Токсичность наночастиц золота у мышей из-за взаимодействия наночастиц и лекарств вызывает острое повреждение почек

Введение

Нанотехнологии играют все более важную роль в двадцать первом веке, а наноматериалы лежат в основе прогресса нанотехнологий. Последние разработки в области производства наночастиц способствовали использованию инновационных наноматериалов во всем мире [1, 2]. Наноматериалы имеют диаметр 100 нм или меньше, и примеры включают наночастицы золота, серебра, диоксида кремния, платины и диоксида титана, а также фуллерены и углеродные нанотрубки [3, 4]. Эти материалы могут найти применение в технологиях электронного хранения данных, генной / регенеративной медицине и электронных устройствах и являются основой новых отраслей в двадцать первом веке [5]. Однако наночастицы, такие как PM2,5, вызывают серьезное загрязнение окружающей среды, респираторные заболевания, такие как астма и ишемическая болезнь сердца [6]. Кроме того, частицы дизельного топлива, выбрасываемые автомобилями, могут иметь биологические эффекты, попадая в мозг и репродуктивные органы [7], тонкие волокнистые частицы, такие как асбест, вызывают мезотелиому, а промышленные волокнистые наноматериалы, такие как углеродные нанотрубки, могут отрицательно влиять на здоровье человека [8, 9]. Поэтому остается много неизвестного относительно биологических эффектов наночастиц.

Золото (Au) имеет низкую склонность к ионизации и высокую стабильность и с древних времен использовалось в качестве драгоценного металла в декоративных целях. Недавно разработанные наночастицы золота широко используются в медицине и технике благодаря своим характерным оптическим свойствам [10, 11], а их превосходные оптоэлектронные свойства привели к их использованию в органических солнечных элементах, сенсорных датчиках и проводящих материалах [12, 13]. . Наночастицы золота используются в химической промышленности в качестве катализаторов синтеза акриловой смолы. Они также демонстрируют превосходную низкотемпературную каталитическую активность по окислению CO по сравнению с наночастицами платины, что позволяет использовать их в качестве катализаторов очистки выхлопных газов. В будущем ожидается дальнейшее применение наночастиц золота, однако исследований токсичности наночастиц золота и их потенциального взаимодействия с лекарствами мало.

Область нанотехнологий расширяется, поскольку исследователи исследуют безопасность, фармакологию и фармакокинетику наночастиц. Было показано, что наночастицы кремнезема вызывают цитотоксичность, гепатотоксичность и повреждение плаценты [14, 15], а углеродные нанотрубки могут вызывать мезотелиому легких [16]. Однако мало что известно о фармакологических эффектах, возникающих в результате взаимодействия наночастиц и лекарств. В этом исследовании мы исследовали токсичность золотых частиц диаметром 10, 50 и 100 нм (GnP10, GnP50 и GnP100 соответственно) на мышах, чтобы выяснить их безопасность для млекопитающих. Кроме того, мы исследовали влияние этих наночастиц на токсичность параквата (PQ, хорошо известный гепатотоксин и нефротоксин) [17], цисплатина (CDDP, широко используемое противоопухолевое средство) [18, 19] и 5-аминосалициловой кислоты. кислота (5-АСК, обычное противовоспалительное средство) [20].

Результаты и обсуждение

Сначала мы измерили размер частиц наночастиц золота с помощью Zetasizer, затем наблюдали частицы с помощью просвечивающей электронной микроскопии (рис. 1a, b, c). Средний диаметр наночастиц GnP10, GnP50 и GnP100 составлял 15,7 ± 7,0, 53,3 ± 14,2 и 97,0 ± 27,1 нм соответственно (дополнительный рисунок 1). Более того, наночастицы золота агрегируются при измерении с помощью электронной микроскопии, но не агрегируются при введении мышам. Кроме того, мы измерили концентрацию ионов золота с помощью ICP-MS, но никаких ионов обнаружено не было (данные не показаны). Поверхность наночастиц золота была модифицирована лимонной кислотой для увеличения сродства наночастиц к воде, но эта модификация не показала никакой другой функциональности.

