pH- и акустико-чувствительные платформы на основе перфторпентановых белковых наночастиц для ультразвуковой визуализации и терапии опухолей яичников

Введение

Рак яичников - один из самых смертоносных онкологических заболеваний у женщин во всем мире [1,2,3]. Лечение рака яичников остается клинически зависимым от лучевой терапии, химиотерапии, хирургии и других вспомогательных методов лечения [4,5,6]. Однако недостатки этих стратегий продолжают препятствовать повышению выживаемости пациентов. Чтобы преодолеть эти недостатки, необходимы более эффективные и безопасные методы диагностики. В последние годы интеграция визуализации и терапии в единую лечебную платформу стала горячей темой [7,8,9].

Ультразвуковая технология (УЗИ) благодаря ее неинвазивным, неизлучающим, недорогим и особым характеристикам широко используется в клинической диагностике и лечении опухолей [10,11,12]. В последние десятилетия была разработана платформа акустического ответа (ARP) с УЗИ и терапевтическими возможностями для эффективной диагностики и лечения опухолей [13,14,15,16]. ARP в основном включает микропузырьки или нанопузырьки (MB или NB) и платформы на основе наночастиц (NP) [16, 17]. Среди этих ARP MB или NB демонстрируют хорошие возможности акустического отклика, но из-за их большого размера проникновение в ткани in vivo является слабым, а стабильность образца оставляет желать лучшего. NP демонстрирует более высокую проницаемость тканей и более длительный фармакокинетический цикл из-за своего небольшого размера. Однако возможности акустического отклика НЧ ограничены. Поэтому очень важно разрабатывать ARP небольшого размера, с высокой стабильностью и быстрым откликом.

Жидкие фторуглероды претерпевают фазовый переход жидкая фаза в газ в ответ на внешнее воздействие [18, 19]. Наталья и ее коллеги разработали наноэмульсию, содержащую жидкий фторуглерод, которая создавала эффект акустического испарения капель (ADV) под действием сфокусированного ультразвука низкой интенсивности (LIFU) [20,21,22]. Эмульсии образовывали пузырьки и одновременно запускали высвобождение лекарства, что позволяло лечить опухоль. Однако слой герметизирующего материала, обернутый вокруг жидкого фторуглерода, привел к увеличению интенсивности и времени ультразвука, необходимого для лечения опухоли, что привело к повреждению окружающей здоровой ткани. Поэтому необходима дальнейшая оптимизация жидкого фторуглеродного носителя.

В этом исследовании мы разработали наночастицы ферритина (FRT), наполненные жидким фторуглеродным перфторпентаном (PFP), который затем был объединен с фолиевой кислотой (FA), целевой молекулой опухоли, с образованием FA-FRT-PFP. Ферритин является эндогенным белком наноклеток с высокой биосовместимостью, который проявляет чувствительность к pH [23,24,25]. Белок может разбираться в кислой среде и может быть повторно собран в щелочной среде. Это позволяет контролировать загрузку и высвобождение ферритина в ответ на изменение pH [26,27,28]. ПФП - часто используемый материал с фазовым превращением, температура кипения которого составляет 29 ^o . C. Низкая температура кипения способствовала легкому фазовому превращению с помощью LIFU, что было безопаснее, чем HIFU. PFP загружали в ферритин, и полученный FA-FRT-PFP имел диаметр ~ 47,3 ± 2,8 нм с высокой стабильностью при физиологических растворах и температурах. Согласно результатам, FA-FRT-PFP имел следующие преимущества:(1) PFP можно было легко загрузить в FRT, изменяя pH с кислого на нейтральный; (2) под сфокусированным ультразвуком низкой интенсивности (LIFU, 2 Вт / см ² , 3 мин) и pH =5,0, FA-FRT-PFP высвобождает PFP и претерпевает фазовые изменения для усиления сигналов ультразвуковой визуализации посредством акустического испарения капель (ADV); 3) При длительном облучении LIFU (4 мин) и pH =5,0 PFP, высвобожденный из FA-FRT-PFP, взорвался и произвел физическую ударную волну, которая могла эффективно разрушать опухолевые клетки посредством некроза. Насколько нам известно, это первый пример загрузки PFP в FRT в качестве ультразвуковой диагностики опухоли. Эти результаты показывают, что FA-FRT-PFP + LIFU - это новая стратегия комплексной диагностики и лечения опухолей.

