Наночастицы Au @ Ag Core @ Shell, синтезированные с Rumex hymenosepalus в качестве противомикробного агента

Введение

За последние 25 лет было изучено несколько химических методов синтеза наноматериалов; однако в большинстве этих методов используются вещества, вредные для окружающей среды, и используются высокие температуры или дорогостоящее оборудование. В данной работе был проведен синтез наноструктур золото-серебро методом зеленого синтеза. Этот метод минимизирует загрязнение с самого начала. Использование «чистых» процессов, избегание большей части отходов и использование опасных загрязнителей при разработке «чистых» наноматериалов, которые не представляют угрозы для здоровья или окружающей среды.

Зеленый синтез металлических наночастиц направлен на положительное влияние взаимодействия с биологическими системами, что означает, что наночастицы и их самофункционализация с молекулами полифенолов порождают биологические взаимодействия, совместимые с такими системами, как клетки и макромолекулы. Как правило, эти биологические взаимодействия используются в качестве наномедицины для лечения таких заболеваний, как рак, диабет и нейродегенеративные заболевания. Синтез серебра (оболочки) и AuNps как системы ядро-оболочка имеет такие приложения, как оптические диагностические сенсоры, молекулярные сенсоры [1, 2], фототермические терапии, противомикробные препараты и улучшает каталитический процесс [3,4,5,6] по сравнению с с монометаллическими НЧ.

В частности, для биметаллического синтеза используются последовательные или одновременные методы в разных реакторах, химические и физические методы [7]:пиролиз ультразвуковым распылением [8], сонохимический метод [5], микрожидкостный чип [9], последовательное наножидкостное нанопреципитация [ 10, 11] микроэмульсии [12], липосомы [13], восстановители химического или зеленого химического типа.

Сухие материалы используются в синтезе наночастиц в виде оксидов металлов [14], углеродных нанотрубок [15, 16], других применений печатных мягких электронных устройств [17]. Влажные наночастицы, используемые в биологических системах [18,19,20], носители лекарств [21, 22], противомикробные [23, 24], сенсорные приложения [25] и вычислительные нанотехнологии - это современная классификация [26], используемая для определения использования.

Хатами и др. Рассмотрели зеленый синтез с использованием растений типа ядро ​​@ оболочка наночастиц, в частности, были использованы Antigonon leptopus , Диопирос каки , Azadirachta indica , Potamogeton pectinatus , Anacadium oceidentale для синтеза наночастиц Au @ Ag размером от 5 до 500 нм (а), были протестированы для различных применений (неантибактериальных), и Asparagus racemosus Экстракт корня был использован для синтеза наночастиц сплава Au – Ag, обнаружив МПК 480 мкг / мл при тестировании на Escherichia coli , Bacillus subtilis , Klebsiella pneumonia , синегнойная палочка и золотистый стафилококк [27]. НЧ Au @ Ag, полученные химическим синтезом, находят применение в качестве антибактериальных средств, и сообщается, что МПК составляет около 2,5 мкг / мл для содержания серебра (оболочка) [28], Lu et. al. сообщили о химическом синтезе Au / AgNPs @ Van были получены с использованием NaBH ₄ кроме того, ванкомицин и МИК составляли 60 нмоль / мл для биметаллических наночастиц, испытанных на грамположительных и отрицательных бактериях [29].

Антибактериальные свойства биметаллических наноматериалов [30,31,32,33,34] улучшаются в зависимости от концентрации Ag. Напротив, увеличение концентрации Au снижает антибактериальные свойства, но снижает цитотоксический эффект, т.е. биметаллический материал становится более биосовместимым [35]. Сравнивая влияние монометаллических материалов Au и Ag с биметаллическими материалами [36,37,38,39,40], было продемонстрировано, что между биметаллическими материалами возникает синергетический эффект [41], вызывающий бифункциональные эффекты [28, 42].

Функционализация наноматериалов представляет особый интерес, поскольку химическая среда [43,44,45] (pH, присутствие серы, биосовместимых молекул и т. Д.), Окружающая систему, будет иметь влияние на взаимодействие с клетками или микроорганизмами; поэтому упор на создание биоматериалов с использованием зеленой химии [46,47,48,49,50,51,52,53,54,55].

Химический состав биметаллических частиц [56,57,58] будет определяющим фактором их оптических свойств [41, 59] из-за синергетического эффекта монометаллических наноструктур [60].

В этой работе наночастицы золота и серебра были синтезированы с использованием в качестве восстановителя агента Rumex hymenosepalus . экстракт, который представляет собой растение, которое содержит молекулы стильбенов и катехинов, которые действуют как мощные антиоксиданты при восстановлении ионов металлов. Наночастицы золота были использованы в качестве ядер для получения биметаллических наночастиц типа ядро ​​@ оболочка Au @ Ag методом последовательного синтеза. Для определения характеристик наноматериалов используются методы HAADF-STEM, TEM с EDS y HRTEM.

С различными типами синтезированных наночастиц было проведено сравнительное исследование динамики роста бактерий E. coli и С. золотистый и дрожжи Candida albicans.

Экспериментальный раздел

Материалы

Корни Rumex hymenosepalus были приобретены в торговом заведении местности. Оба предшественника HAuCl ₄ и AgNO ₃ для синтеза наночастиц были приобретены у Sigma-Aldrich с чистотой 99%. Бульон для инфузии сердца мозга (BHI) и бульон с картофельной декстрозой (PDB), используемые для анализа на микроорганизмы, были закуплены у Sigma-Aldrich. Этанол (чистота 99%), используемый в процессе очистки наночастиц, был приобретен у Fermont, а в экспериментах использовалась сверхчистая вода (milli-Q).

Экстракт Rumex hymenosepalus

Для приготовления экстракта 150 г корня, нарезанного ломтиками и предварительно обезвоженного, мацерировали в 1000 мл смеси этанол / вода 70/30 об. / Об. Мацерация проводилась при комнатной температуре в стеклянной емкости с герметичной пробкой и защищенной от света. Оптическую плотность полученного раствора контролировали в течение 21 дня до тех пор, пока ее значение не изменилось. На этом процесс мацерации считался завершенным. Полученный экстракт последовательно фильтровали с помощью бумажных фильтров Whatman с размером пор 8 мкм и 2 мкм и, наконец, с помощью фильтра acrodisc с размером пор 0,22 мкм. Этанол удаляли выпариванием на роторном испарителе, и концентрат водного экстракта замораживали при -80 ° C для лиофилизации (Labconco, FreeZone 1L). Полученные порошки до использования хранили в стерильных контейнерах, защищенных от света, при комнатной температуре.