Ультраструктура наночастиц золота. Электронные микрофотографии GnP10 ( a ), GnP50 ( b ) и GnP100 ( c ) наночастицы

Мы исследовали, проявляет ли ЗНЧ гепатотоксичность и нефротоксичность, вводя мышам максимальную дозу 4 мг / кг через хвостовую вену. При введении только наночастиц золота не наблюдалось гепатотоксичности или нефротоксичности (рис. 2). Значения ALT и AST у мышей, которым вводили только GnP10, 50 и 100 (рис. 2a, b), были аналогичны контрольным значениям, как и значения BUN и Cr. Однократное введение ЗНЧ мышам не вызывало повреждения печени или почек, сердца, легких или селезенки (дополнительный рис. 2), что указывает на то, что наночастицы золота нетоксичны при введении мышам в чистом виде.

Влияние наночастиц золота на цисплатин-индуцированную токсичность. Мышам внутрибрюшинно вводили цисплатин (CDDP) в концентрации 0 (светлые столбцы) или 100 мкмоль / кг (сплошные столбцы) вместе с внутривенной инъекцией носителя или наночастиц золота (4 мг / кг). Через 24 часа после инъекции сывороточные уровни ферментов печени аланинаминотрансферазы (ALT; панель a ) и аспартатаминотрансферазы (AST; панель b ) и уровни азота мочевины в плазме крови (BUN; панель c ) и креатинин (Cr; панель d ) были определены с использованием имеющихся в продаже наборов (см. раздел «Биохимические анализы»). Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM; n =4). Значительная разница (* P <0,05, ** P <0,01) между группами, получавшими наполнитель и CDDP

Сообщалось, что повреждение печени и почек вызывается совместным введением наночастиц диоксида кремния, наночастиц или наночастиц полистирола с лекарствами или химическими веществами [14, 21, 22]. Поэтому мы вводили наночастицы золота совместно с PQ (токсином печени и почек) или препаратами CDDP или 5-ASA (которые вызывают неблагоприятные нефротоксические эффекты для печени). На рис. 2 показаны результаты взаимодействия наночастиц золота с CDDP. Совместное введение GnP10 или GnP50 и CDDP увеличивало ALT и индуцировало повреждение печени (фиг. 2a), а совместное введение GnP10 и CDDP увеличивало BUN и Cr, вызывая повреждение почек (фиг. 2c, d). Затем мы исследовали взаимодействие между GnP и 5-ASA, широко используемым противовоспалительным препаратом, который вызывает повреждение печени и почек. Совместное введение GnP10 или GnP50 с CDDP увеличивало ALT и индуцировало повреждение печени (фиг. 3a), тогда как совместное введение с 5-ASA увеличивало BUN и Cr и индуцировало повреждение почек (фиг. 3c, d). Затем мы исследовали взаимодействие между GnP и PQ, широко используемым агрохимикатом, который вызывает повреждение печени и почек. Совместное введение GnP10 и PQ увеличивало уровни BUN и Cr и вызывало повреждение почек (рис. 4c, d), но не повреждение печени (рис. 4a, b). Совместное введение мельчайших протестированных частиц золота, GnP10, с CDDP, 5-ASA или PQ привело к самым высоким значениям ALT, BUN и Cr, наблюдаемым в этом исследовании. Частицы GnP100 в 10 раз больше не вызывали повреждения печени или почек при совместном введении с CDDP, 5-ASA или PQ. Эти результаты показывают, что ЗНЧ токсичен, когда частицы диаметром менее 100 нм вводятся совместно с CDDP, 5-ASA или PQ.

Влияние наночастиц золота на токсичность, вызванную 5-аминосалициловой кислотой. Мышам внутрибрюшинно вводили 5-аминосалициловую кислоту (5-ASA) в дозе 0 (светлые столбцы) или 500 мг / кг (сплошные столбцы) вместе с внутривенной инъекцией носителя или наночастиц золота (4 мг / кг). Через 24 часа после инъекции сывороточные уровни ферментов печени аланинаминотрансферазы (ALT; a ) и аспартатаминотрансферазы (AST; B), а также уровни азота мочевины в плазме крови (BUN; c ) и креатинин (Cr; d ) были определены с использованием имеющихся в продаже наборов (см. раздел «Биохимические анализы»). Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM; n =4). Значительная разница (* P <0,05, ** P <0,01) между группами, получавшими носитель и 5-АСК

