O и C₃F₈. Доза N₂O снижена, а диапазон действия in vivo эффективно ограничен зоной опухоли. Изучен сонодинамический эффект N₂O и его синергетический эффект на эффективность HIFU.

Материалы и методы

Материалы

DPPC и DSPE-mPEG2000 — Avanti Polar Lipids (Алабастер, АЛ, США). Глицерин и агароза — Sigma Aldrich (Сент-Луис, МО, США). N₂O и C₃F₈ — Chongqing Ruixin Gas Co., Ltd (Китай). DAPI, DiI, DCFH-DA, DAF-FM DA, CCK-8 — Beyotime Biotechnology (Чуньцин, Китай). Calcein-AM (CAM) и пропидиевый йодид (PI) — Santa Cruz Biotechnology (TX, США). Annexin V-FITC/PI — Nanjing Keygen Biotech (Наньцзин, Китай). Singlet oxygen sensor green (SOSG) — Invitrogen (NY, США).

Приготовление N₂O-mbs и C₃F₈-mbs

N₂O-mbs методом вращающейся пленки с механической осцилляцией. Оболочка: DPPC и DSPE-PEG2000, ядро: N₂O. 5 мг DPPC, 2 мг DSPE-PEG2000, 10 мл хлороформа в круглодонной колбе, ультразвуковое растворение. Липидные пленки ротационным испарителем (60 мин, 55°C, 100 об/мин). 2 мл 10% глицерина для гидратации пленок и получения суспензии. 500 мкл в капсульную трубку, закрытую резиновой пробкой. Воздух в трубке замещен N₂O и C₃F₈ газовым вытеснителем. Механическая осцилляция серебро-ртутным капсульным миксером (YJT-2, Shanghai Medical Device) 150 сек. Дифференциальная центрифуга: 300 об/мин 5 мин, затем 800 об/мин 5 мин. N₂O-mbs ресуспендировали в ФСБ, хранили при 4°C.

C₃F₈-mbs тем же методом [25]. DiI-маркированные N₂O-mbs — добавление DiI при формировании пленки. N₂O имеет низкий молекулярный вес и нестабилен, легко выходит из микропузырька, сокращая полупериод. C₃F₈ — высокомолекулярный инертный газ, широко используемый в ультразвуковых контрастных агентах, повышает стабильность. Поэтому N₂O и C₃F₈ (2:1) смешаны как ядро N₂O-mbs для повышения стабильности.

Фабрикация и характеристики N₂O-mbs

Морфология и распределение размеров — светловая микроскопия. Концентрация — глобулиметр. Средний размер и дзета-потенциал — динамическое лазерное рассеяние (Malvern Instruments). Структура и морфология — TEM (Hitachi H-7600). Хранение при 4°C. Стабильность: морфология и концентрация в 1, 2, 3 дни. Средний размер и дзета-потенциал измерялись параллельно.

Клеточная культура и животная модель

Клетки человеческого рака молочной железы MDA-MB-231 (Jinxique Technology, Чуньцин) пассажировались <3 мес после реанимации. 37°C, 5% CO₂, DMEM + 10% ФБС, 50 мкг/л стрептомицин, 50 мкг/л пенициллин. При 80% конфлюэнтности — для экспериментов.

Животные эксперименты по руководству Этического комитета Чуньцинского медицинского университета. Самки нюд-мус (4–6 недель, 15–20 г) — Animal Experiment Center Чуньцинского мед. ун-та. Твердая опухоль: 1×10⁶ клеток/мл в 100 мкл физраствора субкутально в правый бок. Лечение при объеме опухоли ~150 мм³.

Внутриклеточное поглощение и биосовместимость N₂O-mb

MDA-MB-231 в фазе роста посеяли ~1×10⁵ клеток/колодец CLSM на 24 ч. 100 мкл (1×10⁵ пузырьков/мл) DiI-N₂O-mbs в полном среднем. Колодец запечатали, инвертировали в инкубаторе, контакт пузырьков с клетками. Через 2 и 4 ч: промывка 3× ФСБ, фиксация 4% ПФА 20 мин, DAPI 20 мин. CLSM (Nikon A1, Япония) — поведение таргетирования.