Синтез AuNP

Во-первых, Rumex hymenosepalus водный раствор был приготовлен из лиофилизированного экстракта с концентрацией 10 мг / мл. Позже 16 мл Rumex раствор смешивали с 32 мл сверхчистой воды, продолжая перемешивание со скоростью 1000 об / мин, и медленно добавляли 16 мл HAuCl ₄ (0,01 М). Реакцию проводили в течение часа при лабораторных условиях освещения и при комнатной температуре. Интенсивность поверхностного плазмонного резонанса ( λ _SPR =540 нм) оценивали с помощью УФ-видимой спектроскопии с течением времени; когда никаких изменений не наблюдалось, синтез считали завершенным. Полученный продукт центрифугировали при 12000 об / мин, супернатант заменяли ультрачистой водой и применяли процесс обработки ультразвуком в течение 1 часа для повторного диспергирования наночастиц. Процедуру повторили еще трижды. В первых двух случаях в качестве растворителя использовалась вода, а в последнем - этанол. Наконец, этанольную дисперсию центрифугировали и осадки сушили в конвекционной печи при 40 ° C, чтобы приготовить водную дисперсию AuNPs при 2300 мкг / мл.

Синтез Au @ AgNP

Для синтеза Au @ AgNPs, 2 мл водной дисперсии AuNPs (2300 мкг / мл), 0,8 мл AgNO ₃ (0,1 M) и 0,8 мл Rumex hymenosepalus раствор (10 мг / мл) помещали в стерильную стеклянную культуральную пробирку. Смесь обрабатывали ультразвуком в течение 3 ч в ванне для ультразвуковой очистки (Branson, модель 2510). Позже содержимое центрифугировали при 12000 об / мин в течение одного часа, полученные твердые вещества повторно диспергировали в сверхчистой воде обработкой ультразвуком для получения концентрации 1000 мкг / мл.

Синтез AgNP

Для получения AgNP 16 мл раствора экстракта (10 мг / мл) смешивали с 64 мл сверхчистой воды и 8 мл AgNO ₃ 0,1 М. Реакцию проводили в течение часа в лабораторных условиях освещения при 25 ° C и поверхностном плазмонном резонансе (\ (\ lambda _ {{{\ text {SPR}}}}} ^ {{{{\ text {Ag}}) }} \) =440 нм) отслеживали с помощью УФ-видимой спектроскопии с течением времени для оценки образования. Продукт центрифугировали при 12000 об / мин, супернатант заменяли ультрачистой водой и обрабатывали ультразвуком в течение 1 часа. Процедуру повторили еще трижды. В первых двух случаях в качестве растворителя использовалась вода, а в последнем - этанол. Этанольную дисперсию центрифугировали и осадки сушили в конвекционной печи при 40 ° C. Наконец, полученная пыль AgNP была повторно диспергирована в сверхчистой воде обработкой ультразвуком для получения коллоидной дисперсии с концентрацией 2000 мкг / мл.

Характеристики

Спектры поглощения в УФ-видимой области получали на двухлучевом спектрометре PerkinElmer Lambda 45. Использовали щель 0,5 нм, и спектры записывали со скоростью 480 нм / мин в диапазоне от 200 до 900 нм. Для наночастиц использовали 50 мкл образца и только 5 мкл экстракта. Конечный объем кварцевых ячеек довели до 3 мл с использованием сверхчистой воды в качестве растворителя.

Дзета-потенциал ( ζ ) AuNP, AgNP и Au @ AgNP измеряли с помощью Zetasizer-Nano ZS (Malvern Instruments, UK). Каждый образец измеряли при комнатной температуре (25 ° C) в трех экземплярах и в зависимости от концентрации при 1, 10, 50 и 100 мкг / мл для каждого образца.

DLS для AuNP, AgNP и Au @ AgNP измеряли с помощью Zetasizer-Nano ZS (Malvern Instruments, UK), оснащенного He – Ne лазером с длиной волны 633 нм. Каждый образец измеряли при комнатной температуре (25 ° C) в трех экземплярах и в зависимости от концентрации при 1, 10, 50 и 100 мкг / мл для каждого образца. Индекс полидисперсности (PDI) был определен из экспериментов DLS с использованием программного обеспечения Malvern через определение \ ({\ text {PDI}} =\ left ({\ frac {\ sigma} {{\ overline {D}}}} \ right) ^ {2} \), где D - средний диаметр, а \ (\ sigma \) - стандартное отклонение \ (D \). Значения PDI 0,10 или менее считаются высоко монодисперсными [62].

Оптическая ширина запрещенной зоны E _g был рассчитан для AgNPs, AuNPs, Ag @ AuNPs, используя уравнение Таука, определив ширину запрещенной зоны в материалах следующим соотношением:

где \ (\ alpha \) - коэффициент поглощения материала (\ (\ alpha \) =2.303 A / d где A - оптическая плотность, d - ширина ячейки) и где E _g - ширина запрещенной зоны в оптическом диапазоне, а hʋ - энергия фотона, полученная путем проведения линии между ( αhʋ ) ⁿ и энергия фотона hʋ . Номер индекса n принимается равным 2 для разрешенных прямых переходов от полосы к полосе в выборках [63] и может быть легко вычислен с помощью графика линейной аппроксимации [64]. Зависит от типа перехода, который может иметь значения 1/2, 2, 3/2 и 3, соответствующие разрешенным прямым, разрешенным косвенным, запрещенным прямым и запрещенным косвенным переходам соответственно [65].

Образцы AgNP, AuNP, Ag @ AuNP и Rh анализировали посредством поглощения инфракрасного излучения с использованием FTIR (PerkinElmer, Inc., Waltham, Spectrum Two). Параметры сбора:4 см ^-1 разрешение, 16 сканирований и от 4000 до 900 см ⁻¹ диапазон длин волн.