Влияние наночастиц золота на токсичность, вызванную паракватом. Мышам внутрибрюшинно вводили паракват (PQ) в дозе 0 (светлые столбцы) или 50 мг / кг (сплошные столбцы) вместе с внутривенной инъекцией носителя или наночастиц золота (4 мг / кг). Через 24 часа после инъекции сывороточные уровни ферментов печени аланинаминотрансферазы (ALT; a ) и аспартатаминотрансферазы (AST; b ) и уровень азота мочевины в плазме крови (BUN; c ) и креатинин (Cr; d ) были определены с использованием имеющихся в продаже наборов (см. раздел «Биохимические анализы»). Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM; n =4). Значительная разница (* P <0,05, ** P <0,01) между группами, получавшими наполнитель и PQ

Наблюдение за почечным гематоксилином и эозином после совместного введения GnP10 с CDDP, 5-ASA или PQ (рис. 5) показало повреждение канальцев, что свидетельствует об индукции острого повреждения почек. Затем мы измерили IL-6 и TNF-α в сыворотке, чтобы исследовать основную причину острого повреждения почек, вызванного GnP10. На Фигуре 6 показаны уровни IL-6 в сыворотке через 3 часа после совместного введения GnP10 с CDDP, 5-ASA или PQ. IL-6 не был обнаружен в группе, получавшей только GnP10, но увеличение IL-6 наблюдалось при совместном введении GnP10 с CDDP, 5-ASA или PQ. TNF-α не был обнаружен ни в одной группе (данные не показаны). Эти результаты предполагают, что IL-6 участвует в остром повреждении почек, вызванном GnP10 и CDDP, 5-ASA или PQ.

Гистологический анализ тканей почек мышей, обработанных наночастицами золота. Через 24 часа после внутривенного введения только GnP10 ( a ), GnP10 с CDDP ( b ), GnP10 с 5-ASA ( c ) и GnP10 с PQ ( d ), ткани собирали, фиксировали 4% параформальдегидом, делали срезы и окрашивали гематоксилином и эозином. Стрелками обозначены участки поражения почек

Уровни IL-6 в сыворотке, измеренные с помощью ELISA. Мыши получали внутривенную инъекцию GnP10 с CDDP, 5-ASA или PQ. Уровни цитокинов измеряли через 3 часа после введения. Значения представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка (SE; n =4)

Мы исследовали влияние совместного введения наночастиц золота и лекарств на побочные эффекты (например, повреждение печени и почек). Наименьший размер частиц, GnP10, вызывал повреждение почек и печени при совместном введении с CDDP, 5-ASA или PQ. Мы также вводили GnP10 совместно с ацетаминофеном, стрептомицином или тетрациклином мышам и не наблюдали повреждения печени или почек (данные не показаны). Ранее мы сообщали, что наночастицы кремнезема вызывают повреждение печени в зависимости от размера частиц [23], а наночастицы полистирола могут вызывать повреждение печени при совместном введении с лекарством в зависимости от размера частиц [24]. Xia et al. сообщили, что более мелкие наночастицы золота более генотоксичны in vitro [25]. Взятые вместе, наночастицы золота становятся высокотоксичными из-за взаимодействия с лекарствами, поскольку размер частиц уменьшается.

Совместное введение Gnp10 с цисплатином, 5-ASA или PQ увеличивало уровни IL-6 (рис. 6). Уровень IL-6 не повышался только при введении GnP10 (фиг. 6) или при введении только CDDP, PQ или 5-ASA (данные не показаны). Ранее сообщалось, что IL-6 участвует в индукции поражения печени [26] и острых почек [27, 28]. Мы полагаем, что Gnp10 индуцирует IL-6, который, в свою очередь, вызывает повреждение печени и почек, но основной механизм остается неясным. Бауза и др. сообщают, что IL-6 вызывает повреждение печени, индуцируя факторы транскрипции в гепатоцитах [29]. Понимание участия клеточно-специфических факторов транскрипции в индуцированном ИЛ-6 повреждении печени и почек потребует дальнейших экспериментов по изучению механизма цитотоксичности наночастиц золота.

В последнее время наночастицы золота привлекли внимание как функциональный биоматериал, используемый в системах доставки лекарств [30], и активно проводятся исследования по лечению рака с использованием наночастиц золота. Например, Ансельмо и др. сообщили, что наночастицы диоксида кремния и золота, покрытые полиэтиленгликолем, увеличивают локальную температуру при поглощении света и термически растворенных твердых опухолях [31], показывая, что наночастицы золота являются многообещающим материалом для лечения рака. Однако мы обнаружили, что взаимодействие между противораковым препаратом цисплатином и наночастицами золота вызывает повреждение почек (рис. 2), предполагая, что использование наночастиц золота при лечении рака требует изучения их безопасности при совместном применении с препаратом.

