Регулируемая морфология поверхности композитных нановолокон на основе полианилина / полимолочной кислоты посредством допирования различными неорганическими кислотами для повышения биосовместимости в тканевой инженерии

Введение

Внеклеточный матрикс (ЕСМ) представляет собой тип макромолекулярной сети, секретируемой клетками во внеклеточную строму. Он представляет собой основу клеток, тканей и органов, сопровождаемых органами, и характеризуется сложной сетчатой ​​структурой [1, 2]. Более того, он обеспечивает подходящее место для выживания и активности клеток, определения их формы, контроля их дифференцировки, участия в их миграции и метаболизме и, в конечном итоге, влияющих на их выживание, рост и смерть [3, 4]. Нановолокна, полученные методом электропрядения, могут имитировать действие внеклеточного матрикса для регулирования поведения клеток благодаря их высокой удельной площади поверхности, подходящим механическим свойствам и способности к биоразложению. Кроме того, нановолокна, полученные методом электропрядения, могут быть многофункциональными за счет модификации поверхности на основе сохранения ее пористой структуры. Таким образом, нановолокна с электропрядением стали перспективным материалом-кандидатом в тканевой инженерии, который широко применяется для доставки лекарств, ортопедической регенерации, регенерации и восстановления нервов [5,6,7,8,9,10].

Проводящие полимеры (например, полипиррол [PPy], политиофен [PTH] и полианилин [PANI]) обладают хорошей биосовместимостью in vitro и in vivo, что может значительно влиять на адгезию, пролиферацию и дифференцировку клеток, а также на регенерацию тканей [11,12 , 13]. Среди этих проводящих полимеров PANI считается потенциальным материалом для тканевой инженерии и регенеративной медицины из-за его хорошей обрабатываемости, отличной проводимости, хорошей окислительно-восстановительной стабильности и биосовместимости [14, 15]. При электростимуляции PANI может регулировать клеточную адгезию, пролиферацию, миграцию и дифференцировку [16, 17]. Фактически, многочисленные отчеты пришли к выводу, что проводящие разлагаемые композитные нановолокна на основе PANI способствуют поведению клеток в электрическом поле [18,19,20,21]. Однако это влечет за собой важную проблему, заключающуюся в том, что проводимость PANI в физиологической среде (pH =7,4) будет ослаблена из-за дедопированного PANI, что, как показали предыдущие исследования, снижает преимущества его электрической активности, способствующие пролиферации и дифференцировке клеток [22]. . Хотя это явно представляет собой ограничение проводящих разлагаемых нановолокон на основе PANI в инженерии костной ткани при внешней электрической стимуляции, они все же могут в значительной степени способствовать пролиферации и росту клеток [23, 24]. Здесь мы предположили, что морфология поверхности PANI увеличивает шероховатость композитных нановолокон, что способствует адгезии, росту и пролиферации клеток.

Полианилин, допированный неорганическими кислотами, обычно имеет хорошую электропроводность. Однако анионы, вводимые различными легирующими добавками неорганических кислот, будут влиять на проводимость и структуру полианилина [25,26,27]. В этой статье три распространенных неорганических кислоты, а именно соляная кислота (HCl, HA), серная кислота (H ₂ SO ₄ , SA) и хлорную кислоту (HClO ₄ , PA), были выбраны в качестве легирующих примесей в окислительной полимеризации PANI in situ. Затем были исследованы механические свойства, смачиваемость, морфология поверхности, биосовместимость и клеточная адгезия нановолокон PANI / полимолочная кислота (PLA) при различных кислотных добавках. Результаты показали, что чем выше шероховатость поверхности PANI, тем лучше пролиферация клеток, что свидетельствует о лучшей биосовместимости.