Цитотоксичность — CCK-8. 5×10⁴ клеток/колодец 96-колодцевой пластинки, 24 ч. 100 мкл разных концентраций N₂O-mb (1×10⁴, 1×10⁵, 1×10⁶/мл). 24 ч инкубации, CCK-8 10 мкл, 37°C 2 ч. Абсорбция 450 нм (Bio-Tek).

10 здоровых нюд-мус ~20 г случайно на 2 группы. N₂O-mbs (n=5) — i.v. 200 мкл 1×10⁵/мл; контроль (n=5) — физраствор 200 мкл. Через 21 день: основные органы (сердце, печень, селезенка, легкие, почки) эксцизированы, ГЭ-окрашивание.

In vitro SDT эффективность N₂O-mbs

Детекция кислородных радикалов по [26]. 10 мкл SOSG (500 мкМ) + 2 мл образца. Группы: C (контроль) — ФСБ; N₂O-mbs — 100 мкл N₂O-mbs в 2 мл ФСБ; C₃F₈-mbs — аналогично; LIFU — ФСБ под ультразвуком (2 Вт/см², Институт ультразвуковой визуализации Чуньцинского мед. ун-та) 100 с; LIFU-N₂O-mbs — ФСБ+N₂O-mbs под УЗ; LIFU-C₃F₈-mbs — ФСБ+C₃F₈-mbs под УЗ. Параметры: 2 Вт/см², 100 с по анализу результатов и литературе [27, 28]. УЗ: частота 650 кГц, фокусное расстояние 12,5 мм, импульсный режим 50% duty cycle, длительность импульса 1 с. Синглетный кислород (¹O₂) — флуоресценция (Cary Eclipse, Agilent) λ_ex/λ_em=504/525 нм. Параметры УЗ согласованы с in vitro клеточными экспериментами.

После детектирования внеклеточных РК SOSG, внутриклеточные РК — DCFH-DA набор. MDA-MB-231 ~1×10⁵ клеток/колодец CLSM. 6 групп: контроль, N₂O-mbs only, C₃F₈-mbs only, LIFU only, LIFU-C₃F₈-mbs, LIFU-N₂O-mbs. 24 ч адгезии, интервенции. DCFH-DA 30 мкМ во все колодцы, инкубация 20 мин в темноте. Промывка 3× ФСБ. Внутриклеточные РК — CLSM. Для верификации SDT эффективности: клетки в 6-колодцевых пластинках, 24 ч, те же 6 групп. Лечение, трипсинизация, суспензии, CLSM колодец. Ко-окрашивание CAM (живые, зеленые) и PI (мертвые, красные). Апоптоз — флоу цитометрия, Annexin V-FITC/PI. Через 1 ч после лечения: центрифуга, сбор клеток, окрашивание Annexin V-FITC/PI, флоу цитометрия (Becton-Dickinson).

In vitro синергетический эффект N₂O-mbs на HIFU

HIFU система (JC200, HIFU Technology Co., Ltd., Чуньцин) — диагностический УЗ блок, терапевтический УЗ блок, центральная обработка [29]. Параметры HIFU: частота 0,94 МГц, фокус 140 мм, диаметр 220 мм, диагностический преобразователь 3,5 МГц. Интегрированные преобразователи в дегазированной воде. Оценка усиления N₂O-mbs: MDA-MB-231 центрифугировали, 5×10⁵/мл, 4 группы: контроль, HIFU only (125 Вт, 5 с), HIFU-N₂O-mbs, HIFU-C₃F₈-mbs. Лечение, центрифуга, промывка ФСБ, двойное окрашивание Annexin V-FITC/PI, флоу цитометрия. NO-зонд DAF-FM — NO в супернатанте. Все эксперименты ×3. TEM ультравструктура: фиксация 2% OsO₄, дегидратация спиртами, встраивание Epon 812. Ультратонкие срезы 100 нм, уранил ацетат/свинцовой цитрат, электронная микроскопия.

