Направленные на митохондрии нанолисты TiS₂ доставляют ресвератрол для фототермически активируемой химиотерапии опухолей

Аннотация

Доставка антиопухолевых препаратов в субклеточные органеллы — перспективная стратегия для максимизации терапевтического эффекта и минимизации побочных действий. Создана наноплатформа для доставки препаратов, нацеленная на митохондрии, на основе йодида IR780 (IR780) и нанолистов дисульфида титана (TiS₂). Благодаря большой удельной поверхности нанолистов TiS₂ наноплатформа обеспечивает высокую загрузку антиопухолевого препарата ресвератрола (RV). Полученный нанокомпозит (IR780-TiS₂/RV) использован для эффективной фототермически запускаемой химиотерапии опухолей. IR780-TiS₂/RV демонстрирует удовлетворительную стабильность и биосовместимость; коэффициенты загрузки RV и IR780 составляют ~112% и ~56% соответственно. При облучении ближнего инфракрасного (NIR) диапазона выделяемое тепло запускает высвобождение RV. Благодаря конъюгации с митохондрия-специфичным IR780, нанокомпозит нацеливается и накапливается в митохондриях, высвобождая RV под действием NIR, снижая митохондриальный мембранный потенциал, быстро индуцируя регуляцию ключевых внутренних апоптотических факторов (цитохром c) и инициируя каспазную каскаду, тем самым достигая химиотерапевтического эффекта. IR780-TiS₂/RV показывает высокую противоопухолевую эффективность in vitro и in vivo без заметной тканевой токсичности. Мы считаем, что NIR-запускаемая наноплатформа IR780-TiS₂/RV может быть перспективным химиотерапевтическим агентом в клинической практике.

Введение

Рак остается опасным для жизни заболеванием с высокой смертностью во всем мире. Хирургия, химиотерапия, лучевая и гормональная терапия остаются основными клиническими методами. Химиотерапия широко принята из-за относительно высокой эффективности, но связана с серьезными проблемами: лекарственная резистентность, рецидивы, неспецифичность. Разработка новых химиотерапевтических агентов и стратегий для преодоления этих препятствий срочна. В последние годы популярным подходом стало нагрузка антиопухолевого препарата на функционализированный носитель, обеспечивающий таргетированную доставку и контролируемое высвобождение. Большая удельная поверхность носителя критична для высокой загрузки препарата.

Для улучшения специфичности носители модифицируют мишеневидирующими молекулами, такими как фолиевая кислота и глутатион, адресующие клеточные рецепторы. Поскольку многие химиотерапевтические препараты действуют на конкретные субклеточные органеллы, проектирование органелло-специфических систем доставки может существенно усилить терапевтический эффект и снизить побочные действия. Выбор целевой локализации внутри опухолевых клеток жизненно важен. Митохондрии — не только «энергетический завод» клетки, но и ключевая мишень химиотерапевтических препаратов, запускающих внутренний апоптотический путь. Разработка митохондрия-нацеленной системы доставки антиопухолевых препаратов жизненно важна для более эффективной химиотерапии. Доселе разработаны различные системы доставки: мезопористый силиций, углеродные материалы, белки. Несмотря на их эффективность, новые высокоэффективные системы доставки все еще востребованы.

