Модуляция клеточной механики наночастицами: сравнительный анализ эффектов SiO₂ и TiO₂ на клетки Caco-2 и A549

Аннотация

Растущее включение наночастиц (НЧ) в потребительские продукты опережает комплексные оценки безопасности. Исследовано, как физико-химические атрибуты SiO₂ и TiO₂ НЧ влияют на клеточное поглощение, внутриклеточный транспорт и механические возмущения в двух клинически релевантных in vitro моделях — Caco-2 (кишечный эпителий) и A549 (альвеолярный эпителий). Квантифицировали внутренние НЧ через ICP-AES, оценили цитоксичность WST-8 и LDH тестами, измерили окидативный стресс (ROS, SOD, MDA), и оценили ремоделирование актинового цитоскелета конфокальной микроскопией. Атомно-силовая микроскопия (AFM) определила изменения модуля Юнга в ядерном и цитоплазматическом компартментах. TiO₂ НЧ показали более высокое клеточное поглощение, выраженную генерацию ROS и значительную реорганизацию актина, приводящую к повышению жесткости в A549 и снижению жесткости в Caco-2. Эти биомеханические изменения коррелируют с НЧ-индуцированной цитоксичностью и подчеркивают важность включения механических эндпоинтов в нанотоксикологические протоколы.

Введение

Инженерные наночастицы (ENP) повсеместны в фармацевтике, косметике, пищевых добавках и промышленных формулировках, вызывая опасения по поводу путей воздействия на человека и окружающую среду (поглащение, вдыхание, дермальное). Токсичность ENP сильно модулируется их размером, формой, поверхностной химией и кристаллическим состоянием, однако стандартизированные методы оценки ограничены, что приводит к противоречивой литературе. Металл-оксидные НЧ, особенно аморфный SiO₂ и кристаллический TiO₂, широко используются благодаря оптической и химической стабильности, но данные указывают на их способность нарушать клеточные функции: выброс цитокинов, целостность кишечных микроворсинок, продукцию ROS, ингибирование АТФ синтезы, генотоxicичность. Однако их влияние на клеточную механику — ключевой детерминант миграции, дифференцировки и тканевой гомеостаза — получило ограниченное внимание. Это исследование заполняет пробел, систематически оценивая биомеханические эффекты 20-нм SiO₂ и TiO₂ НЧ на клетках Caco-2 и A549.

Методы

Синтез SiO₂ и TiO₂ наночастиц

SiO₂ НЧ получили W/O микроэмульсией из TEOS, Triton X-100, циклоhexане, NH₄OH, давая сферические частицы 20±2 нм. TiO₂ НЧ синтезировали модифицированным сол-гель методом из TTIP в кислых условиях, отжигом при 430 °C для получения смешанной анастаз-рутил фазы со средним диаметром 25±5 нм. Оба типа НЧ характеризовали TEM, DLS, ζ-потенциал, XRD для подтверждения морфологии, гидродинамического размера, заряда и кристаллической структуры (рис. 1).

Клеточная культура и экспозиция

Клетки Caco-2 и A549 культивировали в DMEM с 10–20% FBS, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина. Для изучения поглощения клетки экспонировали 15 или 45 мкг/мл НЧ на 48–96 ч. После экспозиции клетки промывали, трипсинизировали, считали и лизировали в HCl/HNO₃ для ICP-AES анализа Si и Ti содержания.

Цитоксичность, целостность мембраны и окидативный стресс

Жизнеспособность оценивали WST-8 тестом; LDH высвобождение — повреждение мембраны. ROS измеряли флуоресценцией DCF-DA, антиоксидантный ответ — через активность SOD и уровень MDA (перекисное окисление липидов). Все тесты в трипликатах с контролями.

Актиновый цитоскелет и морфометрия

Клетки фиксировали, пермеабилизировали, окрашивали Фаллоидином-ATTO 488 и DAPI. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM) фиксировала кортикальное распределение актина. ImageJ квантифицировал интегральную плотность и когерентность (плагин OrientationJ) для оценки количества и выравнивания актина. Вычисляли ядерно-цитоплазматические (N/C) площадьные соотношения для обнаружения морфологических изменений.

Атомно-силовая микроскопия

AFM в режиме force-volume измерял модуль Юнга в ядерных и цитоплазматических областях клеток, обработанных 45 мкг/мл НЧ 72 ч. Силы-дистанционные кривые аппроксимировали модифицированной моделью Снеддона для извлечения упругих модулей (E). Данные 20 клеток на условие анализировали статистически.

Статистический анализ

Результаты как mean ± SD. t-тест Стьюдента сравнивал обработанные vs контроль, значимость p<0,05 (*), p<0,01 (**), p<0,005 (***).

Результаты

Характеризация наночастиц

TEM подтверждает монодисперсные сферические SiO₂ НЧ (~20 нм) и TiO₂ НЧ (~25 нм) со смешанной анастаз-рутил фазой (рис. 1). DLS показывает гидродинамические диаметры 21±7 нм (SiO₂) и 27±12 нм (TiO₂) в воде; в DMEM с 20% FBS после 96 ч размеры растут до 29±9 нм и 41±14 нм соответственно, указывая на формирование белкового короны. ζ-потенциалы −45±3 мВ (SiO₂) и −50±3 мВ (TiO₂) в воде, становятся более отрицательными в культурной среде.