Методы / экспериментальные

Химические вещества

Анилин (AN) был приобретен у Sigma, PLA ( M w =60000) был приобретен у Solarbio, дихлорметан (DCM) был приобретен у Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd., а N, N-диметилформамид (DMF) был приобретен у Macklin. Тем временем персульфат аммония (APS) был приобретен у Aladdin, HCl и H ₂ SO ₄ были приобретены у Guangzhou Chemical Co., Ltd., и HClO ₄ был куплен у Macklin.

Получение нановолокон полианилина / полимолочной кислоты

Производство нановолокон из полимолочной кислоты с помощью электропрядения

Частицы PLA с определенной массой добавляли в смешанный раствор DCM и DMF (объемное соотношение 7:3) перед перемешиванием до их растворения, и получали смешанный раствор 10% PLA. Затем раствор PLA был помещен в шприц и подключен к источнику высокого напряжения. Электропрядильная машина (DP-30, Tianjin Yunfan Technology Co., Ltd.) была настроена на напряжение 15 кВ на расстоянии 15 см. Полученные нановолокна PLA сушили в вакууме в течение ночи при 40 ° C.

Получение нановолокон полианилина / полимолочной кислоты, допированных различными неорганическими кислотами

Нановолокна PLA помещали в камеру машины плазменной очистки (PCE-6, MTI Corporation, США) и разряжали в течение 2 мин при мощности RF 30 Вт. В этой статье три распространенных неорганических кислоты, а именно HCl, H ₂ SO ₄ , и HClO ₄ , были использованы в качестве добавок для окислительной полимеризации in situ при получении нановолокон PANI / PLA [24], а соответствующие нановолокна PANI были обозначены как PANI-HA, PANI-SA и PANI-PA соответственно, в то время как PANI / PLA нанокомпозитные нановолокна были обозначены как PANI / PLA-HA, PANI / PLA-SA и PANI / PLA-PA соответственно. Процесс получения композитных нановолокон PLA и PANI / PLA показан на рис. 1.

Схема, изображающая процесс получения композитных нановолокон PLA и PANI / PLA

Нановолокна нанокомпозита ПАНИ / ПЛА получали в условиях ледяной бани [16, 28]. APS и AN добавляли к 1 М раствору кислоты в молярном соотношении 1:1. Здесь мы возьмем HCl в качестве примера, чтобы проиллюстрировать процесс получения нановолокон PANI / PLA. В условиях ледяной бани AN (930 мг, 0,01 моль) по каплям добавляли к APS (2280 мг, 0,01 моль) и растворяли в 50 мл 1 М HCl. Сразу же обработанную плазмой мембрану из нановолокна PLA погружали в раствор и перемешивали в течение 2 ч при 0 ° C. После реакции мембрану из нановолокна PLA несколько раз очищали HCl и этанолом для удаления неприсоединенного PANI перед сушкой в ​​течение ночи при 40 ° C для получения нановолокон PANI / PLA-HA, которые откладывали для дальнейшего использования. Композитные нановолокна PANI / PLA-SA и PANI / PLA-PA были получены с использованием аналогичного подхода.

Характеристика

Испытания на одноосное растяжение нановолокон из PLA и композитных нановолокон PANI / PLA проводились с помощью испытания на растяжение-напряжение (Shimadzu AGX-PLUS, Япония). Здесь образец был вырезан в форме гантели, при этом скорость растяжения поддерживалась постоянной 3 мм / мин. Модуль Юнга был рассчитан на основе линейного участка деформации 0–15% на кривой "напряжение – деформация", а предел прочности на разрыв и скорость разрушения при растяжении кривой были определены на основе разрушения мембраны из нановолокна.