В этом исследовании построена митохондрия-нацеленная и NIR-запускаемая наноплатформа на основе двумерных нанолистов TiS₂ для контролируемой и таргетированной химиотерапии опухолей. TiS₂ — представитель дихалькогенидов переходных металлов с большой удельной поверхностью. После эксфолиации ультразвуком с белковым ассистированием поверхность нанолистов TiS₂ модифицируется другими функциональными молекулами через ковалентные или нековалентные взаимодействия. Выбрана опухолевых митохондрий-специфичная молекула IR780 (IR-780 йодид) для модификации нанолистов TiS₂. IR780 наделяет нанолисты митохондрия-нацеливающей способностью через активный транспорт, медиатируемый органически-анион-транспортирующими полипептидами, и липофильную катионную природу. Известно, что IR780 как липофильный катион сильнее накапливается в митохондриях опухолевых клеток из-за более высокого митохондриального мембранного потенциала по сравнению с нормальными клетками. Кроме того, IR780 — NIR-чувствительный фототермический агент. Полученная наноплатформа IR780-TiS₂ подтверждена биосовместимой и эффективно загружает антиопухолевый препарат ресвератрол (RV) (IR780-TiS₂/RV). Наноплатформа обладает митохондрия-нацеливанием и фототермическим эффектом. NIR применялся как внешний стимул для запуска локального высвобождения препарата при облучении. In vitro и in vivo эксперименты показали высокую эффективность химиотерапии IR780-TiS₂/RV. Механистическое исследование выявило, что гибель клеток индуцированная IR780-TiS₂/RV происходит через митохондрия-медиатированный внутренний апоптотический путь. Эта митохондрия-нацеленная система доставки препаратов (схема 1) может стать потенциальным химиотерапевтическим агентом в будущей клинической практике.

Материалы и методы

Материалы

IR-780 йодид (IR780), порошок TiS₂, флуоресцеин изотиоцианат (FITC) — Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Бovine serum albumin (BSA ≥98,0%) — BioSharp Co., Ltd. (Корея). Набор CCK-8 — Dojin Chemical Laboratory (Кумамото, Япония). Реактивы для клеточной культуры: DMEM, fetal bovine serum (FBS) — Gibco (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Химикаты — Sigma-Aldrich (Шанхай, Китай).

Синтез IR780-TiS₂/RV

Первый шаг: получение водорастворимых нанолистов TiS₂ по опубликованному методу. 5 мг объемного TiS₂ смешали с 5 мл воды, перемешивали 20 мин. Суспензию добавили к 5 мг BSA и обрабатывали ледяным ультразвуком (500 Вт, 20 кГц, наконечник Sonics VCX130) 6 ч. Затем центрифугировали 12 000 об/мин 10 мин, получая нанолисты TiS₂ в supernatанте.

Второй шаг: конъюгация TiS₂ нанолистов с IR780. Триэтиламин (TEA) использовали как связывающий кислоту агент. 5 мг IR780 растворили в 2 мл DMSO, перемешивали при 60 °C 8 ч с добавлением TEA. Суспензию диализировали в дистиллированной воде 2 дня, затем центрифугировали 9000 об/мин 8 мин для удаления агрегатов. Супернатант собран — IR780-TiS₂.

Третий шаг: загрузка RV на IR780-TiS₂. IR780-TiS₂ (1 мг/мл) смешали с RV (2 мг/мл в DMSO), слегка перемешивалиovernight при комнатной температуре. Затем DMSO и свободный RV удаляли диализом в дистиллированной воде overnight, получая IR780-TiS₂/RV. Коэффициент загрузки RV определяли УФ-Виз спектрофотометром (UV-2550, Shimadzu) по формуле: RV loading ratio (%) = (A_a - A_b)/A_c × 100%, где A_a — начальная масса RV, A_b — несвязанный RV, A_c — масса IR780-TiS₂.

Химическая структура анализировали ФТИР (Bruker TENSOR 27). Удельная площадь поверхности — BET (Quantachrome ChemBET-3000) по адсорбции N₂.

Клеточная линия и культура

Клетки мышиного колоректального рака CT26 из Клеточного банка Китайской академии наук (Шанхай). Культивировали в полном DMEM (10% FBS + 90% DMEM) в увлажненном инкубаторе с 5% CO₂ при 37 °C.

In vitro локализация IR780-TiS₂/RV

FITC использовали для маркировки IR780-TiS₂/RV или TiS₂/RV. FITC (2,0 мг/мл в этаноле) смешивали с водным раствором нанокомпозитов (1,0 мг/мл) 4 ч в темноте при комнатной температуре. После диализа overnight получали FITC-маркированные нанокомпозиты. Для подтверждения митохондриальной колокализации клетки инкубировали с FITC-маркированными нанокомпозитами 5 ч, окрасили MitoTracker Red FM (100 нМ) 30 мин при 37 °C, промыли ПБС 3 раза, наблюдали на CLSM (Olympus IX81-FV1000). Анализ интенсивности флуоресценции — ImageJ.