Анализы рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии проводили на приборе PerkinElmer, модель PHI 5100, который содержит двойной источник Mg / Al, 300 Вт, 15 кВ. Эмиссионная линия Mg Kα с энергией 1253.6 эВ использовалась для AgNP, AuNPs, Ag @ AuNPs и Rh. Все эксперименты проводились в условиях вакуума 2 × 10 ^–9 Торр. [66]. Данные были проанализированы с помощью программного обеспечения Multipak. Для характеристики XPS используются различные дисперсии наночастиц и Rumex hymenosepalus Раствор экстракта наносили на чистые покровные стекла следующим образом. 30 мкл образца добавляли к покровному стеклу, позволяя ему полностью высохнуть для следующего депозита. Процесс повторяли не менее 5 раз до образования тонкой пленки и затем характеризовали с помощью XPS.

Широкоугольная кольцевая просвечивающая электронная микроскопия в темном поле (HAADF-STEM) может считаться мощным рабочим режимом в электронной микроскопии, который предоставляет большой объем дополнительной информации, разъясняющей структуру наноматериала. HAADF-STEM с поправкой на аберрации может определять с атомным разрешением положения атомов различной химической природы. Это происходит из-за HAADF-STEM с коррекцией аберраций, известного своей химической чувствительностью и высоким пространственным разрешением [67]. В этом режиме работы преобладает некогерентное изображение с незначительным вкладом дифракционного контраста [68]. Таким образом, контраст атомного номера (Z-контраст) в HAADF-STEM с поправкой на аберрацию позволяет нам определять структурные детали наноструктур с большой точностью.

Для анализа STEM образцы анализировали в электронном микроскопе JEOL-JEMARM200, работающем при 200 кВ, с корректором CEOS для линзы конденсатора. Z-Contrast STEM-изображения были записаны одновременно в режимах BF и HAADF. Изображения были записаны с апертурой линзы конденсатора 40 микрон (угол схождения 32–36 мрад) и размером пятна 9 пА.

Для анализа с помощью электронной микроскопии каплю (10 мкл) суспензии Au @ AgNPs наносили на углеродную сетку толщиной 300 меш, сушили до комнатной температуры и помещали в вакуумную камеру на 24 часа.

Наночастицы анализировали с помощью ПЭМ на приборе Jeol 2010F (разрешение 1,9 Å) при 200 кВ. EDS-анализ проводился на рентгеновском спектрометре QUANTAX 200-TEM (Bruker) с детектором XFlash 4010. Для анализа HRTEM микрофотографии TEM были записаны при увеличении более 100000X. Межплоскостные расстояния между кристаллическими плоскостями определяли с помощью анализа цифровой микрофотографии (версия 3.0 Gatan). Подготовка образцов была аналогична описанной выше для анализа STEM.

Данные были собраны с использованием системы дифрактометра Bruker D8 QUEST, оснащенной монохроматором с многослойными зеркалами и запаянной трубкой Cu Kα Microfocus ( λ =1,54178 Å). Кадры были собраны в T =300 К через ω / φ -сканирует, а затем обрабатывает для получения дифрактограмм интенсивности по сравнению с 2Theta. Программное обеспечение High Score Plus использовалось для обработки необработанных данных, а база данных порошковой дифракции ICSD, связанная с программным обеспечением, была реализована для анализа фазовой идентификации поиска по совпадению.

Анализ антибактериальной активности

Тестируемыми микроорганизмами были бактерии Escherichia coli . (ATCC 25922), золотистый стафилококк (ATCC 5538P) и дрожжи Candida albicans выделен из инфицированной мочи, взятой у взрослого пациента мужского пола с инфекцией мочевыводящих путей (наше исследование соответствует принципам Хельсинкской декларации). Brain Heart Infusion (BHI) и картофельный бульон с декстрозой (PDB) использовали для приготовления инокулята бактерий и дрожжей, соответственно. Культуры инкубировали при 37 ° C в течение ночи. Концентрацию в колониеобразующих единицах (КОЕ / мл) на миллилитр суспензии определяли путем измерения оптической плотности в УФ-видимом диапазоне при 540 нм для бактерий и 600 нм для дрожжей. Суспензии, содержащие 4 × 10 ⁸ , 7,8 × 10 ⁸ , и 2,5 × 10 ⁶ КОЕ / мл использовались для E. coli , С. золотистый , и C. albicans , соответственно. Антимикробную активность тестировали в 96-луночных планшетах с использованием жидкой культуральной среды с добавлением наночастиц и микроорганизмов при 37 ºC. Все тесты были выполнены в трех экземплярах. Поглощение измеряли на многомодовом планшет-ридере Synergy HTX Biotek с использованием программного обеспечения Gen 5. Все кривые роста микробов были построены с использованием программного обеспечения Origin Lab 8.0. В качестве первого шага в лунки добавляли 70 мкл свежей бульонной среды (BHI или PDB, в зависимости от исследуемых микроорганизмов), смешанной с наночастицами в необходимой концентрации. Позже в лунки добавляли 30 мкл суспензии микроорганизмов и гомогенизировали со средой. Конечный объем каждой лунки составлял 100 мкл. После внесения посевного материала 96-луночные планшеты считывали на спектрофотометре, описанном выше. Планшеты выдерживали при 37 ° C в течение 24 часов с режимом кругового встряхивания перед каждым считыванием с периодом 15 минут каждое. Скорость роста микроорганизмов определяли путем измерения оптической плотности (OD) на указанной длине волны.

Кривые роста, проанализированные с помощью модели Гомпертца

В литературе хорошо известно, что модель роста Гомпертца хорошо описывает рост популяций микроорганизмов. Эта модель позволяет нам понять два критических параметра в описании роста популяции микроорганизмов:адаптивная фаза (лаг-фаза) и скорость роста популяции. В частности, изучение поведения лаг-фазы при ингибирующем лечении микроорганизмов актуально, потому что оно дает информацию об адаптивных ответах микроорганизма на лечение и даже может дать указания о развитии устойчивости микроорганизма к оцениваемому лечению [69 ].