Ex vivo и in vivo сонодинамический эффект N₂O-mbs на HIFU аблиацию

Свежая печень быка — местный слaughterhouse, в течение 12 ч после убоя. Срез 10×5×5 см, мало соединительной ткани и сосудов, дегазация 1 ч при 37°C. 3 группы: C₃F₈-mbs, N₂O-mbs, ФСБ. Печень в контейнере с деаэрированной водой. 200 мкл (1×10⁵ пузырьков/мл) микропузырьков в ФСБ инъецированы в печень (рис. 6а). Под контролем диагностического УЗ фокус HIFU в точке инъекции. Терапевтический преобразователь: 5 с аблиации при разных мощностях (100, 125, 150 Вт). Объем коагулятивного некроза: V = π/6 × длина × ширина × глубина (мм). Серое значение зоны мишени до и после HIFU на УЗ-изображениях.

20 крыс с опухолями случайно на 4 группы (n=5): контроль, HIFU-ФСБ, HIFU-C₃F₈-mbs, HIFU-N₂O-mbs. HIFU (125 Вт, 5 с) аблиация опухоли после i.v. инъекции 200 мкл C₃F₈-mbs, N₂O-mbs, ФСБ. Процедура как ex vivo. Анестезия 1% пентобарбитал (8 мл/кг). Места опухоли в контейнере с деаэрированной водой. Под УЗ-контролем фокус HIFU в опухоли. Масса тела и объем опухоли каждые 3 дня. Через 21 день после лечения: эвтаназия, эксцизия опухоли, ГЭ, PCNA, TUNEL.

Статистический анализ

GraphPad Prism 7. Данные — среднее ± SD. Минимум 3 повтора. ANOVA с пост-хок Bonferroni (все группы) или Dunnett (vs контроль). p<0,05 — значимо.

Результаты

Характеристика N₂O-mbs

Модифицированный метод механической осцилляции дает стабильный молочно-белый суспензию (рис. 1а). N₂O-mbs не меняли размер и морфологию после 72 ч хранения при комнатной температуре. Под световым микроскопом — равномерный размер, хорошая дисперсия, высокая стабильность (рис. 1б). Концентрация 5,12±0,45×10⁸ пузырьков/мл. TEM (рис. 1в): размер равномерно распределен, средний ~450 нм. Динамическое рассеяние: гидродинамический диаметр 458,1±17,26 нм (полидисперсность 0,368; рис. 1г), согласуется с TEM. Дзета-потенциал -16,2±0,35 мВ (рис. 1д) (Доп. файл 1: Рисунок S1).

Внутриклеточное поглощение и биосовместимость N₂O-mbs

Цитотоксичность in vitro — CCK-8. Жизнеспособность контроля = 100%. Через 24 ч инкубации — нет значимой цитотоксичности для MDA-MB-231. Даже при высоких концентрациях жизнеспособность >95% (рис. 2а). Цитотоксичность in vivo на здоровых нюд-мусах: ГЭ основных органов (сердце, печень, селезенка, легкие, почки) — нет значимого токсического повреждения (рис. 2б). N₂O-mbs имеют высокую биосовместимость.

Внутриклеточное поглощение при длительной инкубации (2 и 4 ч) — CLSM. Инкубация с DiI-N₂O-mbs привела к накоплению большого количества пузырьков в мембране и цитоплазме раковых клеток. На рис. 2в — хорошая колокализация красных N₂O-mbs с синими ядрами (DAPI). N₂O-mbs эффективно интернализируются в клетки MDA-MB-231.

Сонодинамический эффект N₂O-mbs In Vitro

SOSG — чувствительный зонд синглетного кислорода [30, 31]. Для изучения потенциала N₂O-mbs как соносенсибилизатора SOSG детектировал генерацию РК in vitro. SOSG + ¹O₂ → SOSG-EP, рост флуоресценции. На рис. 3а: после УЗ-облучения SOSG с N₂O-mbs флуоресценция значительно выросла; по сравнению с остальными группами генерация кислородных радикалов значимо увеличилась (p<0,01).

