Наночастицы на основе ламинарина для доставки протопорфирина IX: усиленная фотодинамическая терапия рака молочной железы

Аннотация

Были спроектированы амфифильные мицеллы на основе конъюгата ламинарина (HLDM) для инкапсуляции гидрофобного фотосенсибилизатора протопорфирина IX (Pp IX) с целью фотодинамической терапии (ФДТ) рака молочной железы. Полученные мицеллы диаметром ~149 нм продемонстрировали двойную pH- и редокс-чувствительную свободу, улучшив водорастворимость и биосовместимость. В витровных исследованиях на клетках MCF-7 выявлены эффективное клеточное поглощение, световозависимая генерация активных форм кислорода (АФК) и апоптоз с повреждением ядер. В ксенотрансплантационной модели на голых мышах Pp IX-загруженные HLDM-мицеллы в сочетании с облучением 630 нм вызвали выраженное подавление роста опухоли без системной токсичности. Результаты показывают, что ламинариновая наноплатформа может существенно улучшить доставку Pp IX и эффективность ФДТ in vitro и in vivo.

Введение

Фотодинамическая терапия (ФДТ) использует фотосенсибилизатор, свет и молекулярный кислород для генерации АФК, селективно уничтожающих опухолевые клетки и щадящих здоровые ткани. Она стала малоинвазивной опцией для различных злокачественных новообразований — рака молочной железы, печени, легких, меланомы и кожи — однако клиническое применение ограничено низкой накопленностью обычных фотосенсибилизаторов в опухоли.

Протопорфирин IX (Pp IX) — мощный, но гидрофобный фотосенсибилизатор, склонный к агрегации в водных средах, что сужает терапевтическое окно. Морской полисахарид ламинарин, известный биосовместимостью и врожденной антиопухолевой активностью, предлагает гидрофильную оболочку, способную стабилизировать гидрофобные лекарства и придавать свойства таргетирования на опухоль за счет pH- и редокс-чувствительности.

Мы сообщаем о синтезе двойной pH/редокс-чувствительной мицеллярной системы гематин-ламинарин-дитиодипропионовая кислота-MGK (HLDM), инкапсулирующей Pp IX, для улучшения растворимости, усиления накопления в опухоли и максимизации АФК-опосредованной цитотоксичности.

Методы

Материалы

Ламинарин (Sigma-Aldrich), DMSO, L-глутатион, Hoechst 33342, DMEM, FBS, набор для определения АФК (Beyotime), реагенты ГЭ, Pp IX (Aladdin) и прочие реактивы аналитического чистоты. Клетки рака молочной железы MCF-7 получены из Янтайского университета, самки голых мышей (14–18 г) — из Beijing Vital River.

Синтез и характеристика HLDM

HLDM синтезировали последовательной ацилацией дитиодипропионовой кислоты с MGK, затем эстерификацией с ламинарином с использованием EDC/DMAP. Продукт подтвердили ¹H-NMR, ИК- и UV-Vis-спектроскопией.

Приготовление Pp IX-загруженных HLDM-мицелл

HLDM и Pp IX совместнo растворили в органическом растворителе, затем диализировали против деионизированной воды (MWCO 2000 Да) при мешании (600 об/мин). Мицеллы собирали при комнатной температуре.

Характеризация

Размер частиц и дзета-потенциал измеряли на анализаторе Beckman Coulter; морфологию изучали ТЭМ (Hitachi H-600). Эффективность инкапсуляции (EE) и загрузка лекарства (DL) рассчитывали по UV-Vis абсорбции при 630 нм.

Клеточная культура и изучение поглощения

Клетки MCF-7 культивировали в DMEM/FBS. Для поглощения инкубировали клетки со свободным Pp IX, LH-мицеллами или HLDM-мицеллами (20 мкг/мл) 1–4 часа. Флуоресценцию наблюдали на инвертированном микроскопе (Nikon Eclipse E400).

Субклеточная локализация

После 4-часовой инкубации клетки фиксировали, контрастировали Hoechst 33342 и образовывали для определения распределения Pp IX.

Определение АФК

Клетки MCF-7 обрабатывали формуляциями (20 мкг/мл) 2 часа, облучали 630 нм 30 мин, затем инкубировали с DCFH-DA (10 мкмоль/л). Флуоресценция (вост. 488 нм, регистр. 525 нм) указывала на генерацию АФК.