Выводы

Таким образом, Gnp10 вызывал повреждение почек при совместном введении с CDDP, PQ или 5-ASA. GnP50 вызывал повреждение почек только при совместном введении с 5-ASA, тогда как GnP100 - нет. Мы продемонстрировали, что наночастицы золота могут вызывать повреждение почек и что этот эффект может синергетически усугубляться в результате взаимодействия с химическими веществами или лекарствами. Для полного выяснения токсикологических профилей наночастиц, предлагаемых для диагностического или терапевтического использования, потребуются дальнейшие исследования, основанные на этих данных.

Материалы и методы

Материалы

Суспензии покрытых цитрат-лигандом золотых частиц диаметром 10, 50 и 100 нм были получены от NANOCOMPOSIX, INC. (Сан-Диего, Калифорния, США). Распределение частиц по размерам анализировали с использованием Zetasizer (Sysmex Co., Кобе, Япония) и просвечивающего электронного микроскопа TEM JEOL JEM-1011. Средние диаметры составляли 15,7 ± 7,0, 53,3 ± 14,2 и 87,0 ± 27,1 нм (рис. 1, дополнительный рис. 1). Водные суспензии (1 мг / мл) перед использованием тщательно диспергировали ультразвуком и разбавляли водой. Присутствие ионизированного золота в суспензиях наночастиц золота было исследовано с помощью ICP-MS, и ионизированное золото не было обнаружено. Идентичные объемы каждой суспензии вводили мышам для каждого эксперимента. Геометрические размеры частиц охарактеризованы методом просвечивающей электронной микроскопии. Паракват (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США), цисплатин и 5-аминосалициловая кислота (Wako Pure Chemical Industries, Осака, Япония) растворяли в физиологическом растворе и хранили при -20 ° C до использования. Все реагенты были исследовательского класса.

Животные

Восьминедельных мышей-самцов BALB / c были приобретены у Funabashi Farm Co., Ltd. (Чиба, Япония). Животных содержали в контролируемой среде (температура 23 ± 1,5 ° C; световой 12-часовой цикл свет / темнота) со свободным доступом к стандартному корму для грызунов и воде. Перед началом экспериментов мышам давали 1 неделю на акклиматизацию. Протоколы экспериментов соответствовали этическим принципам Высшей школы фармацевтических наук Университета Тэйкё Хэйсэй, составленным на основе Руководства по экспериментам на животных Японской ассоциации наук о лабораторных животных.

Биохимические анализы

Аланинаминотрансферазу (ALT) в сыворотке крови, аспартатаминотрансферазу (AST) в крови, азот мочевины крови (BUN) и креатинин (Cr) измеряли с использованием имеющихся в продаже наборов (Wako Pure Chemical Industries) в соответствии с протоколами производителя. Вкратце, собранную сыворотку (10 мл) объединяли с 1 мл цветного реагента А (содержащего уреазу) и инкубировали при 37 ° C в течение 15 минут. После добавления 1 мл реагента цвета B образец инкубировали при 37 ° C в течение 10 мин. Поглощение измеряли на длине волны 570 нм. Интерлейкин (IL) -6 и TNF-α анализировали с использованием набора для твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) (BioSource International, CA, США). Все анализы проводились в строгом соответствии с инструкциями производителя.

Гистологический анализ

Через 24 ч после введения дозы животных умерщвляли, удаляли печень и фиксировали 4% параформальдегидом. После обработки и разделения тонкие срезы тканей окрашивали гематоксилином и эозином для гистологического исследования.

Статистический анализ

Статистический анализ проводился с помощью дополнительных форм Statcel, 3rd Excel Software (EMS Publication Co., Ltd., Сайтама, Япония). Все данные представлены как средние значения ± стандартная ошибка среднего (SEM). Достоверные различия между контрольной и экспериментальной группами определяли с помощью теста Даннета; а P значение менее 0,05 считалось значимым.

Доступность данных и материалов

Не применимо.

Сокращения

ALT:

Аланинаминотрансфераза

AST:

Аспартатаминотрансфераза

BUN:

Азот мочевины крови

PQ:

Паракват

Cr:

Креатинин