Помимо внеклеточного детектирования, внутриклеточные РК — DCFH-DA набор. На рис. 3б: позитивный контроль — наивысшая флуоресценция. Следующая по силе зеленая флуоресценция только в группе LIFU-N₂O-mbs, показывая существенное продукцию РК при одновременном наличии N₂O-mbs и LIFU. В остальных группах — нет явной флуоресценции (рис. 3в). Жизнеспособность контроля = 100%. CCK-8: ~46% гибели клеток в группе LIFU-N₂O-mbs (рис. 3г). Циттоксичность N₂O-mbs + LIFU — CLSM после лечения. CAM — живые (зеленые), PI — мертвые (красные). На рис. 4а: много мертвых клеток в группе LIFU-N₂O-mbs. Флоу цитометрия: а폽тоз MDA-MB-231 значимо выше других групп (p<0,05) после комбинированного N₂O-mbs + LIFU (рис. 4б). C₃F₈-mbs + LIFU не вызывали явной гибели/апоптоза. Результаты подтверждают обширный а폽тоз и некроз от SDT. Флоу цитометрия согласуется с CLSM. N₂O-mbs + LIFU индуцируют а폽тоз опухолевых клеток in vitro (Доп. файлы 2, 3: Рисунки S2, S3).

In vitro оценка синергетического эффекта HIFU в раковых клетках

Флоу цитометрия (рис. 5а): и N₂O-mbs, и C₃F₈-mbs повышают смертность MDA-MB-231 после HIFU аблиации. По сравнению с HIFU-C₃F₈-mbs, N₂O-mbs значимо увеличивают а폽тоз (p<0,05; рис. 5б). NO-тест: флуоресценция супернатанта HIFU-N₂O-mbs значимо выше остальных (p<0,05) (рис. 5в). Изменения цитоплазмы и органиелл — TEM (рис. 5г). Контроль — цельная морфология. HIFU — много вакуол в цитоплазме, но целые мембраны клетки и ядер. HIFU-N₂O-mbs и HIFU-C₃F₈-mbs — потеря целостности мембраны, полная дезинтеграция структуры. TEM фиксирует момент в процессе гибели/апоптоза. N₂O-mbs как экзогенные микропузырьки имеют явный синергетический эффект на HIFU. В группе HIFU-N₂O-mbs сонодинамический эффект N₂O-mbs способствует большему аоптозу. Результаты подтверждены флоу цитометрией и in vivo (Доп. файлы 4, 5: Рисунки S4, S5).

N₂O-mbs как синергетик для HIFU терапии

После HIFU аблиации изолированной печени быка появился серо-белый коагулятивный некротический регион в мишени (рис. 6б). Средние изменения эхоинтенсивности до и после HIFU (рис. 6в). По сравнению с ФСБ, эхоинтенсивность групп C₃F₈-mbs и N₂O-mbs значимо увеличилась после HIFU (p<0,05) и росла с увеличением мощности HIFU. Объем коагулятивного некроза и эхоинтенсивность B-режима в обеих группах увеличивались с ростом мощности HIFU (рис. 6г, д).

Синергетический эффект N₂O-mbs на HIFU верифицирован in vivo. На рис. 7а: цифровые фото мышей и эксцизированных опухолей через 21 день после лечения. Рост опухоли эффективнее ингибирован после HIFU + N₂O-mbs. Оценка синергизма ГЭ, PCNA, TUNEL (рис. 7б): HIFU + N₂O-mbs вызывает более масштабный некроз опухолевых клеток vs HIFU-C₃F₈-mbs. Морфологические изменения в HIFU-N₂O-mbs более выражены: кариопикноз, кариорексис, кариолиз — существенный некроз. Объем опухоли в группе HIFU-N₂O-mbs демонстрирует более значимое ингибирование vs HIFU-C₃F₈-mbs в течение 21 дня (рис. 7в, г).