Материалы и методы

Материалы

Агарозный гель, ферритин (FRT), фолиевая кислота (FA) и перфторпентан (C ₃ F ₈ , PFP) были приобретены у Sigma (Сент-Луис, Миссури, США). NH ₂ -ПЭГ ₂₀₀₀ -FA и NH ₂ -ПЭГ ₂₀₀₀ -COOH были поставлены компанией Xi’an Ruixi Biotechnology Co., Ltd. (Китай). 1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимид (EDC) и N-гидроксисукцинимид (NHS) были приобретены в Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Набор для подсчета клеток 8 (CCK-8) был получен от Dojindo Laboratories (Кумамото, Япония). Среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM), фосфатно-солевой буфер (PBS), пенициллин-стрептомицин, трипсин-EDTA и фетальная бычья сыворотка (FBS) были приобретены у Gibco (Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США).

Культура клеток

Клеточная линия рака яичников человека SK-OV-3 была предоставлена ​​Шанхайским институтом клеточной биологии Китайской академии наук. Нормальные эпителиальные клетки яичников HUM-CELL-0088 были получены от PriCells, Ухань, Китай. Клетки культивировали в среде DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки и 1% раствор пенициллина-стрептомицина. Клетки содержали в инкубаторе с увлажненной атмосферой, содержащей 5% CO ₂ . при 37 ° С.

Подготовка FA-FRT-PFP

Во-первых, молекула-мишень FA была конъюгирована с FRT посредством реакции этерификации [29]. Вкратце, NH ₂ -ПЭГ ₂₀₀₀ -FA (10 мг) и раствор FRT смешивали с присутствием EDC (5 мг / мл) и NHS (20 мг / мл). Через 3 часа реакции при комнатной температуре при легком перемешивании смесь очищали диализом против дистиллированной воды (пороговая молекулярная масса =1,2 кДа) в течение 24 часов. Полученный раствор представлял собой наночастицы FA-FRT. Во-вторых, загрузка PFP в полость FRT была приготовлена ​​в процессе денатурации и ренатурации белка [30]. Вкратце, FA-FRT разбавляли 5 мл PBS до 2 мг / мл и доводили до pH =5,0 с помощью 30-минутного легкого перемешивания при комнатной температуре для обеспечения полной диссоциации FRT. После этого к раствору на ледяной бане добавляли 500 мкл PFP и подвергали импульсной обработке ультразвуком с 5-секундным включением и 5-секундной паузой в течение всего 5 минут при 80 Вт на ледяной бане. После обработки ультразвуком значение pH смеси доводили до нейтрального (pH =7,4). Поскольку PFP находился в масляном состоянии и не растворялся в воде, избыточный PFP легко удалялся разделением жидкости и превращался в FA-FRT-PFP. FRT-PFP был приготовлен аналогичным методом, за исключением замены NH ₂ -ПЭГ ₂₀₀₀ -FA в NH ₂ -ПЭГ ₂₀₀₀ -COOH.

Характеристика FA-FRT-PFP

Размеры и дзета-потенциалы наночастиц были проверены с помощью Zeta Sizer (Malvern, NanoZS, UK). Морфологию FA-FRT-PFP наблюдали с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ, Hitachi, Япония) и инвертированной флуоресцентной микроскопии (Olympus, Япония). Химическая структура наночастиц была обнаружена с помощью инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (Bruker Tensor 27, Bruker Optik, Эттлинген, Германия). Поглощение клетками FA-FRT-PFP было обнаружено с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (LEXT OLS4100, Olympus, Япония). Клетки с двойным окрашиванием FITC / PI анализировали методом проточной цитометрии (BD, Франклин Лейкс, Нью-Джерси, США).