In vitro NIR-запускаемая химиотерапия и изучение апоптоза

4×10³ клеток/колодку CT26 в 96-колодчатых пластинках инкубировали со свободным RV, IR780-TiS₂, IR780-TiS₂/RV, TiS₂/RV с разными концентрациями RV 5 ч, затем облучали NIR (808 нм, 0,3 Вт/см²) 3 мин или нет. После 24-ч инкубации жизнеспособность анализировали CCK-8. Клетки окрашивали رودамином 123 и анализировали FCM (Beckman Coulter FC 500 MCL). Апоптоз детектировали FCM с набором Annexin V-FITC/PI (Bender MedSystems).

Вестерн-блот

CT26 клетки обрабатывали PBS (контроль), RV, TiS₂/RV, IR780-TiS₂/RV, IR780-TiS₂/RV + NIR (эквивалент RV 30 мкг/мл, IR780 0,5 мкг/мл) 5 ч, затем 24 ч. Лизировали клетки с протеазными ингибиторами и Triton X-100. Электрофорез в СДС-ПААГ, перенос на PVDF, блокировка 5% обезжиренным молоком. Первичные антитела: цитохром c (1/1000, Boster), кливованная каспаза-3 (1/1000, CST), кливованная каспаза-9 (1/1000, CST), актин (1/1000, Mouse, Boster) — инкубация 4 °C 12 ч. Вторичные антитела, детекция ECL.

Животная модель

Субкутанная модель опухоли CT26: 1×10⁷ клеток (100 мкл PBS) в спину бальб/с нюд мышей. Объем опухоли = длина × ширина²/2. Процедуры соответствовали NIH Guidelines и одобрены Этического комитетом Цзымаданьская центральная больница (Хэнань, Китай).

In vivo биодистрибуция

Биодистрибуция IR780-TiS₂/RV у нюд мышей с опухолями определяли через 24 ч после в/в инъекции (150 мкл, 6 мг/кг). Органы (сердце, печень, селезенка, легкие, почки, опухоль) взвешивали, минерализировали в царской воде. Содержание Ti квантифицировали ICP-OES.

In vivo NIR-запускаемая химиотерапия

Мыши с опухолями случайно разделили на 6 групп (n=6): физраствор, физраствор+NIR, RV, IR780-TiS₂/RV, TiS₂/RV+NIR, IR780-TiS₂/RV+NIR (эквивалент RV 1 мг/кг, IR780 0,5 мг/кг). NIR: 808 нм, 0,3 Вт/см², 3 мин. В течение 30 дней лечения записывали объем опухоли и вес мышей каждые 3 дня. После лечения органы (сердце, печень, селезенка, легкие, почки) фиксировали и окрашивали ГЭ.

Статистический анализ

Результаты представлены как среднее ± стандартное отклонение. t-критерий Стьюдента для сравнения двух групп. P<0,05 — значимо, P<0,01 — очень значимо.

Результаты и обсуждение

Подготовка и характеристика IR780-TiS₂/RV

Для получения IR780-TiS₂/RV сначала приготовили биосовместимые нанолисты TiS₂ методом эксфолиации с BSA и ультразвуком. Затем синтезировали IR780-TiS₂ реакцией замещения атома хлора в IR780 на аминогруппы BSA, адсорбированные на нанолистах TiS₂, с использованием TEA. Наконец, IR780-TiS₂ загрузили RV физическим адсорбцие. Схема 1 показывает схематично. Доп. файл 1: рис. S1 — TEM белково-эксфолированных TiS₂ нанолистов. XRD (доп. файл 1: рис. S2) подтверждает хорошую кристалличность. После функционализации IR780-TiS₂/RV имеет хлопевидную морфологию с решетчатым интервалом 0,25 нм (TEM, рис. 1a,b), средний диаметр ~123,6 нм, дзета-потенциал -37,2 мВ (Nanosizer, рис. 1c,d). После 2-недельного хранения в воде, FBS, физрастворе гидродинамический размер оставался постоянным ~123 нм (рис. 1e), указывая на стабильность, вероятно, из-за адгезии BSA на поверхности TiS₂. Спектры поглощения (рис. 1f) показывают пики свободного IR780 и RV, подтверждая успешную конъюгацию. Коэффициент загрузки RV ~112% (W/W), достигнутый нековалентными взаимодействиями (π-π стакинг, гидрофобные). BET: удельная площадь объемного TiS₂ 15,2 м²/г, нанолистов TiS₂ — 122,1 м²/г. Эксфолированные нанолисты обеспечивают большую активную площадь для загрузки. Высокая загрузка также обусловлена адгезией BSA на IR780-TiS₂. ФТИР (доп. файл 1: рис. S6) показывает характеристические пики TiS₂ во всех спектрах, а в IR780-TiS₂/RV появляются три новых пика (~3191, ~1510, 1230 см⁻¹), подтверждающие наличие RV и IR780.