Обсуждение

HIFU как новый метод онкотерапии клинически признан и достиг прогресса в лечении солидных опухолей [32]. Тепловой, кавитационный, механический и акустико-химический эффекты играют значимую роль в гибели опухолевых клеток и необратимом повреждении тканей мишени при HIFU аблиации [33]. HIFU мало влияет на окружающие нормальные ткани — по сути неинвазивное лечение. Однако энергия ультразвука аттенуируется из-за увеличения дистанции, абсорбции кровотоком в мишени, блокировки костями или газами в теле, снижая энергию в мишени. Увеличение времени аблиации и мощности повышает риск повреждения нормальных тканей: ожоги кожи, нейроваскулярные повреждения, осложнения [34]. Необходимо повысить эффективность HIFU. Многие исследования подтверждают, что и микропузырьки, и SDT улучшают эффективность HIFU [15, 16, 35]. N₂O-нагруженные микропузырьки в данном исследовании имеют меньший размер частиц, но похожие характеристики с ультразвуковыми контрастными агентами. Научные работы показывают, что нано/микропузырьки имеют такую же визуализационную способность, как микропузырьки in vitro, но большую in vivo [36]. Так N₂O-mbs могут использоваться для УЗ-навигации и локализации HIFU, а также как экзогенные микропузырьки для усиления эффективности HIFU (Доп. файл 6: Рисунок S6). Одновременно сонодинамический эффект N₂O-mbs эффективно улучшает эффективность HIFU. Генерация РК после ультразвукового возбуждения — один из важнейших факторов для соносенсибилизаторов [16]. Для верификации соносенсибильности N₂O-mbs в работе детектировали продукцию РК как во внеклеточной, так и внутриклеточной среде. Оба теста показали, что N₂O-mbs генерируют РК и в водном растворе, и внутриклеточно. Известно, что газы (N₂, O₂), захваченные в кавитационных ядрах в растворе, могут проходить расщепление с образованием N и O свободных радикалов [37, 38]: N₂O → N₂ + O₂; O₂ → 2•O; N₂ → 2N• + HO• → NO + H•; NO + HO• → HNO. Кавитационный эффект и преимущество микропузырьковой упаковки снижают сложность реакции N₂O [39]. При инкубации с клетками N₂O-mbs проявляют хорошую биосовместимость. Высокая селективность, аффинность и загрузка наночастиц [40], а также активная фагоцитоз клетками способствуют эффективному связыванию N₂O-mbs с раковыми клетками. Нанопузырьки демонстрируют повышенную проникаемость, стабильность и легкость входа в клетки или агрегации вокруг них [36]. Сонопорационный эффект ультразвука эффективно промоциирует перенос микропузырьков в клетки [41].

В отличие от традиционного контрастного агента C₃F₈-mbs, N₂O-mbs имеют больший ингибирующий эффект на рост клеток после УЗ-облучения: повышение внутриклеточных РК, снижение жизнеспособности, а폽тоз и некроз. Это предварительно указывает на сонодинамический токсический эффект N₂O-mbs.