Эффективность генерирования газа в ответ на pH и ультразвук

FA-FRT-PFP в условиях pH =5,0 и 7,5 облучали с различной акустической интенсивностью LIFU (1,5 и 2,0 Вт / см ² ) и для разного общего времени (1, 2, 3 и 4 мин) в модели агарозного геля, затем изображения УЗИ наблюдали с помощью американского оборудования (Esaote Mylab 90, Италия) с частотой 5–12 МГц и механическим индексом ( MI) 0,06. После этого появление FA-FRT-PFP наблюдали с помощью световой микроскопии во времени. Интенсивность США в интересующей области на американском изображении была проанализирована с помощью программного обеспечения ImageJ.

Использование сотовой связи

Вкратце, 1 мг FITC растворяли в 1 мл ДМСО, а затем смешивали с FRT-PFP и FA-FRT-PFP в течение 30 минут при осторожном перемешивании. Затем смешанный раствор диализовали в течение ночи в деионизированной воде для удаления свободных FITC и ДМСО с получением наночастиц, меченных FITC. Затем клетки SK-OV-3 и нормальные клетки яичников (HUM-CELL-0088) культивировали в среде в течение 24 часов, а затем свободные FITC, FITC-меченные FRT-PFP и FA-FRT-PFP совместно инкубировали с Ячейки СК-ОВ-3 на 5 ч. Кроме того, FITC-меченный FA-FRT-PFP инкубировали с предварительно обработанными FA клетками SK-OV-3 в течение 5 часов. Клетки промывали 3 раза PBS, фиксировали 4% параформальдегидом и окрашивали 0,2 мг / мл раствора DAPI в течение 10 мин. Клетки визуализировали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии для получения флуоресцентных изображений. Сигнал флуоресценции количественно определяли с помощью проточного цитометра.

Ультразвуковая визуализация in vitro

Клетки SK-OV-3 культивировали в течение 24 часов в среде без FA, а затем PBS, FRT-PFP и FA-FRT-PFP и FA-FRT-PFP + FA инкубировали с клетками SK-OV-3 в течение 6 ч. Клетки собирали и смешивали с агарозным гелем, а затем клетки облучали с LIFU или без него в течение 3 минут (1 с и пауза 1 с в общей сложности 3 минуты; 1 МГц; 2,0 Вт / см 2. ). Наконец-то были сделаны снимки из США.

Противораковая эффективность in vitro

Клетки SK-OV-3 высевали в 96-луночный планшет при плотности 1 × 10 ⁴ . клеток / лунку, и позволили прикрепиться в течение 24 часов. Для определения цитотоксичности FA-FRT различные концентрации (0, 20, 40, 100, 200 и 500 мкг / мл) FA-FRT культивировали с клетками SK-OV-3. После 24-часовой обработки клетки обрабатывали средой DMEM, содержащей 10% CCK-8, в течение 20 минут в инкубаторе. Поглощение клеток при длине волны 450 нм определяли с помощью многорежимного считывателя планшетов (Thermo Scientific) для характеристики жизнеспособности клеток. Кроме того, клетки SK-OV-3 и нормальные клетки яичников (HUM-CELL-0088) обрабатывали PBS, FRT-PFP и FA-FRT-PFP и FA-FRT-PFP + FA в течение 3 часов, а затем обрабатывали. облучение LIFU (1 с с паузой 1 с, всего 4 мин; 1 МГц; 2,0 Вт / см ² ). Обработанные клетки инкубировали еще 21 час. В качестве контроля без LIFU клетки обрабатывали PBS, FRT-PFP и FA-FRT-PFP и FA-FRT-PFP + FA в течение 24 часов. После этого жизнеспособность обработанных клеток определяли с помощью анализа CCK-8.

Анализ гибели клеток

Чтобы оценить тип гибели клеток, клетки SK-OV-3 высевали в 6-луночные планшеты с плотностью 5 × 10 ⁴ . клеток / мл. Через 24 часа клетки обрабатывали PBS, FRT-PFP и FA-FRT-PFP и FA-FRT-PFP + FA в течение 3 часов, затем облучали LIFU (1 с, пауза в течение 1 с, всего 4 мин; 1 МГц; 2,0 Вт / см ² ). Обработанные клетки инкубировали еще 23 часа. В качестве контроля клетки обрабатывали PBS, FRT-PFP, FA-FRT-PFP и FA-FRT-PFP + FA в течение 24 ч в отсутствие LIFU. Клетки трипсинизировали, центрифугировали при 1500 × g в течение 3 мин, промывали 3 раза ледяным PBS, а затем ресуспендировали в 200 мл связывающего буфера. После этого добавляли 5 мкл аннексина V-FITC и 10 мкл PI и инкубировали с клетками в течение 15 мин в темноте. Окрашенные клетки анализировали с помощью проточного цитометра.