Модифицированная модель Гомперца была описана Zwietering et al. [70] и адаптировано Li et al. [69] и других авторов [71,72,73,74,75,76,77,78] в качестве модели, которая корректирует кривые роста и

где A это номер ячейки, выраженный как OD ₅₄₀ ( S. aureus и Э. coli ) и OD ₆₀₀ ( С. albicans ), μ - скорость роста на экспоненциальной фазе, а e - экспонента e ¹ , \ (\ lambda \) - фаза задержки. Мы скорректировали нашу кинетику роста с помощью программного обеспечения origin 9.1, чтобы проанализировать влияние на S. золотистый , Э. coli, и С. albicans трех агентов AuNP, AgNP и Au @ AgNP.

Влияние наночастиц на E. coli, , С. золотистый , и C. albicans Рост

кишечная палочка и золотистый стафилококк были инокулированы в среду BHI, и C. albicans инокулировали в бульон PD. Все культуры инкубировали в течение ночи при 36 ° C. После инкубации три культуры доводили до абсорбции 1, 0,7 и 1 соответственно ( λ =540 нм). AuNP, AgNP и Au @ AgNP доводили до концентрации 50 мкг / мл. В 96-луночном планшете скорректированные культуры подвергали воздействию наночастиц в соотношении 7:3, достигая конечного объема 200 мкл на каждую микролунку. Кроме того, скорректированные культуры подвергали воздействию стерильной воды в качестве контрольного условия в тех же ранее описанных условиях. Другие использовали контроли для этого эксперимента:свежая среда и растворы каждой наночастицы без микроорганизмов. кишечная палочка, золотистый стафилококк и Candida albicans подвергались действию AuNP, AgNP и Au @ AgNP соответственно. Микропланшет инкубировали при 36 ° C, и образец каждого микроорганизма в условиях обработки и контроля получали через 1, 7, 13 и 19 часов. Собранные образцы разбавляли серийным солевым раствором 1:10 и распределяли по поверхности планшетов Мюллера – Хинтона. Засеянные планшеты инкубировали при 36 ° C в течение 24 часов. После инкубации рассчитывали КОЕ / мл с помощью прямого подсчета.

Определение минимальной бактерицидной концентрации (МБК)

Золотистый стафилококк , кишечная палочка и Candida albicans инокулировали каждую в бульон Мюллера-Хинтона, инкубировали в течение ночи при 36 ° C и доводили до 0,5 нефелометра МакФарланда. После того, как инокуляты были скорректированы для определения минимальной ингибирующей концентрации (МИК), был проведен тест на микроразведение. Вкратце, для этой цели использовали 96-луночный планшет. 160 мкл скорректированной культуры каждого микроорганизма разливали в 5 лунок. Готовили растворы AuNP, AgNP и Au @ AgNP с концентрацией 1000 мкг / мл. Предыдущие растворы использовались для приготовления растворов 750, 500 и 250 мкг / мл. Чистую стерилизованную воду использовали в качестве наночастиц 0 мкг / мл, и 40 мкл каждого предыдущего раствора добавляли к 160 мкл скорректированных культур. Таким образом, каждая культура подвергалась воздействию конечной концентрации 200, 150, 100, 50 и 0 мкг / мл каждой тестируемой наночастицы. Микропланшет инкубировали при 36 ° C в течение 24 часов. После этого образец каждой лунки инокулировали на поверхность Мюллера-Хинтона и инкубировали в тех же ранее описанных условиях. После инкубации планшеты Müeller-Hinton наблюдали в поисках сигнала роста. Концентрация, при которой не наблюдались сигналы роста, была записана как значение МБК.

Результаты и обсуждения

Характеристика

На рис. 1а представлены спектры поглощения синтезированных наноматериалов в УФ-видимой области. Поглощения были нормализованы для максимального локализованного поверхностного плазмонного резонанса (LSPR), соответствующего каждой системе наночастиц.

УФ-видимые спектры наночастиц ( a ), Z-потенциал ( b ), DLS ( c ) и PDI ( d ) Au, Ag и Au @ AgNPs

Спектр поглощения Au @ AgNps на рис. 1а имеет единственную полосу с центром при 474 нм, которая расположена между AgNPs LSPR (445 нм) и AuNPs LSPR (544 нм). Отсутствие золотоподобного пика поглощения на Au @ AgNP предполагает, что наноматериалы, полученные последовательным синтезом, представляют собой структуры ядро ​​@ оболочка. Невозможно обнаружить какую-либо полосу поглощения, связанную с Au, принадлежащей ядру. Некоторые авторы предполагают, что для систем ядро ​​@ оболочка спектры поглощения состоят из двух полос, связанных с каждым из металлов, для толщины оболочки от 3 до 4 нм. Поглощение, связанное с металлической сердцевиной, исчезает при увеличении толщины, получая единственную полосу поглощения, максимальное положение которой зависит от отношения толщины к размеру сердцевины биметаллической частицы [79, 80].

Samal et al. [81] синтезировали наночастицы ядро ​​@ оболочка (Au @ Ag), контролируя размеры ядер и добавляя оболочки разной толщины. В частности, наш результат в УФ – видимой области для Au @ AgNP совпадает с результатами, полученными Samal et al. для золотых ядер 32 нм и толщины серебра более 15 нм, где спектры характеризуются единственной полосой поглощения (~ 450 нм), и наблюдается подавление поверхностных плазмонов Au.

Кроме того, на рис. 1а можно наблюдать поглощение с центром при 280 нм (область, выделенная синим), что соответствует молекулам из Rumex hymenosepalus экстракт, используемый в качестве восстановителя в нашем синтезе наночастиц. Дополнительный файл 1:Рисунок S1 соответствует Rumex hymenosepalus Спектр поглощения водного раствора. Наблюдается характерная полоса с центром при 278 нм, связанная с электронными переходами ароматических колец, сопряженных с карбонильными группами полифенольных соединений [82]. Эта полоса поглощения в УФ-видимом спектре наночастиц указывает на то, что конечные продукты содержат молекулы экстракта, которые остаются в них, Rivero-Cruz et. al. сообщили о четырех стильбеноидах, двух флаван-3-ола и трех антрахинонах, выделенных из R. hymenosepalus [83] и Родригес-Леон и др. al. провели исследование ядерного магнитного резонанса, чтобы определить, что Rumex hymenosepalus содержат важные молекулы, такие как гликозид стильбена, галлат эпикатехина и галлат эпигаллокатехина [61]. Эти молекулы участвуют в качестве восстановителей в синтезе наночастиц. Процесс включает депротонирование некоторых -ОН-групп фенольных колец с образованием =СО-групп. Молекулы полифенолов окисляются, а высвободившиеся электроны переходят на Ag ⁺ и Ag ³⁺ ионы с образованием Au ⁰ и Ag ⁰ .