После 3-мин NIR облучения (808 нм, 0,3 Вт/см²) температура раствора IR780-TiS₂/RV повышалась пропорционально концентрации (0, 5, 10 мкг/мл), 10 мкг/мл дало 47,6 °C (рис. 2a). IR780-TiS₂/RV сохранял фототермический эффект после 5 циклов NIR, тогда как свободный IR780 показывал снижение (рис. 2b), указывая на высокую фотostaбильность нанокомпозита.

Коэффициент высвобождения RV измеряли при разных pH и NIR (рис. 2c,d). Через 24 ч при pH 7,4 высвобождение 8,56%, при pH 6,5 — 16,2% (слабое кислотное условие усиливает высвобождение). При pH 6,5 + 3 мин NIR — 44,8%. Это демонстрирует, что NIR является контролируемым внешним стимулом для запуска высвобождения RV. Эффект обусловлен теплом от IR780-TiS₂ под NIR, ослабляющим нековалентные взаимодействия RV с поверхностью. В кислой среде H⁺ меняет заряд поверхности TiS₂, изменяя гидрофильно-гидрофобный баланс.

In vitro локализация IR780-TiS₂/RV

Для изучения клеточного захвата и внутриклеточного распределения нанокомпозиты маркировали FITC, визуализировали CLSM. После 5-ч инкубации TiS₂/RV и IR780-TiS₂/RV показали похожую флуоресцентность в цитоплазме (рис. 3a,b), указывая на эндоцитоз. Однако IR780-TiS₂/RV демонстрировал большую интенсивность желто-зеленой флуоресценции при наложении FITC и MitoTracker (рис. 3a,c), подтверждая эффективное митохондриальное нацеливание. TEM также показал нанокомпозит внутри митохондрий (рис. 3d). Митохондриальное таргетирование медиаруется активным транспортом через органически-анион-транспортирующие полипептиды и липофильной катионной природой, вызывая высокую аккумуляцию в митохондриях опухолевых клеток.

In vitro NIR-запускаемая химиотерапия

Сначала оценили фототермический эффект in vitro. После 5-ч инкубации IR780-TiS₂/RV повышал температуру на ~17 °C, TiS₂/RV — на ~10 °C (рис. 4a). Эффект обусловлен IR780 и TiS₂. IR780-TiS₂ не показывал выраженной цитотоксичности до 300 мкг/мл (рис. 4b). Свободный RV с или без NIR имел похожий концентрационно-зависимый эффект (рис. 4c). При той же концентрации RV лучший цитотоксический эффект давал RV, загруженный в IR780-TiS₂ с NIR, по сравнению со свободным RV, IR780-TiS₂ и RV в TiS₂ (рис. 4d). Интересно, не загруженный IR780-TiS₂ не проявлял антиопухолевого эффекта под NIR, что указывает на то, что тепло используется преимущественно для запуска высвобождения препарата. Таким образом, IR780-TiS₂/RV высвобождает RV в митохондриях под NIR, резко повышая локальную концентрацию RV и достигая большего противоопухолевого эффекта.