Вестерн-блоттинг

Вестерн-блоттинг проводился в соответствии с предыдущей литературой. Клетки обрабатывали 40 мкг / мл PBS (контроль), FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA и FA-FRT-PFP в сочетании с облучением LIFU или без него (2,0 Вт / см 2 , 4 мин) и дальнейшая инкубация 21 ч. Затем обработанные клетки лизировали в буфере RIPA (Sigma). Пятьдесят микрограммов каждого белка с буфером для образцов Лэммли кипятили в течение 5 минут и подвергали SDS-PAGE. Белки переносили на PVDF-мембрану (Bio-Rad Laboratories) с помощью полусухого транс-блоттинга (Bio-Rad Laboratories). Блоты сначала инкубировали в блокирующем буфере TBS, содержащем либо 2% молока, либо 2% BSA (для фосфоспецифических антител), в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем с соответствующими первичными антителами, разведенными в TBST (содержащем 0,1% Tween20 и 2% BSA). в течение ночи при 4 ° C. Затем блоты промывали и инкубировали с соответствующими вторичными антителами (Santa Cruz) в TBST и детектировали с использованием хемилюминесцентного субстрата SuperSignal West Pico (Thermo).

Статистический анализ

Все данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Статистический анализ проводился с использованием t-критерия Стьюдента. * P <0,05, ** P <0,01 считались статистически значимыми.

Результаты и обсуждение

Приготовление и характеристика FA-FRT-PFP

FA-FRT-PFP был синтезирован и использован для терапии опухолей (рис. 1). Капли с фазовым превращением загружали в FRT посредством индуцированной pH обратимой разборки и повторной сборки FRT. PFP с LIFU-индуцированным испарением акустических капель (ADV) доставляли в клетки и действовали как агент ультразвуковой визуализации. На рис. 2а – с показаны ПЭМ-изображения FRT, FRT-PFP и FA-FRT-PFP, которые имели сферическую морфологию. Средний размер частиц FRT, FRT-PFP и FA-FRT-PFP составлял 6,9 ± 0,3 нм, 43,8 ± 1,6 нм и 47,3 ± 2,8 нм, соответственно (рис. 2d), демонстрируя, что загрузка PFP и конъюгация FA увеличивали размер FRT. Средний дзета-потенциал FRT и FA-FRT-PFP составлял - 43,2 ± 3,1 мВ, - 46,9 ± 2,2 мВ и - 41,5 ± 2,7 мВ, соответственно (рис. 2e). Более того, конъюгация FA с FRT была охарактеризована с помощью FT-IR, как показано в Дополнительном файле 1:Рисунок S1. В ИК-Фурье-спектре наблюдались полосы поглощения при ~ 1110 см ^-1 . может соответствовать колебательной C – O – C эфирной связи ПЭГ; пики поглощения при ~ 1601 см ⁻¹ и ~ 1710 см ⁻¹ принадлежат колебательным связям C =O от PEG и FRT, а также от –COOH и –CONH ₂ FA и FRT; полосы на ~ 2820 см ⁻¹ , ~ 2920 см ⁻¹ , и ~ 2950 см ⁻¹ соответствуют асимметричным и симметричным C – H валентным колебаниям –CH ₂ ФА и ПЭГ; пики поглощения при ~ 1440 см ⁻¹ связаны с фенильным кольцом FA. Результат подтверждает успешное конъюгацию FA с FRT. В течение 28 дней хранения размер и PDI FA-FRT-PFP в воде, PBS, физиологическом растворе и FBS не претерпели значительных изменений (фиг. 3a, b), что указывает на то, что FA-FRT-PFP демонстрирует превосходную стабильность. На рисунке 3c показано изменение размера FA-FRT-PFP при различных температурах от 25 ^o C до 45 ^o C. Размер FA-FRT-PFP практически не изменился при снижении температуры до 25-40 ° C, что указывает на то, что FA-FRT-PFP показывает высокую стабильность ниже 40 ^o Когда температура достигла 45 ° C, размер FA-FRT-PFP варьировался от 42,1 нм до 6 нм, вероятно, из-за того, что PFP в FA-FRT-PFP подвергается сильной газификации, приводящей к разрыву наночастиц. Температура газификации FA-FRT-PFP увеличена с 29 ^o . C (температура газификации ТНД при нормальном давлении) до 45 ^o C, вероятно, из-за покрытия оболочки FRT [21, 31,32,33].

