Наночастицы ламинарина, нагруженные протопорфирином IX, для противоопухолевого лечения, их клеточного поведения, обнаружения ROS и исследований на животных

Введение

Фотодинамическая терапия (ФДТ) [1,2,3] - это общепризнанный вид терапии с воздействием источника света, фотосенсибилизатора и молекулярного кислорода [4], который может производить опосредованные реактивными формами кислорода (ROS) [5, 6] прямые летальные исходы. воздействие на раковые клетки в пределах освещенной территории при условии минимально инвазивного характера [6] и низкой токсичности. Он может вызывать повреждение ДНК [7], активировать сигнальные пути для облегчения васкулотоксической реакции, которая препятствует кровоснабжению области опухоли [8], а также провоцировать распознавание и разрушение опухолевых клеток иммунной системой [9]. Конечным эффектом является преодоление лекарственной устойчивости [10, 11] и проявление избирательного противоопухолевого эффекта, приводящего к гибели раковых клеток.

В настоящее время в клинике широко используются традиционные методы лечения опухолей [12], такие как лучевая терапия, химиотерапия и хирургия, но эти методы имеют сильные токсические и побочные эффекты, большую травму, большой риск, определенные ограничения и легкое рецидивирование. ФДТ используется при лечении обширного рака, включая рак груди [13,14,15], гепатоцитов [14], легких [16], меланомы [17] и кожи [18], что привлекает внимание отечественных и зарубежных исследователей. . Опыт доказал, что ФДТ - лучший выбор для замены традиционных методов, таких как химиотерапия [19] и хирургия, в терапии различных заболеваний и опухолей [20], поскольку она имеет такие преимущества, как подавление метастазирования рака [21], а также избирательность и адаптируемость. Однако применение большинства фотосенсибилизаторов в терапии рака ограничено из-за их ограниченного накопления в очаге опухоли [22].

Протопорфирин IX (Pp IX) - гидрофобный фотосенсибилизатор [23, 24], имеющий большой потенциал для использования в диагностике и ФДТ. Pp IX представляет собой производное гематопорфирина, которое также может вызывать апоптоз без внешнего стимула (например, лазерного света [25]), показывая, что он, вероятно, обладает функцией новизны для лечения рака [26].

Таким образом, местное накопление Pp IX в предраковых и злокачественных поражениях является интересной стратегией [27], поскольку его флуоресценция обеспечивает удобный метод ориентации опухоли [28].

Однако Pp IX имеет некоторые недостатки, которые необходимо решить [29], например, он имеет плохую растворимость и легко агрегируется в водном растворе, что приводит к снижению эффективности. Таким образом, ламинарин [30] представляет собой биоматериал-носитель для морских наномедицин, который используется в качестве носителя гидрофильных групп для улучшения неблагоприятных свойств фотосенсибилизаторов. Доказано, что ламинарин обладает эффективными биологическими активностями, в том числе противоопухолевыми, противовирусными и так далее. Накапливающиеся данные показывают [31], что он обладает хорошей терапевтической эффективностью в отношении различных типов раковых клеток in vitro и in vivo (таких как клетки рака груди и толстой кишки [32]).

Чувствительные к стимуляции полимерные наночастицы, такие как липосомы и мицеллы, могут дополнительно обеспечить доставку лекарств и уменьшить побочные эффекты. Липосомы [33] могут использоваться в качестве диагностических и терапевтических инструментов, а амфотерицин B может быть включен в липосомы для лечения грибковых инфекций [34]. Полимерные мицеллярные наночастицы [35] являются умным средством доставки лекарств [36]. Загруженные Pp IX мицеллы гематин-ламинарин-дитиодипропионовая кислота-MGK (HLDM) с двойной чувствительностью к pH / окислительно-восстановительному потенциалу и фотоответом содержат гидрофобное ядро ​​для загрузки Pp IX, а также гидрофильную оболочку ламинарина. Они сыграли важную роль в наноскопической доставке лекарств для улучшения неблагоприятных свойств фотосенсибилизаторов [37], таких как биораспределение лекарств, побочные эффекты и высвобождение лекарств [38, 39].