На рисунке 1b показаны значения дзета-потенциалов, соответствующие AuNP, AgNP и Au @ AgNP при концентрациях 1, 10, 50 и 100 мкг / мл. Наночастицы диспергировали в сверхчистой воде, и измерения проводили в трех экземплярах при 25 ℃. Как правило, во всем диапазоне концентраций наночастицы демонстрируют значения дзета-потенциала более отрицательные, чем -30 мВ, достигая значений -40 мВ при концентрации 100 мкг / мл для AuNP и Au @ AgNP и -38 мВ для AgNP. Эти крайне отрицательные значения дзета-потенциала указывают на то, что наночастицы испытывают отталкивающие взаимодействия между собой, которые предотвращают их агрегацию и обеспечивают долгосрочную стабильность металлических коллоидов [84,85,86]. Сопоставляя результаты УФ-видимой спектроскопии с полученными значениями дзета-потенциала, мы можем установить, что сильно отрицательные значения могут быть связаны с комплексообразованием полифенольных молекул экстракта на поверхности наночастиц [87].

Для биологических приложений важно получить популяцию наночастиц с монодисперсными размерами [88], поэтому на рис. 1c и d показаны значения DLS, соответствующие среднему диаметру и индексу полидисперсности (PDI) для AuNPs, AgNPs и Au @ AgNPs при концентрациях 1, 10, 50 и 100 мкг / мл. Средний диаметр Au @ AgNPs составляет около 250 нм и остается постоянным в зависимости от концентрации, аналогично для монометаллических наночастиц со средним диаметром около 122 и 135 нм для AuNP и AgNP соответственно. В том же случае обратите внимание, что значения PDI составляют около 0,3 для монометаллических наночастиц и 0,2 для Au @ AgNP. Эти результаты, где размеры не меняются в зависимости от концентрации, показывают, что различные системы наночастиц обладают хорошей стабильностью, представляя умеренную полидисперсность размеров (0,3 ≥ PDI ≥ 0,2).

Была вычислена оптическая ширина запрещенной зоны графика Tauc (дополнительный файл 1:рисунок S2). Зона проводимости полупроводниковых материалов имеет значения E _g <3 эВ, так как эталонный германий имеет E _g <0,7 эВ и кремний E _g =1,1 эВ [89]. В нашем случае ширина запрещенной зоны для Au @ AgNPs, AuNPs и AgNPs составляет 1,93 эВ, 2,03 эВ и 2,33 эВ соответственно. Это означает, что эти материалы считаются полупроводниками, и эта особенность была получена для эффектов квантового ограничения, которые создают увеличенную запрещенную зону, поэтому наноматериалы могут использоваться в качестве датчиков, батарей и оптоэлектронных устройств [64].

Чтобы установить, присутствуют ли в наночастицах органические соединения, эти наноматериалы были охарактеризованы с помощью XPS и FTIR. На рис. 2а представлены обзорные спектры экстракта растений и наночастиц. Как можно видеть, все системы наночастиц представляют характерные сигналы, связанные с элементами углерода (C 1 s, 284,6 эВ) и кислорода (O 1 s, 532,2 эВ) от Rumex hymenosepalus извлекать. Этот результат подтверждает, что органические молекулы из экстракта присутствуют в полученных наноматериалах. Кроме того, были получены XPS-спектры высокого разрешения для анализа степени окисления серебра и золота в наночастицах (дополнительный файл 1:Рисунок S3). Для AgNP (дополнительный файл 1:рисунок S3A) сигналы с энергиями связи 373,76 и 367,76 эВ (∆BE =6,0 эВ), соответствующие спектральным линиям 3d3 / 2 и 3d5 / 2, могут быть связаны с Ag ⁰ (серебристый металлик). Для AuNP (дополнительный файл 1:рисунок S3B) пик, связанный со спин-орбитальным взаимодействием 4f5 / 2, расположен на энергии связи 87,65 эВ. Для 4f7 / 2 пик спин-орбитальной связи расположен при 83,98 эВ. Соотношение интенсивностей (I4f7 / 2> I4f5 / 2), расположение и расстояние между пиками (ΔBE =3.67 эВ) подтверждают, что ионы золота (Au ³⁺ ) полностью восстанавливаются до металлического золота Au ⁰ [90]. Для Au @ AgNP спектры XPS высокого разрешения, соответствующие серебру и золоту, показаны в Дополнительном файле 1:Рисунок S3C и Рисунок S3-D, соответственно. Эти спектры показывают то же поведение, что и их монометаллические аналоги. Это означает, что и серебро, и золото не имеют валентности в представлении core @ shell.

Спектры обзора XPS ( a ) и FTIR ( b ) для Rh, Ag, Au и Au @ AgNP

FTIR на рис. 2e показывает на 3296 см ⁻¹ гидроксильные группы, 2974 см ^-1 (C – H) связь ароматического кольца, 1689 см ^-1 связанный с растяжением карбонильной группы (C =O), и 1689–1400 см ⁻¹ из-за карбоксилатной связи (C – O) и растяжения углерод-углеродной связи и 1212 см ⁻¹ связанный с фенольным удлинением C – O, конъюгированным с AuNP, 1049 см ^-1 C – O режим растяжения молекул сложноэфирной группы катехина [88,89,90] и 799 см ^-1 изгибание из плоскости в феноле, изгиб C – H составил 964,4 и 829,39 см ⁻¹ свойство ресвератрола [91] сдвинуто в экстракте Rh до 1031 и 867 см ^-1 соответственно, и AuNPs, AgNPs и Au @ AgNPs также смещены, что свидетельствует о комплексообразовании молекул полифенольных соединений экстракта Rh с наночастицами.