Морфология каркасов из нановолокон была охарактеризована с помощью автоэмиссионной сканирующей электронной микроскопии (FE-SEM) (Hitachi-SU8220, Япония) для наблюдения за различной морфологией PANI, легированного различными неорганическими кислотами. Перед наблюдением с помощью SEM образцы нановолокон были опрысканы золотом в течение 60 с, чтобы обеспечить более четкое наблюдение за морфологией. Между тем, шероховатость поверхности композитных нановолокон PANI / PLA была измерена с помощью атомно-силовой микроскопии (AFM, Bruker Dimension Edge). Чтобы подтвердить, что PANI был полностью загружен на нановолокна PLA, была использована инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (FTIR) (Thermo Nicolet iS50) для измерения изменения длины волны на 2000 ~ 500 см ^-1 . Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия (XPS; Thermo ESCALAB 250) и Al-Kα использовались в качестве источников рентгеновского излучения для дальнейшего определения состава поверхности нановолокон PANI / PLA, в то время как их смачиваемость измерялась в терминах краевого угла смачивания. капли воды при температуре окружающей среды с помощью анализа краевого угла смачивания (OCA 15 plus, Германия). Деградацию нановолокон оценивали методом потери массы [29, 30]. Мембраны из нановолокон разрезали на диски диаметром 16 мм и помещали в 20 мл фосфатно-солевого буфера (PBS) с pH 7,4 перед тем, как скаффолды инкубировали при 37 ° C в течение 7, 14 и 21 дней и сушили до постоянного веса. .

Биосовместимость композитных нанофиброзных каркасов PANI / PLA

Биосовместимость

В этой статье биосовместимость композитных нановолоконных каркасов PANI / PLA была охарактеризована в эксперименте по активности клеток остеосаркомы человека (HOS). Клетки HOS были приобретены в банке клеток Китайской академии наук в Шанхае. Клетки HOS культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко с низким содержанием глюкозы (DMEM), содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 Ед / мл пенициллина и 100 Ед / мл стрептомицина, перед инкубацией при 37 ° C и 5% CO 2. . Когда рост клеток достиг 90% степени слияния, клетки пассировали в соотношении 1:3.

Клетки HOS должны были быть засеяны на нановолокна PANI / PLA перед тестом на пролиферацию клеток. Здесь нановолокна помещали в 96-луночный планшет так, чтобы они полностью покрывали дно планшета перед стерилизацией УФ-излучением в течение 30 минут и 75% раствором этанола в течение 30 минут. Затем их промывали PBS. Затем нановолокна инокулировали 1 × 10 ⁴ плотности лунок, в то время как холостая группа и контрольная группа были созданы одновременно. Затем клетки инкубировали в инкубаторе для клеток при 37 ° C в течение одного, трех и пяти дней, обновляя среду каждые два дня.

Жизнеспособность клеток нановолокон PANI / PLA оценивали с помощью анализа 3- (4,5-диметил-2-тиазолил) -2,5-дифенил-2-H-тетразолия бромида (МТТ). После инкубации в течение одного, трех и пяти дней среду удаляли из 96-луночного планшета и трижды промывали PBS перед добавлением 1 мл DMEM, содержащего 10% 5 мг / мл МТТ. Затем среду инкубировали при 37 ° C в течение 4 часов и затем удаляли перед добавлением ДМСО для растворения метилпреднизолона. Среду встряхивали в течение 10 минут, а затем определяли оптическую плотность (BioTek Synergy HTX, США).

Флуоресцентное иммуноокрашивание

Клетки HOS инкубировали в инкубаторе с нановолокном PANI / PLA в течение 24 ч и трижды промывали PBS. Затем клетки фиксировали 4% параформальдегидом в течение 10 мин при комнатной температуре. Фиксированные клетки трижды промывали PBS (каждый раз по 10 минут) и добавляли 10 мкл 100 нМ FITC-меченного пептида перед тем, как клетки инкубировали в течение 30 минут при комнатной температуре, а затем трижды промывали PBS (каждый раз по 5 минут). ). Внеклеточный актин клеток HOS был окрашен с помощью конфокальной микроскопии (тип A1, Nikon, Япония), используемой для наблюдения за окрашиванием клеток при 20-кратном увеличении.