В связи с этим мы разработали многофункциональную наноплатформу для доставки лекарств [40] на основе ламинарина в ответ на pH [41] и окислительно-восстановительные свойства [42], которая может поддерживать растворимость в воде и гасить Pp IX в кровообращении человеческого тела, в то время как расщепление Pp IX в сайтах-мишенях [43]. Большое внимание уделяется способам доставки лекарств, реагирующим на внутренние и внешние раздражители, таким как температура [44], ультразвук [45], pH и окислительно-восстановительный потенциал. Система термореактивного реагирования была изучена для контроля доставки лекарств, показав потенциал для лучшей доставки лекарств [46]. Система доставки лекарств, реагирующая на раздражители, способствует непрерывному высвобождению лекарств по требованию [47], необратимо и быстро распространяется.

В этом исследовании были приготовлены мицеллы HLDM, нагруженные Pp IX, для преодоления некоторых недостатков Pp IX [48], таких как нестабильность и агрегация в водном растворе. Мы предположили, что загруженные Pp IX мицеллы HLDM, самоорганизующиеся из наноносителей HLDM [49], должны накапливаться и высвобождать Pp IX в микросреде опухоли [50]. Pp IX стимулировался для облегчения образования ROS после накопления Pp IX в опухолевых клетках, что могло вызвать гибель раковых клеток (как на рис. 1). Синтез и характеристика материалов HLDM были подтверждены 1H-ЯМР, как сообщалось ранее [51]. Итак, в настоящей работе изучались клеточное поглощение, фототоксичность, генерация АФК, морфологические наблюдения ядра и эффект ФДТ in vivo мицелл HLDM, нагруженных Pp IX.

Схематическое изображение наномедицины на основе ламинарина (HLDM), используемой для доставки фотосенсибилизатора для терапии опухолей

Методы

Материалы

Ламинарин был приобретен в Sigma-Aldrich (Шанхай, Китай). Диметилсульфоксид (ДМСО) был поставлен Tianjin Bodi Co. Ltd. l-глутатион (GSH), Hoechst 33342 предоставлен Sigma-Aldrich (Шанхай, Китай). Среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM), и фетальная бычья сыворотка (FBS) были получены от Science Biotechnology Co. Ltd. (Shangdong, Yantai, China). Набор для анализа активных форм кислорода (ROS) был предоставлен Beyotime Biotechnology (Шанхай, Китай). Привет & E были приобретены у Bioworld Technology Co. Ltd. (Нанкин, Китай). Pp IX был поставлен компанией Aladdin Reagent Net (Шанхай, Китай). Все остальные реагенты и растворители были химической чистоты.

Клетки рака груди человека (MCF-7) были предоставлены лабораторией молекулярной фармакологии фармацевтического факультета Яньтайского университета (Шаньдун, Китай).

Самок мышей nude весом 14–18 г (3–4 недели) были приобретены у Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co. Ltd.

Синтез и характеристика материалов HLDM

Материалы HLDM были синтезированы и предоставлены с использованием методов, представленных в предыдущих отчетах [51]. Во-первых, оксалоилхлорид использовали для активации дитиопропионовой кислоты в ацилхлорид, который ацилировали MGK с получением HOOC-S-S-MGK. После этого для активации HOOC-S-S-MGK использовали гидрохлорид 1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимида (EDCI) и 4-диметиламинопиридин (DMAP), а затем проводили реакцию этерификации ламинарином при 40 ° C. Наконец, мы синтезировали материалы HLDM путем этерификации с использованием EDC / DMAP в качестве катализатора. ДМСО-Д ₆ и D ₂ О был выбран в качестве растворителя для анализа состава соединений. И ¹ H-ЯМР (Advance Bruker 400M; Switzerland Bruker Company, Мэдисон, Висконсин, США) спектры, ИК-спектры и спектры поглощения в УФ-видимой области (200–700 нм) для материалов HLDM были протестированы и определены при комнатной температуре.

Получение мицелл самосборки (мицеллы HLDM, загруженные Pp IX)

Мицеллы HLDM, нагруженные Pp IX, использовали методом диализа. В двух словах, гидрофобное ядро ​​состоит из MGK, дитиодипропионовой кислоты и гематина, а также гидрофильная оболочка ламинарина может самоорганизовываться в воде с образованием полимицелл. Pp IX загружали в гидрофобное ядро ​​во время перемешивания для получения нагруженных Pp IX мицелл HLDM. HLDM и Pp IX диализовали в деионизированной воде (MWCO 2000 Да) на мешалке 90-1 при 600 об / мин после перемешивания в течение разумного времени в органическом реагенте для растворения с последующей обработкой для получения мицелл HLDM, нагруженных Pp IX. Вся процедура проходила при комнатной температуре.