В HIFU синергии эксперименте параметры группы установлены 125 Вт, 5 с по анализу результатов и литературе, что подтвердило, что низкая мощность HIFU может индуцировать достаточное аблиационное действие и снизить побочные эффекты. Результаты: N₂O-mbs увеличивают некроз и продвигают а폽тоз большего числа опухолевых клеток. N₂O-mbs как наномасштабный микропузырьковый синергетик и его сонодинамический эффект в ответ на HIFU могут быть причиной разных результатов. Как микропузырек, N₂O-mbs увеличивают депонирование энергии HIFU в мишени, повышают температуру мишени и усиливают тепловой эффект [11]. Генерация кавитационного эффекта тесно связана с кавитационным порогом и концентрацией кавитационных ядер [42]. N₂O-mbs — кавитационные ядра, снижающие порог HIFU и облегчающие кавитацию. Поэтому N₂O-mbs эффективно промоциируют некроз клеток. Как наномасштабный синергетик, N₂O-mbs лизируются и генерируют свободные радикалы и оксиды азота в ответ на ультразвук. РК — важные факторы индукции а폽тоза [43]. Много видов свободных радикалов повреждают клетки. Помимо кислородных радикалов, N₂O может генерировать азотистые свободные радикалы в реакциях расщепления, способствуя гибели опухолевых клеток. Небольшое количество NO детектировано в супернатанте после HIFU, дополнительно указывая на реакцию расщепления N₂O. An et al. [44] сообщали, что NO может иметь антиопухолевую функцию, механизм — атака NO подозреваемых железо-ферментов, вызывая неспособность клеток расти и делиться. Нестабильный NO взаимодействует с O₂, образуя гидроксил-радикалы (HO•) и NO₂. HO• — крайне цитотоксичны, промоциируют а폽тоз. NO — эндотелиальный релаксирующий фактор. Генерация NO может быть причиной гиперемии и аномального отека у пациентов при HIFU-операциях. В эксперименте с эксцизированной печенью мы тщательно сравнили эхоинтенсивность B-режима, патофизиологические изменения и объем коагулятивного некроза мишени после HIFU аблиации с N₂O-mbs, C₃F₈-mbs и ФСБ. Все результаты согласованы. По сравнению с ФСБ, N₂O-mbs эффективно усилили аблиационный эффект HIFU. Этот синергетический эффект также лучше продемонстрирован в аблиации солидной опухоли in vivo: увеличение а폽тоза, снижение объема опухоли, ингибирование роста. Это дополнительно указывает, что N₂O-mbs могут быть новым вспомогательным агентом для ультразвука, способствующим HIFU термической аблиации опухолей. Синергетический эффект и механизм N₂O-mbs в HIFU дают новые идеи и теоретическую практику для исследований HIFU синергетиков. Но другие связанные механизмы синергии требуют дальнейшего изучения. Эффект аблиации опухоли HIFU в комбинации с N₂O-mbs должен быть дополнительно адресован.

Заключение

Разработаны нанопастицы N₂O-mb. Определены характеристики и биосовместимость N₂O-mbs. Соносенсибильность N₂O-mbs изучена детектированием продукции РК в водном растворе и внутриклеточно. По сравнению с C₃F₈-mbs, N₂O-mbs генерировали РК и промоциировали а폽тоз и некроз опухолевых клеток, демонстрируя исключительную соносенсибильность. В экспериментах на синергию HIFU сонодинамические эффекты N₂O-mbs значимо увеличили а폽тоз и некроз опухолевых клеток in vitro, увеличили объем коагулятивного некроза и эхоинтенсивность в мишени эксцизированной печени быка ex vivo, и эффективно ингибировали рост опухоли in vivo. Результаты указывают, что N₂O-mbs могут быть новым видом соносенсибилизатора и новым вспомогательным агентом для ультразвуковой терапии, используемым для аблиации опухолей HIFU.

Доступность данных и материалов

Выводы данной рукописи основаны на данных, все представленные и показанные в этой статье.

Аббревиатуры

N₂O-mbs:

Микропузырьки N₂O

C₃F₈-mbs:

Микропузырьки C₃F₈

HIFU:

Высокоинтенсивный фокусированный ультразвук

LIFU:

Низкоинтенсивный фокусированный ультразвук

SOSG:

Singlet oxygen sensor green

SDT:

Сонодинамическая терапия

DPPC:

1,2-дигексадеканоил-рак-глицеро-3-фосфохолин

DSPE-mPEG2000:

1,2-дистеароил-сн-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000]

DAPI:

4′,6-диамидино-2-фенилиндол

DiI:

1,1′-диоктадецил-3,3,3′,3′-тетраметилиндокарбоцианин перхлорат

DCFH-DA:

2′,7′-дихлорофлуоресцеин диацетат

DAF-FM:

3-амино,4-аминометил-2′,7′-дифлуоресцеин, диацетат

CAM:

Calcein-AM

CCK-8:

Cell Counting Kit-8

CLSM:

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

TEM:

Проходная электронная микроскопия

DMEM:

Модифицированное среднее Дюльбекко

FBS:

Фетальная бычья сыворотка

PBS:

Фосфатно-буферный раствор

DI:

Деионизированная вода

ROI:

Зоны интереса

ROS:

Реактивные формы кислорода

NO:

Оксид азота