Фототоксичность и тест на жизнеспособность

Клетки посеяли в 96-колончатых пластинках, экспонировали различным концентрациям (1–10 мкг/мл) каждой формуляции, облучали (630 нм, 30 мин), инкубировали 24 часа. Добавляли MTT (5 мг/мл), измеряли абсорбцию при 490 нм для расчета жизнеспособности.

Ядерная морфология

После 4-часового лечения клетки фиксировали, окрашивали ядерным красителем и образовывали для оценки конденсации хроматина.

In vivo эффективность и безопасность

Клетки MCF-7 (1,5×10⁶) подкожно вводили голым мышам. Когда опухоли достигли 70–100 мм³, мышей разделили на 5 групп: физраствор, свободный Pp IX (5 мг/кг), HLDM-мицеллы (5 мг/кг экв. Pp IX), свободный Pp IX + свет 630 нм, HLDM-мицеллы + свет 630 нм. Объем опухоли и масса тела отслеживали через день; на 20-й день эвтаназировали для гистологии (ГЭ).

Статистический анализ

Данные представлены как среднее ± SD (n=3). Различия оценивали односторонним ANOVA, значимость *P < 0,05.

Результаты и обсуждение

Характеристика HLDM

¹H-NMR подтвердила успешную конъюгацию MGK, дитиодипропионовой кислоты, гематина и ламинарина с характерными пиками при δ 0,8; 2,8; 6,5 и 3–4 ppm. ИК-спектры показали ожидаемую эфирную карбонильную полосу, UV-Vis — выраженную абсорбцию 580 нм, соответствующую гематину в HLDM.

Свойства мицелл

Динамическое рассеяние света выявило средний диаметр 149,3 ± 35 нм и близкий к нулю дзета-потенциал. ТЭМ подтвердило сферическую морфологию с редкой агрегацией при высоких концентрациях. EE и DL составили 68 % и 12 % соответственно, указывая на эффективную загрузку.

Клеточное поглощение

Флуоресцентная визуализация показала время- и доза-зависимое накопление Pp IX в клетках MCF-7, причем HLDM-мицеллы давали значительно более высокое поглощение, чем свободный Pp IX или LH-мицеллы. Улучшенное поглощение атрибутируется pH/редокс-чувствительному механизму освобождения.

Субклеточное распределение

Колокализация выявила преимущественное цитоплазматическое и митохондриальное накопление Pp IX, доставленного HLDM-мицеллами, согласуясь с известным органелла-таргетингом Pp IX.

Генерация АФК

Флуоресценция DCFH-DA была значительно выше в клетках, обработанных HLDM-мицеллами со светом, по сравнению со свободным Pp IX, подтверждая мощную генерацию АФК только при облучении.

Фототоксичность

Под облучением HLDM-мицеллы достигали >80 % гибели клеток при 5 мкг/мл, тогда как свободный Pp IX требовал >10 мкг/мл для сравнимого эффекта. В темноте все формуляции проявляли минимальную цитотоксичность.

Ядерная морфология

Pp IX-загруженные HLDM-мицеллы индуцировали доза-зависимую конденсацию хроматина и фрагментацию ядер, указывающие на апоптоз.

In vivo эффективность

Только группа HLDM-мицелл + свет 630 нм показала значимое подавление роста опухоли (~70 % к 20-му дню). Свободный Pp IX со светом давал умеренное подавление, в то время как физраствор и не облученные группы продолжали расти. Масса тела оставалась стабильной во всех группах, ГЭ-окраска 드러нила обширный некроз в группе HLDM + свет.

Заключение

Мы спроектировали ламинариновую, двойную pH/редокс-чувствительную мицеллу, эффективно инкапсулирующую Pp IX, повышающую его растворимость и обеспечивающую опухоль-специфическое освобождение. Система доставляет мощную АФК-опосредованную фототоксичность in vitro и выраженную антиопухолевую активность in vivo без системной токсичности. Результаты позиционируют HLDM-мицеллы как перспективную платформу для будущей фотодинамической терапии рака молочной железы и других солидных опухолей.

Доступность данных и материалов

Наборы данных, подтверждающие выводы статьи, включены в статью.

Аббревиатуры

HLDM

Гематин-Ламинарин-Дитиодипропионовая кислота-MGK

LH

Ламинарин-Гематин

Pp IX

Протопорфирин IX

ФДТ

Фотодинамическая терапия

АФК

Активные формы кислорода