Прилипание клеток

Адгезию клеток HOS на композитных нановолоконных каркасах PANI / PLA наблюдали с помощью SEM. Здесь культуральную среду удаляли после 24-часовой культуры клеток HOS из нановолокон PANI / PLA и затем трижды промывали PBS перед добавлением 4% PFA. Среду фиксировали в течение ночи при 4 ° C, трижды промывали PBS, дегидратировали градиентным раствором этанола (30%, 50%, 70%, 85%, 90% и 100% соответственно; каждый раз по 20 минут) и затем сушили вымораживанием в течение 24 часов. Перед наблюдением с помощью SEM нановолокна были опрысканы платиной в течение 120 с, чтобы обеспечить лучшее наблюдение.

Активность щелочной фосфатазы (ЩФ)

ЩФ является одним из обычно используемых маркеров ранней дифференцировки остеобластов, который зависит от экспрессии фермента щелочной фосфатазы. Здесь активность ЩФ определяли с использованием набора для анализа ЩФ (Beyotime Biotechnology, P0321S) . Клетки HOS культивировали на различных композитных каркасах PANI / PLA в течение обозначенных 7 дней. Клетки лизировали с использованием 50 мкл трис-HCl (0,1 М, pH 8) с 0,1% (об. / Об.) Тритона Х-100. Активность ЩФ анализируется путем определения концентрации p -нитрофенол из п -нитрофенилфосфат (PNPP), который оценивается путем регистрации оптической плотности при 405 нм. Процент активности ЩФ клеток, культивируемых вдоль нановолокон PANI / PLA, рассчитывается путем сравнения активности ЩФ клеток, культивированных на исходных нановолокнах PLA.

Статистический анализ

Статистическая значимость результатов оценивалась с помощью одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с использованием GraphPad Prism (версия 8.02). Здесь были проанализированы различия в механических свойствах, биоразлагаемости in vitro и жизнеспособности клеток среди различных композитных нановолоконных каркасов PANI / PLA. Результаты считались значительными, когда p <0,05 (*) и очень значимо, когда p <0,005 (∗∗).

Результаты и обсуждение

Механические свойства каркасов тканевой инженерии являются важными показателями при оценке того, могут ли каркасы выдерживать гидродинамику. Присутствие неорганических кислот может влиять на физические и химические свойства матрицы PLA композитных нановолокон PANI / PLA в процессе химической окислительной полимеризации PANI in situ. Следовательно, изучение механических свойств композитных нановолокон ПАНИ / ПЛА, легированных неорганическими кислотами, является необходимым. Здесь механические свойства композитных нановолокон PANI / PLA были оценены с помощью испытания на растяжение, которое показано на рис. 2, включая напряжение-деформацию, модуль Юнга, предел прочности на разрыв и удлинение при разрыве. Как показано на рис. 2а, нановолокна из PLA демонстрируют линейное упругое поведение, а композитные нановолокна PANI / PLA-HA и PANI / PLA-SA демонстрируют четкую характеристику текучести, в то время как композитные нановолокна PANI / PLA-PA разрушаются сразу после упругой деформации. . Модуль Юнга (рис. 2b) композитных нановолокон PANI / PLA был выше, чем у нановолокон PLA. По сравнению с PLA увеличение модуля упругости PANI / PLA-HA, PANI / PLA-SA и PANI / PLA-PA составило 53,5 ± 9,09, 60,00 ± 9,47 и 28,43 ± 8,34 МПа соответственно. Что касается прочности на разрыв (Рис. 2c) и коэффициента прочности на разрыв (Рис. 2d), то у PANI / PLA-HA и PANI / PLA-PA уменьшились, а у PANI / PLA-SA несколько увеличились; прочность на разрыв и относительное удлинение при разрыве ПАНИ / ПЛА-ПА были самыми низкими. По сравнению с нановолокнами из PLA прочность на разрыв ПАНИ / ПЛА-ГА и ПАНИ / ПЛА-ПА снизилась на 0,15 ± 0,01 и 0,64 ± 0,03 МПа соответственно, а у ПАНИ / ПЛА-СА несколько увеличилась на 0,13 ± 0,05 МПа. Относительное удлинение при разрыве PANI / PLA-HA и PANI / PLA-PA снизилось на 16,93 ± 1,38% и 35,42 ± 3,94% соответственно, в то время как удлинение для PANI / PLA-SA увеличилось на 3,32 ± 0,13%.