Рисунок 3a соответствует типичной светлопольной микрофотографии системы Au @ AgNPs в светлом поле при малом увеличении (масштабная линейка 100 нм). Можно увидеть набор наночастиц без агломерации и в основном с квазисферической геометрией. The same region is shown in dark field (HAADF) in Fig. 3b, and the core@shell structure can be observed, where can we distinguish Au-core looks more intense than Ag-shell, due to the difference in atomic number. Figure 3c and d corresponds to STEM higher magnification micrograph (scale bare 20 nm) of a nanoparticles group of system core@shell in a bright and dark field, respectively. Can be appreciated with clarity brilliant Au core and Ag shell lightly contrasted. These images show that the thickness of the Ag-shell varies between 3 and 5 nm. Additional file 1:Figure S4 corresponds to an individual images gallery where can be observed uniformity of Ag-shell.

Scanning Transmission Electron Microscopy at low magnification (scale bar 100 nm) of Au@AgNPs in Bright Field (a ) and HAADF (b ). A Small group of Au@AgNPs at higher magnification (scale bar 20 nm) in Bright Field (c ) and HAADF (d )

Figure 4a, c, and e corresponds to micrograph TEM of representative nanoparticles systems AuNPs, AgNPs, and Au@AgNPs, respectively. In all cases, nanoparticles have sphere-like morphology and are shown well separated from each other. This can be explained by the extract molecules onto nanoparticle surfaces, acting as spacers between them. Figure 4b, d, and f shows histograms corresponding to size distribution obtained by TEM and performed with 500 nanoparticles collected from 15 to 20 micrographs for each nanomaterial. The histogram presents Gaussian distribution with a mean size of 24 ± 4 nm (AuNPs), 13 ± 3 nm (AgNPs), and 36 ± 11 nm (Au@AgNPs). The discrepancy in values between DLS and TEM measurements with size distribution graph is due to conditions micro-environmental around the nanoparticles, while DLS shows a diameter for a system that includes metal, hydrated coating, and solvent by comparison in TEM measurements is a dry system where measurement is over metal only, in particular, in DLS the molecules used for complexation of nanoparticles (reducing agents and stabilizers) are dispersants that induce errors in sizing measurement and shifts it results to higher values [91].

TEM and size distribution of AuNPs in (a ) и ( b ), AgNPs in (c ) и ( d ), and Au@AgNPs in (e ) и ( f )

Figure 5 corresponds to the Au@AgNPs HAADF-STEM micrographics. A single nanoparticle is shown in Fig. 5a with a gold nucleus and silver cover perfectly delimited, the atomic number (Z) changes through the interface Au@Ag, intensity variations can be quantified by HAADF-STEM [67].

Au@AgNPs HRTEM (a ). Magnification from (a ) of interface core–shell (b ). FFT plot with Miller index (c ) and integrated image from FFT (Inverse) with interplanar distance (d )

The red square region is amplified to obtain an HRTEM micrography of the shell portion (Fig. 5b), and then to verify the crystalline shell structure, the nanoparticle periphery region was analyzed (discontinued square) with the Digital Micrograph 3.0 software (Gatan). Fast Fourier Transform (FFT) image of the selected area was obtained (Fig. 5c). Using the Inverse Fast Fourier Transform was possible to estimate interplanar distances of 2.3 Å, 2.0 Å, and 1.4 Å in Fig. 5d. These distances can be assigned, respectively, to the crystalline planes (111), (200), and (220) of face-centered cubic (fcc) silver according to Inorganic Crystal Structure Database (ICSD) at the FIZ Karlsruhe–Leibniz Institute for Information Infrastructure, Germany or the electron crystallography software Jems (V 4-5430, JEMS-SAAS, Switzerland) [92]. A similar analysis of crystal structure by HRTEM was carried out for monometallic nanoparticles as illustrated in Additional file 1:Figures S5 (for AuNPs) and S6 (AgNPs). In both cases, crystal structure corresponds to face-centered cubic (fcc).

EDS chemical analysis shows the presence of both metals for a group of bimetallic Au@AgNPs observed by TEM (Fig. 6a) in proportions of the atomic weight percent 77% of Ag (shell) and 23% of Au (cores) (Fig. 6b). In comparison, a single bimetallic (Fig. 6c) Au@AgNPs has proportions around 80% of Ag (shell) and 20% of Au (core) (Fig. 6d). To estimate the gold and silver atomic percentage on core@shell nanoparticles (Au@Ag), a quasi-spherical geometry approximation of nanoparticles morphology was considered. The AuNPs average diameter obtained from TEM size distribution (\(\overline{D}_{{{\text{Au}}}} =24\;{\text{nm}}\)) was used for core volume estimation (V _Au ), and Au@AgNPs average diameter \(\left( {\overline{D}_{{{\text{Au}}@{\text{Ag}}}} =36\,{\text{nm}}} \right)\) for core@shell volume estimation \((V_{{{\text{Au}}@{\text{Ag}}}} )\). So, shell volume is determined as \(V_{{{\text{Ag}}}} =V_{{{\text{Au}}@{\text{Ag}}}} - V_{{{\text{Au}}}}\). Total atomic content of Au and Ag was calculated considering an fcc crystalline structure (4 atoms per unit cell) for booth metals where the Au and Ag lattice parameters are 4.0783 Å and 4.0862 Å, respectively [93]. Atomic content estimation by this procedure is 70% for Ag (Shell) and 30% Au (Core), which differs by 10% concerning the measurement obtained by EDS. Figure 7 shows a theoretical estimation of silver and gold content and how varies as the thickness of the shell increases and the size of the core is kept constant (\(\overline{D}_{{{\text{Au}}}} =24\;{\text{nm}}\)). It is observed that for Au@AgNPs with a diameter greater than 30.2 nm, the atomic content of silver exceeds the content of gold. In Supplementary Material, a detailed description of calculation is carried out to obtain atomic contents percentage. Similar estimations of atomic percentages were carried out considering other Au-core diameters and varying Au@AgNPs diameter (Additional file 1:Figure S7A-B).