Характеристика мицелл

Размер частиц и дзета-потенциал мицелл HLDM, нагруженных Pp IX, определяли с использованием анализатора частиц Beckman Coulter (номер детали:A35878) при комнатной температуре. Морфологию мицелл HLDM, нагруженных Pp IX, визуализировали с помощью просвечивающего электронного микроскопа H-600 (H-600 TEM; Hitachi, Tokyo, Japan). Для определения загрузочной способности мицеллы HLDM, нагруженные Pp IX, разрушали ультразвуковым устройством в органическом реагенте. Концентрацию свободного Pp IX в мицеллах измеряли по спектрам поглощения в УФ-видимой области при 630 нм. Эффективность улавливания (EE) и загрузка лекарственного средства (DL) рассчитывались по формуле.

EE (%) =(масса Pp IX в мицеллах HLDM, нагруженных Pp IX / масса всего Pp IX) × 100%

DL (%) =(масса Pp IX в мицеллах HLDM, нагруженных Pp IX / масса мицелл) × 100%

Культура клеток

Линии клеток рака груди человека (MCF-7), линии клеток рака толстой кишки (CT-26) (рис. 5) и линии клеток рака легких (A549) (рис. 5) были использованы для определения мицелл HLDM, нагруженных Pp IX. с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа (AxioVert.A1). Предварительно было широко доказано, что эти материалы обладают противоопухолевым действием. Но эксперимент показал, что MCF-7 может поглощать больше, чем две другие линии раковых клеток. Поэтому MCF-7, культивированный в DMEM (Hyclone) с 10% фетальной бычьей сывороткой, был выбран для мониторинга лечебного эффекта при 37 ° C в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO ₂ .

Поглощение ячеек

Свежую среду, содержащую свободный Pp IX, мицеллы ламинарина-гематина (LH), нагруженные Pp IX, или мицеллы HLDM, нагруженные Pp IX, добавляли для замены исходной среды через 24 часа соответственно. Затем клетки MCF-7 культивировали в течение 1 ч, 2 ч и 4 ч (концентрация Pp IX:20 мкг / мл) или в течение 4 ч со следующими различными концентрациями Pp IX:10 мкг / мл, 20 мкг / мл, и 50 мкг / мл в атмосфере выше. Последствия клеточного поглощения наблюдались с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа (Eclipse E400; Nikon Corporation, Токио, Япония) для качественного анализа [52].

Исследование местоположения ячейки

В этом исследовании Pp IX был не только противораковым препаратом, вызывающим гибель раковых клеток, но и зондом красной флуоресценции для определения места захвата. Клетки MCF-7 в свежей среде, содержащей свободный Pp IX, мицеллы LH, нагруженные Pp IX, или мицеллы HLDM, нагруженные Pp IX, культивировали в течение 4 ч при концентрации 20 мкг / мл выше атмосферы. После фиксации 4% параформальдегидом фиксатор заменяли на Hoechst 33342 (10 мкг / мл) для окрашивания ядра в течение 15 мин. Результат определения местоположения был визуализирован с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа.

Измерение образования активных форм кислорода

Способность к образованию активных форм кислорода (АФК) измеряли внутриклеточно с помощью флуоресцентного микроскопа, в котором использовался зонд АФК 2 ', 7'-дихлорфлуоресциндиацетат (DCFH-DA). MCF-7 высевали в шестилуночные планшеты и инкубировали. Через 24 часа среду удаляли и заменяли свежей средой, содержащей свободные мицеллы HLDM, нагруженные Pp IX или Pp IX (20 мкг / мл), на 2 часа. Клетки промывали средой DMEM с последующим получасовым облучением (630 нм). После двукратной промывки клетки MCF-7 инкубировали с DCFH-DA (10 мкмоль / л) при температуре выше атмосферы в течение 30 мин, которые затем отображали с помощью флуоресцентного микроскопа (длина волны возбуждения:488 нм, длина волны излучения:525 нм) после повторной промывки. со средой DMEM.