Механические свойства нановолокон PLA и композитных нановолокон PANI / PLA. а Типичные кривые растягивающее напряжение – деформация, b Модуль Юнга, c предел прочности при разрыве, d удлинение при разрыве

Как показано на рис. 2, выбранные неорганические кислоты могут увеличивать модуль упругости нановолокон PLA за счет соединения покрытия PANI. С точки зрения прочности на разрыв и удлинения при разрыве, по сравнению с нановолокнами из PLA, механические свойства PANI / PLA-HA и PANI / PLA-SA варьировались в разной степени, в то время как свойства PANI / PLA-PA снижались наиболее явно, и как только поскольку во время испытания прикладывалась нагрузка, разрушение произошло менее чем за 5 с. Эти результаты могут быть связаны с окислением HClO ₄ , что привело к разрыву сложноэфирной связи в молекулярной цепи PLA и окислительному разложению карбоксильной группы, что впоследствии привело к ухудшению механических свойств [31]. Между тем, разные механические свойства PANI / PLA-HA и PANI / PLA-SA могут быть связаны с разной плотностью PANI, легированного HCl и H ₂ SO ₄ , в то время как введение APS в процесс реакции могло также иметь небольшое влияние на нановолокна PLA, при всестороннем влиянии этих факторов, проявляющих различные механические свойства [32].

На адгезию, пролиферацию и дифференцировку клеток влияет морфология, при этом шероховатая поверхность обычно считается способствующей клеточной адгезии [33]. Гидрофобность нановолокон PLA означает, что однородная полимеризация PANI представляет собой барьер, в то время как обработка поверхности нановолокон PLA плазмой может значительно улучшить смачиваемость [34]. После полимеризации in situ на основе PANI с различными добавками неорганических кислот были получены композитные нановолокна PANI / PLA с однородным поверхностным осаждением.

Морфологию PANI на поверхности различных волокон PANI / PLA наблюдали с помощью FE-SEM (рис. 3). На рисунке ясно показано, что поверхность нановолокон PLA была покрыта множеством наночастиц неправильной формы и что композитные нановолокна PANI / PLA, легированные неорганическими кислотами, были способны сохранять хорошую морфологию волокон и пористую структуру нановолокон. Наблюдения за морфологией показали, что композитные нановолокна PANI / PLA были успешно загружены PANI, который обеспечивал основу для клеточной адгезии и пролиферации. Между тем, AFM использовался для измерения шероховатости поверхности композитных нановолокон PANI / PLA, как показано на рис. 4. Ra, среднее значение шероховатости поверхности в трех различных положениях каждого образца, обычно используется для оценки шероховатости поверхности образца. Кроме того, Ra композитных нановолокон PANI / PLA было больше, чем Ra у нановолокон PLA, а Ra у PANI / PLA-PA было самым высоким. Это увеличение шероховатости поверхности привело к увеличению площади поверхности и полярности, потенциально обеспечивая больше участков роста для клеток и способствуя адгезии клеток.

Морфология а Нановолокна PLA, b ПАНИ / ПЛА-ГА, c PANI / PLA-SA и d Композитные нановолокна ПАНИ / ПЛА-ПА

Изображение AFM и шероховатость поверхности (Ra) a Нановолокна PLA, b ПАНИ / ПЛА-ГА, c PANI / PLA-SA и d Композитные нановолокна ПАНИ / ПЛА-ПА