Поглощение НЧ

ICP-AES выявил дозозависимое и временнозависимое внутреннее поглощение. TiO₂ НЧ накапливались активнее: в Caco-2 8,2±0,4 мкг на 3,6×10⁵ клеток через 72 ч и 9,7±0,03 мкг через 96 ч. В A549 — 5±0,6 мкг (72 ч) и 7,1±0,1 мкг (96 ч). SiO₂ НЧ показывали более низкое накопление, особенно в A549 (2,6±0,05 мкг при 72 ч). В целом, TiO₂ НЧ демонстрируют более высокое клеточное поглощение в обеих линейках.

Жизнеспособность, повреждение мембраны и ROS

WST-8 показал умеренное снижение жизнеспособности в обеих линейках при 45 мкг/мл. Жизнеспособность Caco-2 упала ~40% после 72 ч и ~50% после 96 ч TiO₂ экспозиции; A549 — ~30% снижение только после 96 ч. LDH высвобождение повторяло тренды, пик ~160% контроля после 96 ч в Caco-2. ROS генерация росла дозозависимо, TiO₂ НЧ индуцировали до 165% DCF-DA флуоресценции в Caco-2 (рис. 4).

Антиоксидантный ответ и перекисное окисление липидов

Активность SOD падала дозо- и временнозависимо. В Caco-2 SOD снизился с 4,1±0,2 ЕД/мл (контроль) до 1,0±0,3 ЕД/мл после 96 ч 45 мкг/мл TiO₂. SiO₂ экспозиция снизила SOD до 1,4±0,1 ЕД/мл. MDA уровень соответствующе рос в обеих линейках, указывая на усиленное перекисное окисление липидов.

Ремоделирование актинового цитоскелета

Конфокальное изображение выявило нарушение плотных контактов и удлиненную морфологию в Caco-2, и уменьшение клеточно-клеточных контактов в A549 при обработке НЧ. Количественный анализ не показал значимых изменений интегральной плотности (количества актина), но выраженное снижение когерентности: Caco-2 когерентность упала с 0,26±0,03 (контроль) до 0,09±0,02 (TiO₂). A549 когерентность снизилась с 0,40±0,03 до 0,16±0,04. N/C соотношения увеличились в Caco-2 (0,40→0,62) и уменьшились в A549 (0,55→0,23), отражая дивергентные морфологические ответы.

Механические свойства (модуль Юнга)

AFM измерения указали на противоположные изменения жесткости. В Caco-2 модуль Юнга снизился с 105±25 кПа (ядро) до 27±4 кПа после TiO₂ экспозиции; цитоплазматический модуль с 47±21 кПа до 18±4 кПа. Напротив, A549 жесткость резко возросла: ядерный модуль с 129±24 кПа до 372±60 кПа, цитоплазматический с 147±26 кПа до 549±40 кПа при TiO₂ обработке.

Обсуждение

Результаты демонстрируют, что TiO₂ НЧ, благодаря кристаллической структуре и поверхностной реактивности, провоцируют более сильные клеточные ответы, чем аморфные SiO₂ НЧ. Повышенное поглощение, ROS генерация и реорганизация актина коррелируют с значительными изменениями клеточной эластичности — размягчением Caco-2 и обкачиванием A549 — предполагая различные механизмы в эпителиальном и альвеолярном контекстах. Такие биомеханические изменения могут влиять на миграцию клеток, барьерную функцию и потенциально прогрессию опухолей. Интеграция механических эндпоинтов с конвенциональными тестами цитоксичности предлагает более комплексную нанотоксикологическую оценку.

Заключение

SiO₂ НЧ демонстрируют более низкую цитоксичность по сравнению с TiO₂ НЧ. TiO₂ экспозиция индуцирует ремоделирование актина, изменение N/C соотношений и дивергентные механические ответы: повышение жесткости в A549 и снижение в Caco-2. Эти биомеханические возмущения подчеркивают важность оценки динамики цитоскелета и клеточной механики в нанотоксикологических исследованиях для прогнозирования потенциальных патологических исходов.

Аббревиатуры

A549

Человечные аденокарциномные альвеолярные базальные эпителиальные клетки

AFM

Атомно-силовая микроскопия

ATP

Аденозинтрифосфат

Caco-2

Человечный эпителиальный колоректальный аденокарцинома

CLSM

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

DAPI

4′,6′-Диамидино-2-фенилиндол

DCF-DA

2′,7′-Дихloroфлуоресцеин диацетат

DLS

Динамическое рассеяние света

DMEM

Среда Дюльбекко модифицированная Eagle

ENPs

Инженерные наночастицы

FBS

Фетальная телячья сыворотка

HCl/HNO₃

Соляная/азотная кислота

ICP-AES

Индуктивно связанная плазма атомная эмиссионная спектроскопия

LDH

Лактат дегидрогеназа

MDA

Мальондиальдегид

NH₄OH

Гидроксид аммония

NPs

Наночастицы

PBS

Фосфатно-буферизованный раствор

ROIs

Области интереса

ROS

Реактивные формы кислорода

SiO₂ NPs

Наночастицы диоксида кремния

SOD

Супероксид дисмутаза

TBA

Тиобарбитуровая кислота

TEM

Проницающая электронная микроскопия

TEOS

Тетраэтил ортосиликат

TiO₂ NPs

Наночастицы диоксида титана

TTIP

Титан (IV) изопропоксид

XRD

Рентгеновская дифракция