Анализы фототоксичности и жизнеспособности

MCF-7 инокулировали 96-луночным растением для определения цитотоксичности различных лекарственных форм для анализа жизнеспособности. Затем в каждую лунку добавляли свежую DMEM, включающую различные концентрации свободных Pp IX, мицелл LH, нагруженных Pp IX, или мицелл HLDM (1, 2, 5 и 10 мкг / мл). Для группы фототоксичности клетки инкубировали в течение 4 часов для поглощения, и их дополнительно облучали в течение 30 минут с последующей инкубацией в течение 24 часов при температуре выше атмосферы. С другой стороны, лунки были созданы для анализа цитотоксичности и жизнеспособности в темноте в качестве контрольной группы. Затем они были инокулированы в течение 24 часов при температуре выше атмосферы.

Затем в 96-луночный планшет добавляли двадцать микролитров раствора 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромида (МТТ) (5 мг / мл) и 180 мкл PBS (pH 7,4). чашку и инкубируют еще 3 ч. Затем для растворения формазанового продукта использовали 150 мкл ДМСО и измеряли оптическую плотность (OD), используя меченый ферментом прибор (SpectraMax M 5) при 490 нм. Жизнеспособность MCF-7 выражали с помощью следующей формулы:

Жизнеспособность =((OD образца-OD черный) / (OD контроль-OD черный)) × 100%.

Значения OD образца были предоставлены клетками, обработанными лекарственным средством, тогда как значения OD контроля были предоставлены клетками без лекарственного средства, а значения OD черного были получены из лунок без лекарственного средства и клеток.

Ядерные морфологические наблюдения

Клеточную линию MCF-7 инкубировали в течение 24 часов, а затем стимулировали мицеллами HLDM, нагруженными Pp IX, в течение 4 часов. После промывки и фиксации клетки окрашивали зондом ядерной флуоресценции в течение 20 мин при 37 ° C с последующим удалением красителя из окружающей среды с помощью PBS. Соответствующие флуоресцентные изображения были визуализированы с помощью флуоресцентной микроскопии.

Оценка эффективности и безопасности in vivo

Впоследствии самок мышей nude использовали для исследования возможности противоопухолевого лечения мицелл HLDM, нагруженных Pp IX, in vivo. Ячейки MCF-7 (1,5 × 10 ⁶ клеток / 0,1 мл) инъецировали самкам голых мышей в качестве животных моделей, а затем вводили эстроген через желудочный зонд для стимуляции роста опухоли. Мышей случайным образом разделили на пять групп, когда объем опухолей достиг примерно 70–100 мм ³ . , которые были обозначены как физиологический раствор, свободный Pp IX (5 мг / кг), нагруженные Pp IX мицеллы HLDM (5 мг / кг эквивалентов свободного Pp IX), свободный Pp IX (5 мг / кг) плюс световое облучение и Нагруженные Pp IX мицеллы HLDM (5 мг / кг эквивалентов свободного Pp IX) плюс световое облучение. Группы, обработанные светом, подвергались воздействию лазера с длиной волны 630 нм в течение 30 минут через 24 часа после инъекции. Терапевтическая эффективность оценивалась путем мониторинга объемов опухоли в пяти обработанных группах через день и анализа гистопатологического слайда через 20 дней. А вес тела измерялся для оценки безопасности препарата в пяти группах лечения каждые 2 дня [53].

Статистический анализ

Все данные в этом исследовании были записаны как средние значения ± стандартное отклонение ( n =3). Более того, значимые различия между разными группами были проанализированы с использованием одностороннего анализа вариаций (ANOVA). Различия считались статистически значимыми при уровнях вероятности * P < 0,05 (значимо), ** P < 0,01 (высокая значимость).

Результаты и обсуждение

Характеристика материалов HLDM

¹ Спектры H-ЯМР для материалов HLDM были показаны в предыдущих отчетах [51]. Пик метила для MGK наблюдался при δ:0,8 (фиг. 2h). ¹ Спектры H-ЯМР показали пик поглощения примерно при δ:2,8 (фиг. 2g), который соответствует CH ₂ в 3,3-дитиодипропионовой кислоте. Появление пика сигнала при δ:6.5 (рис. 2j) подтвердило присутствие гематина. Характерный пик для ламинарина в амфифильных полимерных материалах был обнаружен в диапазоне от 3 до 4 частей на миллион, что свидетельствует об успешном синтезе нового продукта HLDM.