Смачиваемость каркасов существенно влияет на адгезию, миграцию и пролиферацию клеток [35, 36]. Обычно смачиваемость оценивается по краю контакта между каркасом и водой. Учитывая, что PLA является гидрофобным, мы измерили угол смачивания капель воды на мембране из нановолокна в течение 1 с, как показано на рис. 5, и было обнаружено, что углы смачивания нановолокон PANI / PLA после обработки значительно уменьшились. Соответствующие углы смачивания PLA, PANI / PLA-HA, PANI / PLA-SA и PANI / PLA-PA составляли 112 °, 61,6 °, 36,7 ° и 37,2 ° соответственно. Морфология PANI PANI / PLA увеличивает поверхностную энергию системы, при этом площадь контакта увеличивается при начальном контакте с водой, что приводит к уменьшению угла контакта и улучшению смачиваемости. Угол смачивания композитных нановолокон изменился до 0 ° после 5 с контакта с водой, что свидетельствует о хорошей гидрофильности. Этот гидрофильный каркас также обеспечивает благоприятные условия для клеточной адгезии и диффузии [37], поскольку кислородсодержащие функциональные группы (например, –OH и –COOH) на поверхности PLA больше связаны с поверхностью нановолокна после обработки плазмой, а PANI морфология и кислородсодержащие функциональные группы работали вместе, чтобы обеспечить полное смачивание композитных нановолокон PANI / PLA [38, 39].

Угол контакта a Нановолокна PLA, b ПАНИ / ПЛА-ГА, c PANI / PLA-SA и d Композитные нановолокна ПАНИ / ПЛА-ПА

Спектры FTIR чистых композитных нановолокон PANI и PANI / PLA, легированных различными неорганическими кислотами, показаны на рис. 6. В спектре чистого легированного PANI (рис. 6a) сильные характеристические пики при 1565, 1485, 1298 и 1125 см ^-1 соответствуют C =C-растяжению хиноидных колец и C =C-растяжению, C-N-растяжению и =C-H-растяжению бензоидных колец соответственно. В спектре чистого легированного PANI (рис. 6b), помимо характерного пика PANI, также можно увидеть пик PLA (пики валентных колебаний C – O 1092 и 1184 см ⁻¹ , C =O пик валентных колебаний 1757 см ⁻¹ ). Эти результаты показывают, что PANI был успешно нанесен на поверхность нановолокон PANI / PLA, легированных неорганическими кислотами. Для дальнейшего исследования химического состава нановолокон PANI / PLA был использован XPS для анализа состава их поверхности. Кроме того, в XPS-спектрах (рис. 7а) в композитных нановолокнах ПАНИ / ПЛА видны четкие пики N1s при ~ 400 эВ. Более того, пики Cl2p были видны при ~ 200 эВ в PANI / PLA-HA и PANI / PLA-PA, в то время как интенсивность пика Cl2p с PANI / PLA-PA была выше, чем с PANI / PLA-HA. На XPS спектрах в PANI / PLA-SA появляется пик S2p при ~ 210 эВ. Спектры XPS показали, что Cl ^- , SO ₄ ^2– , и ClO ₄ ^- были легированы на соответствующие нановолокна ПАНИ / ПЛА. Кроме того, иминные атомы азота PANI были полностью или частично окислены с образованием ряда состояний окисления, сопровождаемых различной степенью протонирования. Изменения степени окисления и уровня протонирования ПАНИ измеряли по спектрам ядерных уровней N1s (рис. 7b – d). Каждый спектр N1s можно деконволютировать до четырех основных компонентов с энергиями связи приблизительно 398,7, 399,6, 400,4 и 401,8 эВ, которые можно отнести к хиноноидимину (–N =), бензоидамину (–NH -), протонированному амину (- N ⁺ ) и протонированный имин (=N ⁺ ) соответственно [40, 41]. Ссылаясь на исследование Кумара [42], на аппроксимирующий пик спектра N1s повлиял заряд анионов, связанных протонированными атомами азота, что привело к делокализации и небольшому сдвигу.