TEM and EDS of an Au@AgNPs group (a , b ) with Au 23 and Ag 77% at. and single Au@AgNPs (c , d ) with Au 20 and Ag 80% at

Variations of atomic content percentage versus increase thickness shell, where diameter AuNPs (24 nm) was kept constant

Figure 8 corresponds to XRD patterns for AuNPs and AgNPs as well as bimetallic Au@AgNPs. All the synthesized products have fcc crystalline structure as previously reported in the characterization by electron microscopy. Peaks for Au@AgNPs are located at 2θ diffraction angles of 38.25°, 44.4°, 64.9°, 77.85°, and 81.25°. As can be appreciated in the figure, the AgNPs and AuNPs diffraction peaks are found in the same positions mentioned with a difference of ± 0.5°. This is because Au and Ag have very similar lattice constants, so their diffraction patterns for fcc crystal structure are almost identical [94,95,96]. In this way, the diffraction peaks in Fig. 8 are assigned, respectively, to the crystalline planes (111), (200), (220), (311), and (222) of the gold and silver fcc structure by JCPDS:4-0783 and 4-0784 [97].

X-ray Diffraction AuNPs (pink), AgNPs (brown), and Au@AgNPs (red)

Antimicrobial Activity

Monometallic (AgNPs, AuNPs) and bimetallic (Au@AgNPs) materials were tested at four different concentrations:1, 10, 50, and 100 μg/mL. Selected microorganisms to evaluate antimicrobial activity were yeast Candida albicans , Gram-positive bacteria S.aureus , and Gram-negative bacteria E. coli . Growth kinetics curves in a time-lapse of 24 h are shown in Fig. 9.

The growth curves using AuNPs, AgNPs, and Au@AgNPs like inhibitory treatments on Candida albicans ( а - c ), Escherichia coli ( д - е ), and Staphylococcus aureus (g - я )

Candida albicans

AuNPs show no effect on growth kinetics until 10 h (Fig. 9a), varying in a dose-dependent manner the absorbance reached at 24 h. Interestingly, with 50 µg/mL or more, the growth kinetic shows a steep negative slope from 10 h until reaching a 45% reduction at 24 h, which suggests an antifungal effect of these materials. This can be attributed to the ability of gold nanoparticles to interact with relevant proteins present in fungus such as H ⁺ -ATPase, affecting proton pump activity. This atrophying the ability of yeast to incorporate nutrients causing its death [61]. In Fig. 9b and c was observed that AgNPs and Au@AgNPs inhibit the growth of the yeast Candida albicans from 10 µg/mL. The determination of the MIC₅₀ concentration for both materials was estimated from the dose–response curve shown in Additional file 1:Figure S8. MIC₅₀ is defined as the concentration of nanoparticles that produces a 50% decrease in absorbance concerning the control (yeast without treatment). For AgNPs and Au@AgNPs, MIC₅₀ were 2.21 µg/mL and 2.37 µg/mL, respectively.

However, according to the EDS results (Fig. 9b), the silver content in Au@AgNPs is 64.85% mass. Thus, the concentration of silver in Au@AgNPs for MIC₅₀ is 1.53 µg/mL, 30% lower than in the case of AgNPs. Padmos et. al. have demonstrated that silver nanoparticles possess important antibacterial features, but are cytotoxic by mammalian cells this effect has reduced using bimetallic nanoparticles especially using gold in the core of bimetallic nanoparticles [35].

Escherichia coli

In Fig. 9d, AuNPs do not show significant inhibition (< 15%) or affect the growth kinetics of E. coli . For AgNPs (Fig. 9e) at low concentrations, the Lag phase remains unchanged, but there is a marked decrease in growth ratio indicated by the slope decrement. At 50 µg/mL Lag phase lasts up to 16 h and viability reaches a maximum of 20% at 24 h. For 100 µg/mL, an apparent detachment of the growth phase of the microorganism is not observed. In Au@AgNPs (Fig. 9f), the first two concentrations do not show changes in their growth phase, but a phase delay of up to 2 h is observed compared to the control. It is interesting to note that the lag phase lasts up to 21 h for the 50 µg/mL concentration, finally there is no explicit growth behavior for the 100 µg/mL concentration.

Staphylococcus aureus

A comparative analysis of lag phase regrowth occurred after 12 h for Au (Fig. 9g), Ag (Fig. 9h), and Au@AgNPs (Fig. 9i) in the case of S. золотистый at 50 µg/mL. For the highest concentration at 100 µg/mL, there is no growth of the bacteria. Additionally, we observe changes in the slope of respect control for Au, Ag, and Au@AgNPs at 1 and 10 µg/mL.

AuNPs interaction with these Gram-positive bacteria could be due to the charged surface that causes an electrostatic interaction, destabilizing membrane structure. Similar results, but with higher NPs concentrations, are reported for AuNPs synthesized using Ananas comosus fruit extract as reducing agent [98] and blue-green alga Spirulina platensis protein [99]. Ян и др. show MIC > 500 µg/mL for S. золотистый (CMCC(B)26003), our AuNPs has shown inhibition with 10 times less concentration; in this case, a critical synergy exists with polyphenols molecules on coating and stabilizing the surface of nanoparticle [100]. ROS is generated of less to higher intensity [101] by AuNPs, polyphenols (plant extracts), and AgNPs, so AuNPs in synergy with resveratrol and epigallocatechin gallate (EGCG) promote antibacterial response over S. золотистый [102] had the most feasible mechanism in this case. Penders et al. reported 250 and 500 µg/mL of AuNPs-like antibacterial agents over S. золотистый increases in bacterial growth lag time and antibacterial effect [61, 98, 99].

We believe that inhibition is caused by AgNPs [103] accumulation and diffusion on bacteria related to NPs surface charges that promote electrostatic interactions [104] with the bacteria's membrane leading to higher penetration and damage. We think this is a similar mechanism described for interactions between E. coli biofilms and AgNps [105].

For Au@AgNPs, the obtained results are comparable to those reported by other workgroups [100, 101]; however, different authors suggest that the inhibition of the growth of the microorganisms is directly related to the thickness of the shell [100, 101]. Core–shell NPs showed low cytotoxicity when tested in NIH-3T3 fibroblasts cells (normal mammalian cells) [35]. A lower proportion of silver in the shell of the Au@AgNPs shows similar results to AgNPs [100], and Au core potentializes antibacterial effect, and minimizes the cytotoxicity.

