Теранозические агенты на основе магнетитовых нанокластеров для T2-взвешенной МРТ и pH-чувствительной доставки доксорубицина

Аннотация

Многофункциональные наноструктуры, объединяющие противоопухолевые препараты с неорганическими нанокристаллами, становятся мощными платформами для диагностики и терапии опухолей. В этом исследовании мы изготовили магнетитовые (Fe₃O₄) нанокластеры (NC) комбинацией обратной микроэмульсии и послойного (LBL) наслаивания. Fe₃O₄ NC сначала собирали из оксидных наночастиц Fe₃O₄, облеченных олеиновой кислотой. Последовательная адсорбция поли(аллиламина гидрохлорида) (PAH), поли(натрий 4-стиролсульфоната) (PSS) и гидрохлорида доксорубицина (DOX) дала гибридные наноструктуры Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX. Эти носители демонстрируют pH-зависимый выпуск DOX, усиленную цитотоксичность по отношению к клеткам рака легких A549 и превосходный T2-контраст МРТ (r₂ = 651 мМ⁻¹ с⁻¹). Флуоресцентная эмиссия DOX (λэкс = 490 нм) облегчает клеточную визуализацию. Наша работа устанавливает надежную Fe₃O₄-базированную теранозическую платформу, интегрирующую МРТ, флуоресцентную визуализацию и контролируемую доставку лекарств.

Введение

Недавние достижения в многофункциональных системах доставки лекарств позволили одновременную визуализацию и терапию, особенно через стимуло-реактивные дизайны, использующие признаки микросреды опухоли, такие как кислотность (pH ≈ 6.5–6.8). Магнетитовые наночастицы (Fe₃O₄) особенно привлекательны для биомедицинских приложений благодаря сверхпарамагнетизму, биосовместимости и низкой цитотоксичности. Однако одиночные Fe₃O₄ наночастицы часто страдают от низкой магнитной отзывчивости и ограниченной загрузки лекарства. Сборка Fe₃O₄ наночастиц в нанокластеры (NC) усиливает коллективные магнитные эффекты, повышая T2 релаксивитет и позволяя более высокую загрузку лекарства в комбинации с полиэлектролитными мультислоями. Несмотря на эти преимущества, мало работ сообщало о Fe₃O₄ NC, функционализированных PAH/PSS для pH-инициируемого выпуска лекарства.

Здесь мы сообщаем о масштабируемом маршруте изготовления гибридных наноструктур Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX, комбинирующем самосборку микроэмульсии и электростатическую LBL адсорбцию. Полученные носители доставляют DOX с контролем, pH-зависимым выпуском, демонстрируют сильный T2 МРТ контраст и эффективно убивают клетки A549 in vitro.

Материалы и методы

Материалы

FeCl₃·6H₂O (99.99%), FeCl₂·4H₂O (99.99%), олеиновая кислота (OA, 90%), 1-октадецен (ODE, 90%), натрий олеат (NaOA), этанол, гексан, циклоhexан, изопропанол, натрий додектилбензолсульфонат (SDBS), фторид аммония (NH₄F), NaOH, DMSO и аммиак приобретены у Alfa Aesar и Sinopharm. PAH (Мв 15 кДа), PSS (Мв 70 кДа) и гидрохлорид доксорубицина (DOX, >98%) из Sigma-Aldrich и Shanghai Sangon Biotech. Среда RPMI 1640 и фетальная говяжья сыворотка (FBS) от Hyclone. Все реактивы использовали без дополнительной очистки.

Подготовка ферринового олеата

FeCl₃·6H₂O (2.59 г), NaOA (14.6 г), этанол (32 мл), H₂O (24 мл) и гексан (56 мл) смешивали в 150- мл колбе и рефлюксировали при 70 °C 4 ч для образования прозрачного раствора ферринового олеата. Масляный слой отделяли, гексан удаляли ротационной эвапорацией при 70 °C, остаток хранили в вакууме.

Синтез Fe₃O₄ наночастиц

Ферриновый олеат (7.2 г), OA (1.28 мл) и ODE (50 мл) нагревали до 300 °C на 40 мин под Ar; затем охлаждали и окисляли на воздухе >12 ч. Нанокристаллы осаждали изопропанолом, дважды вымывали этанол-водой (1:1) и диспергировали в 200 мл циклоhexана.

Подготовка Fe₃O₄ нанокластеров

200 мкл Fe₃O₄ наночастиц в циклоhexане добавляли к 4 мл водного SDBS (14 мг). Ультразвуковая обработка (5 мин × 4) формировала твердое-в-масле-в-वоде эмульсию. Перемешивание при комнатной температуре 6 ч испаряло циклоhexан, позволяя самосборке в квазисферические NC. Продукт трижды вымывали деионизированной водой.