¹ Спектры H-ЯМР HLDM

ИК-спектр для HLDM

ИК-спектры материалов HLDM были показаны в предыдущих отчетах [51]. Двойной пик на картинке свидетельствовал о подключении MCK. Кроме того, в ИК-спектрах наблюдался характерный пик сложноэфирной карбонильной группы.

Спектры поглощения HLDM в УФ-видимой области

На фиг. 3а гематин имел длину волны поглощения ультрафиолетового излучения (около 580 нм), а на фиг. 3b ламинарин-дитиодипропионовая кислота-MGK не имел поглощения в том же положении. Спектры поглощения в УФ-видимой области были выполнены для проверки связи гематина на основе этого. Результат показал, что характерная длина волны поглощения в 580 нм наблюдалась в материалах HLDM (рис. 3c). Гематин был успешно соединен с материалами HLDM.

Спектры поглощения гематина в УФ-видимой области ( a ), Ламинарин-С-С-МГК ( б ) и HLDM ( c )

Характеристика мицелл, загруженных Pp IX

Размер и дзета-потенциал мицелл HLDM, нагруженных Pp IX, показаны на рис. 4a, b. Было показано, что мицеллы лучше абсорбируются раковыми клетками, что увеличивает эффективность и снижает побочные эффекты (повышенная проницаемость и удерживающий эффект, EPR). Мицеллы были видны невооруженным глазом после мембранного фильтра Millipore на рис. 4c. На основании этого изображение мицелл HLDM, нагруженных Pp IX, сканировали с помощью просвечивающего электронного микроскопа (TEM), как показано на фиг. 4d. Морфология была неоднородной из-за недостатка времени для ультразвука. С другой стороны, на изображении наблюдалась агломерация частиц, вероятно, из-за более высокой концентрации (рис. 5).

а , b Размер и дзета-потенциал мицелл HLDM, нагруженных Pp IX. c Мицеллы HLDM, нагруженные Pp IX, в воде. г ПЭМ-изображение мицелл HLDM, нагруженных Pp IX

Поглощение свободных мицелл HLDM, нагруженных Pp IX, Pp IX, и Pp IX, в CT-26 (слева) и A549 (справа)

Эффективность улавливания (EE) и содержание нагрузки лекарственного средства (DL) рассчитывали по формуле (Таблица 1). После многих экспериментов было обнаружено, что колебания EE и DL были нестабильными, поскольку мы предполагали, что мицеллы HLDM, нагруженные Pp IX, могут агрегироваться в водном растворе.

Использование сотовой связи

В этом исследовании флуоресценция Pp IX была обнаружена для изучения зависимости от времени и концентрации. Как видно из диаграммы, мицеллы HLDM, нагруженные Pp IX, абсорбировались клетками MCF-7, и их интенсивность флуоресценции увеличивалась со временем и концентрацией. При сравнении трех мицелл на фиг. 6а, раковые клетки, которым были введены нагруженные Pp IX мицеллы HLDM, имели более высокую флуоресценцию. Это произошло потому, что pH / окислительно-восстановительные составляющие были связаны с материалами, чтобы реагировать на микроокружение опухоли. Раковые клетки, которым давали свободный Pp IX, имели более слабую флуоресценцию из-за агрегации в DMEM.

а Поглощение свободных мицелл HLDM, нагруженных Pp IX, Pp IX и LH. б Расположение клеток мицелл HLDM, нагруженных Pp IX

Из того, что обсуждалось выше, мы можем с уверенностью сделать вывод о том, что материалы HLDM, включая компоненты, чувствительные к pH и снижению чувствительности, могут улучшить агломерацию Pp IX и повысить их абсорбцию и высвобождение в опухолевых клетках.

Исследование местоположения ячейки

Как показано на рис. 6b, ядро ​​было окрашено флуоресцентным красителем, и тогда мы могли видеть явление красной флуоресценции, представленное вне синей флуоресценции. Мы предположили, что поглощение клетками может быть связано с цитоплазмой, поэтому эта гипотеза была подтверждена предыдущим исследованием, что Pp IX накапливался и локализовался в митохондриях и цитоплазме опухолевых клеток [54].