FTIR-спектры a ПАНИ, б Композитные нановолокна PLA и PANI / PLA

Спектры XPS ( a ) подготовленных композитных нановолоконных каркасов PANI / PLA и PANI / PLA-HA ( b ), PANI / PLA-SA ( c ) и ПАНИ / ПЛА-ПА ( d ) сигнала базового уровня N1s

В качестве матрицы для восстановления и регенерации тканей биоактивные каркасы разлагаются и выводятся из организма после индуцированного восстановления клеток и тканей [43]. В этой статье характеристики деградации каркасов из нановолокон были оценены с использованием метода потери массы, как показано на рис. 8. Потеря массы всех образцов увеличилась через 7, 14 и 21 день, а скорость потери массы PLA нановолокна составляли 4,34 ± 0,41%, 7,84 ± 1,57% и 12,65 ± 0,83% соответственно. Между тем, потеря массы композитных нановолокон ПАНИ / ПЛА-ПА постепенно увеличивалась после окислительной полимеризации in situ, со скоростью потери массы 31 ± 2,15%, 34 ± 1,86% и 40 ± 2,54% при 7, 14 и 21 день, соответственно, что было значительно больше, чем у нановолокон PANI / PLA-HA и PANI / PLA-SA. В процессе окислительной полимеризации PANI in situ присутствие окислителя APS могло разрушить сложноэфирную связь в PLA и вызвать реакцию гидролиза, приводящую к микротрещинам в нановолокнах PLA. По мере увеличения времени погружения в PBS микротрещины постепенно накапливались, и матрица PLA начала постепенно разрушаться. ПАНИ с поверхностной загрузкой также отвалился, что привело к снижению качества нановолокна. С увеличением времени коэффициент потери массы стал яснее. Здесь сильное окисление HClO ₄ усугубляет деградацию PLA и ускоряет потерю массы нановолокон PANI / PLA-PA, что согласуется с механическими свойствами, представленными на рис. 2.

Деградационные свойства нановолокон PLA и PANI / PLA

Биосовместимость биоактивных каркасов является основой для стимуляции клеточной адгезии, роста и пролиферации [44]. Здесь мы изучили пролиферацию клеток HOS на композитных нановолокнах PLA и PANI / PLA, чтобы проиллюстрировать сопутствующую адгезию и биосовместимость. Во время химической обработки и функционализации [45] ряд потенциальных влияющих факторов может вступить в игру при приготовлении биоактивных каркасов. Следовательно, изучение их биосовместимости является ключом к оценке их практического применения.

Чтобы исследовать биосовместимость композитных нановолокон PANI / PLA, их жизнеспособность была оценена с использованием метода МТТ. На рис. 9 показана активность клеток, инкубированных на композитных нановолокнах PLA и PANI / PLA через 1, 3 и 5 дней. Из рисунка ясно видно, что с увеличением времени инкубации активность клеток нановолокон постепенно возрастала; клетки PANI / PLA-PA показали лучшую активность, а активность клеток после пятидневного культивирования была самой высокой.

Жизнеспособность клеток HOS культивировали в течение 1, 3 и 5 дней на нановолокнах PLA и композитных нановолокнах PANI / PLA (* p <0,05; ** p <0,005)

PLA является биоразлагаемым, но гидрофобным, что означает, что он не способствует клеточной адгезии, росту и пролиферации. После плазменной обработки поверхность композитных нановолокон PANI / PLA была нагружена кислородсодержащими группами, и функциональная поверхность продемонстрировала хорошую гидрофильность. Приведенная выше морфология и результаты АСМ показывают, что PANI, легированный различными неорганическими кислотами, проявлял разные морфологии и уровни шероховатости на поверхности нановолокон PLA. Между тем, композитные нановолокна PANI / PLA показали отличную смачиваемость. Таким образом, мы сочли, что различная морфология PANI, легированного неорганическими кислотами, приводит к увеличению поверхностной энергии и полярности композитных нановолокон PANI / PLA, что, следовательно, влияет на рост, миграцию и пролиферацию клеток, что приводит к улучшенным характеристикам в терминах. активности клеток [46].