Механизм гибели клеток

Для раскрытия механизма NIR-запускаемой химиотерапии IR780-TiS₂/RV анализировали тип гибели клеток, митохондриальный мембранный потенциал (Ψm) и экспрессию апоптотических белков. FCM с Annexin V-FITC/PI (рис. 5a) показал: при одной концентрации RV свободный RV, TiS₂/RV, IR780-TiS₂/RV, IR780-TiS₂/RV+NIR все индуцировали апоптоз, преимущественно за счет RV. IR780-TiS₂/RV+NIR дал наивысший уровень апоптоза 90,8%. Снижение Ψm — ключевое событие внутреннего апоптотического пути. IR780-TiS₂/RV+NIR снизило Ψm на ~85%, значительно больше, чем другие обработки (рис. 5b). Вестерн-блот (рис. 5c): клетки, обработанные IR780-TiS₂/RV+NIR, показали больше цитозольного цитохрома c, чем при RV, IR780-TiS₂/RV или IR780-TiS₂/RV. Транслокация цитохрома c инициирует каспазную каскаду. Экспрессия кливованной каспазы-9 и каспазы-3 значительно повышалась при IR780-TiS₂/RV+NIR. Данные подтверждают апоптоз через митохондриальный (внутренний) путь.

In vivo NIR-запускаемая химиотерапия

Для оценки in vivo эффективности мышей с опухолями CT26 лечили: физраствор, физраствор+NIR, RV, IR780-TiS₂/RV, TiS₂/RV+NIR, IR780-TiS₂/RV+NIR. Объем опухоли в группе IR780-TiS₂/RV+NIR значимо уменьшился, опухоль почти исчезла через 30 дней, в остальных группах объем рос (рис. 6a). Вес мышей не различался между группами (рис. 6b). ГЭ-окраска органов не выявила заметной тканевой токсичности (рис. 6c). Результаты демонстрируют выдающуюся NIR-запускаемую противоопухолевую эффективность IR780-TiS₂/RV и низкую системную токсичность. Биодистрибуция (доп. файл 1: рис. S4): нанокомпозит в основном накапливался в печени, возможно, метаболизируясь ею.

Заключение

Разработана митохондрия-нацеленная RV-загруженная наноплатформа на основе нанолистов TiS₂ для NIR-запускаемого высвобождения препарата и усиленной химиотерапии опухолей. IR780-TiS₂/RV с хлопевидной морфологией показал хорошую стабильность и биосовместимость. Благодаря митохондрия-нацеливающей способности IR780, нанокомпозит селективно накапливается в митохондриях опухолевых клеток и высвобождает RV под действием NIR. Высвобожденный RV снижает митохондриальный мембранный потенциал, вызывает высвобождение цитохрома c и запускает каспазную каскаду, продвигая апоптоз через митохондриальный сигнальный путь. In vitro и in vivo результаты подтверждают эффективную NIR-запускаемую химиотерапию без значительной тканевой токсичности. IR780-TiS₂/RV может быть перспективным химиотерапевтическим агентом в клинической практике.

Доступность данных и материалов

Выводы рукописи основаны на данных, полностью представленных в статье.

Сокращения

IR780:

IR-780 йодид

BET:

Brunauer-Emmett-Teller

BSA:

Бovine serum albumin (сывороточный альбумин грызуна)

CCK-8:

Cell Counting Kit-8

CLSM:

Confocal laser scanning microscopy (конфокальная лазерная сканирующая микроскопия)

cyto c:

Cytochrome c (цитохром c)

DMEM:

Dulbecco's modified Eagle's medium

DMSO:

Dimethylsulfoxide (диметилсульфоксид)

FBS:

Fetal bovine serum (фетальный бычий сывороточный альбумин)

FCM:

Flow cytometry (потоковая цитометрия)

FITC:

Fluorescein isothiocyanate (флуоресцеин изотиоцианат)

FTIR:

Fourier Transform Infrared Spectroscopy (Фурье-преобразование ИК-спектроскопия)

NIR:

Near-infrared (ближний инфракрасный)

PBS:

Phosphate-buffered saline (фосфатно-буферный раствор)

RV:

Resveratrol (ресвератрол)

TEA:

Triethylamine (триэтиламин)

TiS₂:

Titanium disulfide (дисульфид титана)