Curves Growth Analyzed by the Modified Gompertz Model

To know how the growth ratios (µ ) and Lag phase (λ ) are quantitatively modified, the growth curves of microorganisms exposed to different concentrations of nanomaterials (Fig. 10) were adjusted by the Gompertz model (Eq. 2).

Kinetic parameters were obtained by the Gompertz model. Growth Rate µ and Time Lag Phase \(\lambda\) for S. золотистый ( а , b ) and E. coli ( c , d )

In Fig. 10a, it can be seen that all nanomaterials produce a decrease in the replication rate of S. золотистый populations when the concentration of nanoparticles increases. This effect results in slightly higher sensitivity for AuNPs. At a concentration of 50 µg/mL, the growth ratio is only 30% concerning control (Additional file 1:Tables S1-S24); at a concentration of 100 µg/mL, all materials inhibit the growth of the S. золотистый population. The behavior of the adaptive phase for S. золотистый with the different treatments is shown in Fig. 10b. It is observed that there are no significant differences in the material used, and at 50 µg/mL, the Lag phase has increased by almost 5 times compared to the adaptive phase of S. золотистый (Additional file 1:Tables S1-S24). In general, we can establish that the different nanomaterials evaluated in S. золотистый reduce the replication rate and postpone the adaptive phase in a dose-dependent manner until its inhibition at 100 µg/mL.

Figure 10c clearly shows that AuNPs do not affect the growth ratio µ of E. coli бактерии. Meanwhile, AgNPs produce a decrease over µ , reaching a minimum value corresponding to 19% to the control (µ for E.coli without treatment) for 50 µg/mL (see Additional file 1:Table S52). In contrast, Au@AgNPs completely inhibit the E. coli growth at 100 µg/mL. Analysis of the behavior of E. coli Lag phase exposed to different materials is shown in Fig. 10d. In this case, unlike Fig. 10b, each material has a characteristic response. Thus, AuNPs do not generate any modification in the adaptive phase of E. coli , while AgNPs and Au@AgNPs have a dose-dependent effect on the Lag phase, the latter material standing out. Thus, we can establish that AuNPs have no appreciable effect on E. coli bacteria, and Au@AgNPs can inhibit replication and, therefore, indefinitely postpone the Lag phase of E. coli . Interestingly, this effect is not achieved for AgNPs even though the net silver content is higher than in Au@AgNPs. This suggests that the core@shell presentation of both metals produces a synergy that favors antimicrobial activity. Feng et. al. have reported an electron compensation phenomena from Au to Ag in core–shell and alloy structures, which derive in enhance the cytotoxicity of nanoparticles but kept it the antibacterial properties, that means, a synergy between Au and Ag are assumed, due to observed differences between the monometallic and bimetallic materials [106], but more research is necessary.

Figure 11 shows the results of the direct count study of colonies of microorganisms exposed to nanomaterials. In general, the behavior of the microorganism populations reproduces the results obtained from the growth kinetics study (Fig. 7a, e, i). For example, in Fig. 11a, the population of microorganisms (represented logarithmically) decreases significantly only at 19 h where AuNPs have killed 92% of C. albicans . Interestingly, for nanoparticles containing silver (Fig. 11b, c) a more pronounced population decline is observed. Au@AgNPs system at 50 µg/mL, almost entirely inhibits S. золотистый at 7 h (99.5% of bacteria killed) although microorganism reactivates its growth for later times. MBC determination was not possible to obtain for tested concentrations (Additional file 1:Figure S9-11), according to experimental observation higher concentrations are required to show this effect. However, for C. albicans , AgNPs showed an MBC value of 50 µg/mL (Additional file 1:Table S55).

Effect of nanoparticles over microorganisms growth C. albicans exposed to AuNPs (a ), E. coli exposed to AgNPs (b ), and S. золотистый exposed to Au@AgNPs (c ). All microorganisms were exposed at 50 µg/mL nanoparticles concentration

Conclusions

For the first time, the production of gold nanoparticles and core@shell (Au@Ag) is reported using a Rumex hymenosepalus root extract as a reducing agent. To obtain Au@AgNPs is proposed a two-step sequential method that produces particles with moderate polydispersity and homogeneous silver shell. Determination of the growth curves and their parameters obtained through the Gompertz model indicate different effects of the nanomaterials on evaluated microorganisms. Inhibitory effects of AuNPs over S. золотистый are reached at a concentration of 5 times less to report for other AuNPs synthesized by different processes. This reveals the importance of the synthesis process followed and the environment on the surface of the nanoparticles. On the other hand, AgNPs and Au@AgNPs produce a great growth of the lag phase (> 12 h). However, bacteria can adapt and initiate their growth at these sub-inhibitory concentrations with the consequent risk of generating resistance to these nanomaterials. This highlights the importance of conducting growth kinetic studies that cover an appropriate period to discard a delayed growth. Interestingly, Gompertz's analysis indicates that Au@AgNPs present a higher effect on the growth kinetic of microorganisms than shown by monometallic nanoparticles, which can be attributed to a synergistic effect of both metals on the core@shell structure. Bactericidal effects are only achieved in C. albicans exposed to AgNPs. More experiments must be carried out on higher concentration ranges of these nanomaterials (> 200 µg/mL) to determine their MBC on the studied microorganisms.

Доступность данных и материалов

All data generated or analyzed during this study are included in this article and its supplementary information file.

Сокращения

AuNPs:

Наночастицы золота

AgNPs:

Наночастицы серебра

Au@AgNPs:

Gold–silver bimetallic nanoparticles with core@shell structure

DLS:

Динамическое рассеяние света

EDS:

Энергодисперсионная рентгеновская спектроскопия

EGCG:

Epigallocatechin gallate

FTIR:

Инфракрасный спектрометр с преобразованием Фурье

HAADF:

High angle annular dark field images

MBC:

Minimal bactericidal concentration

MIC:

Minimum inhibitory concentration

Rh:

Rumex hymenosepalus Root extract

ТЕМ:

Просвечивающая электронная микроскопия

STEM:

Scanning transmission electron microscope

УФ-видимый:

Spectroscopy ultraviolet–visible spectroscopy

XPS:

Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия

XRD:

Рентгеновская дифракция