Измерение образования активных форм кислорода

Как показано на фиг. 7, за активными формами кислорода (ROS) в клетках MCF-7 наблюдали с использованием DCFH-DA в качестве индикатора, который, как было обнаружено, имел зеленую флуоресценцию при флуоресцентной микроскопии. Мицеллы HLDM, нагруженные Pp IX, обладали более высокой интенсивностью зеленой флуоресценции на свету, в то время как свободный Pp IX практически не имел флуоресценции. Мы предположили, что свободный Pp IX может агломерировать, вызывая эффект самогашения в DMEM. Зеленая флуоресценция трех групп была незначительной без света (например, контрольной группы). Эти результаты подтвердили, что Pp IX может стимулировать выработку кислородом АФК в качестве фотосенсибилизатора в условиях света.

Генерация активных форм кислорода (АФК) при освещении

Анализ фототоксичности и жизнеспособности

Анализ цитотоксичности и жизнеспособности клеток проводили с раковыми клетками груди человека MCF-7 в двух различных внешних средах с использованием анализа МТТ. Как показано на фиг. 8а, значительная разница в повреждении клеток была незначительной во всех образцах в темноте. Когда концентрация Pp IX была увеличена до 50 мкг / мл, жизнеспособность клеток MCF-7, которую мы обнаружили, оставалась на высоком уровне. Это явление показало, что цитотоксичность по отношению к клеткам или органам не увеличивается значительно при увеличении концентрации Pp IX.

а Жизнеспособность клеток MCF-7 свободных Pp IX, нагруженных Pp IX мицелл LH или нагруженных Pp IX мицелл HLDM в условиях освещения. б Относительная светотоксичность свободных Pp IX, мицелл LH, нагруженных Pp IX, или мицелл HLDM, нагруженных Pp IX, при облучении. нет =3; * обозначает P < 0,05

Как показано на рис. 8b, 5 мкг / мл Pp IX имели значительную разницу в группах свободных лекарств и мицелл. Цитотоксичность по отношению к клеткам или органам была значительно увеличена в группе мицелл, поскольку концентрация Pp IX увеличивалась на свету, в то время как группы свободных Pp IX демонстрировали незначительные изменения до концентрации 10 мкг / мл. Эти данные показали, что фототоксическая эффективность мицелл, нагруженных Pp IX, была явно выше, чем у свободного Pp IX. И снова эксперимент показал, что свободный фотосенсибилизатор может накапливаться, вызывая эффект самотушения. Таким образом, мы можем сделать вывод, что мицеллы HLDM, нагруженные Pp IX, обладают огромным потенциалом для уничтожения раковых клеток с помощью светового облучения.

Ядерно-морфологические наблюдения

При изучении местоположения клеток мы невольно обнаружили, что окрашенное ядро ​​показало белые пятна, и более высокая концентрация Pp IX была более очевидной с этим явлением. Возможно, это было из-за повреждения ДНК в ядре. Как показано на фиг. 8, мицеллы HLDM, нагруженные 20 мкг / мл Pp IX, могут вызывать повреждение ДНК по сравнению с соответствующим контролем в MCF-7. Когда концентрация достигнет 50 мкг / мл, раковые клетки будут серьезно повреждены. Исследование морфологии ядра показало, что повреждение ДНК было ранним маркером гибели клеток MCF-7, вызванной Pp IX [26] (рис. 9).

Повреждение ДНК клеток MCF-7 после обработки Pp IX

Оценка эффективности и безопасности in vivo

Как показано на фиг. 10a, b, рост опухоли в пяти группах измеряли для оценки эффективности in vivo. В группе, получавшей физиологический раствор, наблюдался непрерывный рост с относительно высокой скоростью. Не было значительного различия между группами, получавшими мицеллы HLDM, нагруженные свободными Pp IX и Pp IX, и группой, получавшей физиологический раствор. Эти данные показали, что Pp IX в меньшей степени влиял на объем опухоли без облучения. Между тем, в группе, получавшей свободный Pp IX плюс свет, наблюдалось небольшое изменение объема опухоли. Причиной этого явления было то, что свободное лекарство было нестабильным in vivo и поэтому его легко собирать в крови. Следовательно, он мог быть устранен до того, как попал в опухолевую ткань. Напротив, рост опухоли, обработанный мицеллами HLDM, нагруженными Pp IX, был значительно подавлен на фиг. 10a. Это явление доказало, что мицеллы проявляют значительный противоопухолевый эффект после воздействия света определенной длины волны для стимуляции. Подводя итог, этот эксперимент продемонстрировал, что противоопухолевые эффекты мицелл HLDM, нагруженных Pp IX, явно улучшились в условиях освещения.