Подготовка гибридных наноструктур Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX

Fe₃O₄ NC (3 мл) сначала покрывали PAH (10 г/л, 4 мМ NaCl) капальной добавкой и перемешиванием 24 ч; излишки PAH удаляли центрифугированием. PAH-покрытые NC затем покрывали PSS (10 г/л, 4 мМ NaCl) в тех же условиях, с последующей центрифугацией. DOX (5 мг/мл) добавляли (60 мкл) к раствору Fe₃O₄ NC/PAH/PSS (3 мл) и перемешивали 24 ч в темноте. Финальные гибридные наноструктуры Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX изолировали центрифугированием.

МРТ замеры

Гибридные наноструктуры диспергировали в 1.2 мл агарозы (1% масс.) при Fe концентрациях 0–0.065 мМ. Визуализация на 11.7 Т Bruker micro-МРТ (TR = 300 мс, TE = 4.5 мс, матрица 128×128, срез 1.2 мм, ПОВ 2.0×2.0 см, 2 усреднения).

Клеточный захват и МР визуализация

Клетки A549 инкубировали с гибридными наноструктурами (Fe = 0–13.5 мкМ) 2 ч, промывали и визуализировали T2-взвешенной МРТ.

Калибровочная кривая DOX

Флуоресценция DOX (λэкс = 490 нм) измеряли для концентраций 0–0.03 мг/мл. Линейная регрессия дала Y = 447.44 + 69,745 X (R² = 0.9992).

Загрузка и выпуск DOX

Эффективность загрузки рассчитывали из разницы между начальной массой DOX (W₀) и массой в supernatанте (Wₛ) после центрифугирования. Кумулятивный выпуск мониторили в ФСБ (pH 5.0 или 7.4) при 37 °C в диализационном мешочке, отбирая 100 мкл каждые 1–3 ч.

In vitro цитотоксичность

Клетки A549 посевали в 96-колодчатых пластинках (8×10³ клеток/колодка) и обрабатывали свободным DOX, Fe₃O₄ NC/PAH/PSS или Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX (0.1–2.0 мкМ эквивалентов DOX). Через 24 ч добавляли МТТ (5 мг/мл), инкубировали 4 ч, измеряли абсорбцию при 490 нм.

Характеризация

TEM (200 кВ) оценивала морфологию; DLS — гидродинамический размер и дзета-потенциал; UV-vis спектроскопия — загрузку DOX; флуоресцентная спектроскопия — выпуск DOX; ICP-AES — содержание Fe.

Результаты и обсуждение

Морфология и размер наноструктур

TEM показал, что Fe₃O₄ NC — квазисферические агрегаты (~57 нм по DLS), образованные самосборкой 15-нм первичных Fe₃O₄ наночастиц. Послойное наложение (PAH, PSS, DOX) подтверждалось сдвигами дзета-потенциала: −19.7 мВ (NC), +32 мВ (NC/PAH), −34 мВ (NC/PAH/PSS), +1.9 мВ (NC/PAH/PSS/DOX). Финальные гибридные наноструктуры показывали монодисперсный размер ~84 нм (DLS).

Усиленный T2 МРТ контраст

Поперечная релаксивитет (r₂) составил 651.38 мМ⁻¹с⁻¹, превосходя многие коммерческие агенты. Линейная зависимость 1/T₂ от Fe концентрации подтвердила эффективный T2 контраст.

Загрузка DOX и pH-реактивный выпуск

UV-vis и флуоресцентные спектры подтвердили адсорбцию DOX. Эффективность загрузки достигла 24.4%. В ФСБ (pH 7.4) за 30 ч выходило только ~20 масс.% DOX, тогда как при pH 5.0 ~80 масс.% выходило за 15 ч, демонстрируя сильную pH-чувствительность, обусловленную протонированием DOX и ослаблением электростатической связи.

Клеточный захват и цитотоксичность

Конфокальная микроскопия показала время-зависимую интернализацию DOX-загруженных гибридов, с сильной красной флуоресценцией через 24 ч. МТТ-тесты раскрыли незначительную цитотоксичность Fe₃O₄ NC/PAH/PSS в одиночестве (жизнеспособность >85% при 2 мкМ). Свободный DOX и DOX-загруженные гибриды демонстрировали дозозависимое убийство A549 (IC₅₀ ≈ 1–2 мкМ). Повышенная цитотоксичность гибридов атрибутируется устойчивому, эндосомально pH-инициируемому выпуску DOX.

Клеточная МРТ

Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX гибриды интернализировались в клетки A549 и давали значительное снижение T2 сигнала, подтверждая их полезность как клеточных МРТ контрастных агентов.

Заключение

Мы спроектировали гибридные наноструктуры Fe₃O₄ NC/PAH/PSS/DOX, объединяющие высокий T2 МРТ контраст, pH-инициируемый выпуск DOX и мощную противоопухолевую активность in vitro. Их модульный дизайн позволяет дальнейшую функционализацию (например, таргетирующие лиганды) для in vivo применений, позиционируя их как универсальные теранозические платформы для визуализации и терапии рака.