Для дальнейшего изучения клеточного поведения композитных нановолокон PANI / PLA рост и адгезию на нановолокнах наблюдали с помощью флуоресцентного иммуноокрашивания (рис. 10) и SEM (рис. 11). Здесь мы сравнили актин и морфологию клеток на поверхности различных нановолокон. Когда клетки росли на волокнах PLA и нановолокнах PANI / PLA, пучки актина демонстрировали хорошее состояние растяжения. Между тем, плотность клеток композитных нановолокон PANI / PLA была выше, чем у нановолокон PLA контрольной группы, с плотностью роста клеток в следующем порядке:PANI / PLA-PA> PANI / PLA-SA> PANI / PLA-HA. Клетки HOS росли на нановолокнах PANI / PLA и склеивались в плоской мультиполярной форме. Очевидно, что многие клетки были встроены в поры волокон PANI / PLA, но были плохо растянуты на нановолокнах PLA и не могли быть полностью расширены. These results indicate that PANI/PLA composite nanofibers could promote the adhesion and proliferation of HOS cells.

Fluorescence micrographic images on a PLA nanofibers, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA, and d PANI/PLA-PA composite nanofibers after the incubation of 24 h

SEM micrographs of HOS seeded on a PLA nanofibers, b PANI/PLA-HA, c PANI/PLA-SA, and d PANI/PLA-PA composite nanofibers after 24 h

Meanwhile, the cell immunofluorescence staining and cell adhesion results indicated that the different PANI morphologies on the surface of the PANI/PLA composite nanofibers affected the growth, adhesion, and proliferation of the HOS cells, which was consistent with the above results.

As an early osteogenic marker, the ALP test was conducted on PLA and PANI/PLA composite nanofibers scaffolds for 7 days. Compared to the pure PLA nanofibers, the result (Fig. 12) showed that the ALP activity was significantly improved in of PANI/PLA composite nanofibers. Obviously, the ALP activity of PANI/PLA-PA composite nanofibers is the best. These results proved that PANI/PLA composite nanofibers exhibited better biocompatible, which is consistent with the above results of cell adhesion, growth, and proliferation.

Alkaline phosphatase activity on PANI/PLA composite nanofibers scaffolds (ns = no significance)

Выводы

In this paper, PANI/PLA composite nanofibers of different surface morphologies were prepared by three types of inorganic acid as dopant in in situ polymerization. We confirmed that PANI could be successfully loaded on the surface of PLA without changing the porous structure of the nanofibers. The mechanical properties and in vitro degradation experiments demonstrated that oxidizing acids can significantly weaken the mechanical properties and accelerate the degradation of polyester nanofibers. Meanwhile, the rougher surface resulted in a better wettability and promoted the cells adhesion, growth, and proliferation, which indicated a better biocompatibility. In conclusion, the regulated PANI morphology via different acids doping has positive effect on biocompatibility in tissue engineering.

Доступность данных и материалов

Авторы заявляют, что материалы и данные доступны читателям в кратчайшие сроки без чрезмерных требований к соглашениям о передаче материалов. Все данные, полученные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в эту статью.

Сокращения

PANI:

Полианилин

PLA:

Polylactic acid

ECM:

Extracellular matrix

PPy:

Polypyrrole

PTH:

Polythiophene

AN:

Aniline

DCM:

Дихлорметан

DMF:

N , N -Диметилформамид

APS:

Персульфат аммония

HOS:

Human osteosarcoma cells

DMEM:

Среда Игла, модифицированная Дульбекко

PBS:

Фосфатный буферный раствор

MTT:

3–2,5-Diphenyl-2-H-tetrazolium bromide

FITC:

Флуоресцеина изотиоцианат

FTIR:

Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье

FE-SEM:

Автоэмиссионная сканирующая электронная микроскопия

XPS:

Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия

ALP:

Щелочная фосфатаза