Оценка противоопухолевой активности и безопасности in vivo. а Объем опухоли изменяется во время лечения. б Объем опухоли пяти групп:( a ) физиологический раствор, ( b ) свободный Pp IX (5 мг / кг), ( c ) Мицеллы HLDM, нагруженные Pp IX (5 мг / кг эквивалентов свободного Pp IX), ( d ) свободный Pp IX (5 мг / кг) плюс световое облучение и ( e ) Мицеллы HLDM, нагруженные Pp IX (5 мг / кг эквивалентов свободного Pp IX) плюс световое облучение. c Изменение тела голых мышей с опухолями

С другой стороны, для оценки безопасности мицелл HLDM, нагруженных Pp IX, измеряли относительную массу тела (фиг. 10c). Не было явной потери веса тела и незначительных изменений во всех группах, что свидетельствует о хорошей биобезопасности этого лечения для мышей.

Кроме того, гистопатологический слайд показал четкий ядерный полиморфизм в группе с физиологическим раствором на фиг. 11. Патологические изменения в опухолевой ткани, окрашенной гематоксилином и эозином (H&E), имели значительную разницу в пяти группах. Результаты показали небольшую ядерную конденсацию в мицеллах HLDM, нагруженных Pp IX, и свободных группах Pp IX. Опухолевые ткани из группы мицелл HLDM, нагруженных Pp IX (плюс легкие), демонстрировали очевидное ядерное повреждение. Таким образом, мы пришли к выводу, что эти результаты согласуются с приведенными выше результатами оценки эффективности и безопасности in vivo.

Окрашивание опухолей H&E различными препаратами. Все данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. нет =3; * обозначает P < 0,05

На сегодняшний день изучены самые разные материалы для доставки лекарств [55]. В предыдущем исследовании мы успешно синтезировали двойные pH / окислительно-восстановительные [56] конъюгаты морского полисахарида ламинарина, и в этом исследовании конъюгаты использовались в качестве системы доставки для Pp IX для достижения противоопухолевого эффекта. Эксперименты in vivo показали, что нагруженные Pp IX мицеллы HLDM могут эффективно доставлять Pp IX в раковые клетки и вызывать прямые летальные эффекты, опосредованные ROS, на раковые клетки. Эксперименты по цитотоксичности показали, что мицеллы обладают незначительной цитотоксичностью без облучения светом, в то время как растворы мицелл с низкой концентрацией оказывают заметное влияние на жизнеспособность клеток при определенном освещении. In animal level, Pp IX-loaded HLDM micelles exerted phototoxic effect to produce a relevant anti-tumor effect. Therefore, the activities of Pp IX-loaded HLDM micelles were convincingly certified in vitro and in vivo.

Conclusions

A novel laminarin-based nanomedicine platform to address undesirable characteristics of Pp IX such as instability and astatic distribution was successfully studied in this research. The photosensitivity and phototoxicity of Pp IX-loaded HLDM micelles were detected and evaluated in vitro and in vivo. Nuclear morphological observation of Pp IX showed that the Pp IX-loaded HLDM micelles could effectively deliver and accumulate Pp IX to cancer cells and cause nuclear damage. The research on phototoxicity and ROS production manifested that Pp IX-loaded HLDM micelles exhibited a relevant PDT effect, exerting anti-tumor activity with a certain wavelength light. Likewise, the in vivo research testified that the Pp IX-loaded HLDM micelles could induce PDT effect under the light condition, which could remarkably enhance the anti-tumor effect of Pp IX. To sum up, the results for in vitro and in vivo studies indicated that Pp IX-loaded HLDM micelles could effectively produce PDT effect and can be applied in the future in tumor treatment in the next research. This promising laminarin-based nanomedicine platform will have great potential for becoming new drug delivery system [57] to deliver hydrophobic photosensitizer for cancer photodynamic therapy (PDT).

Доступность данных и материалов

The datasets supporting the conclusions of this article are included within the article.

Сокращения

HLDM:

Hematin-Laminarin-Dithiodipropionic acid-MGK

LH:

Laminarin-Hematin

Pp IX:

Protoporphyrin IX

PDT:

Photodynamic therapy

ROS:

Активные формы кислорода