Схематическое изображение синтеза FA-FRT-PFP и его применения в тераностике опухолей

а - c ПЭМ-изображения FRT, FRT-PFP и FA-FRT-PFP. г , e Распределение размера и дзета-потенциала FRT, FRT-PFP и FA-FRT-PFP

а , b Изменение размера и PDI FA-FRT-PFP в воде, PBS, физиологическом растворе и FBS в течение 28 дней. c Изменение размера FA-FRT-PFP при различной температуре от 25 ^o C до 45 ^o C

Повышение уровня pH и LIFU в США

Фантомные эксперименты с FA-FRT-PFP в США проводили при различных значениях pH и интенсивности LIFU. Как показано на рис. 4а, в отсутствие облучения LIFU (до) сигнал УЗИ был слабым во всех группах. При pH 7,5 после 3 мин облучения LIFU FA-FRT-PFP показал низкий сигнал УЗИ при 1,5 и 2,0 Вт / см ² , тогда как при pH =5,0 при том же времени облучения LIFU FA-FRT-PFP имел более сильную интенсивность сигнала УЗИ. Это продемонстрировало, что FA-FRT-PFP продемонстрировал эффекты ADV, зависящие от времени и интенсивности звука. Это произошло потому, что при pH =5,0 FA-FRT-PFP разобрался и высвободил PFP, что облегчило фазовое превращение. Интересно, что когда время облучения LIFU было увеличено до 4 минут, FA-FRT-PFP при pH =5,0 и 2,0 Вт / см ² LIFU имел более слабую интенсивность сигнала УЗИ по сравнению с сигналом при более низком времени облучения, вероятно, из-за того, что LIFU в этом состоянии слишком сильный, что вызывает разрыв пузырьков. Эти результаты показали, что FA-FRT-PFP может выделять PFP, вызывая фазовые превращения и взрыв при 2,0 Вт / см ² облучения LIFU при pH =5,0. Результаты УЗИ интенсивности показаны на рис. 4б, в. На рис. 4d – g показана морфология растворов FA-FRT-PFP после 3 мин облучения LIFU (2,0 Вт / см ² ) и при pH =7,5 и 5,0. FA-FRT-PFP при pH =5,0 и 2,0 Вт / см ² LIFU образовал большие пузыри, что еще раз подтвердило наши выводы.

а УЗ-изображения FA-FRT-PFP, смешанного с агарозным гелем при различных значениях pH и облученного различными интенсивностями мощности LIFU. б , c Соответствующие статистические данные сигнала США в a . г - г Изображения оптической микроскопии FA-FRT-PFP, смешанного с агарозным гелем при различных значениях pH и облученного мощностью 2,0 Вт / см ² на 3 мин.

Поглощение ячеек

На рис. 5 показана способность поглощения FA-FRT-PFP клетками. Клетки, обработанные свободным FITC, демонстрировали незначительную флуоресценцию, но после мечения на FA-FRT-PFP был очевиден сильный сигнал флуоресценции, указывающий на то, что FA-FRT-PFP обладает сильной способностью захватывать клетки. Обработанные FRT-PFP и обработанные FA-FRT-PFP клетки, предварительно инкубированные с FA, показали более слабую флуоресценцию FITC. Это дополнительно продемонстрировало, что FA усиливает активное нацеливание наночастиц. Кроме того, FA-FRT-PFP демонстрировал поведение поглощения, сравнимое с FCM (рис. 5c, d). Скорость поглощения FA-FRT-PFP составляла 46,5 ± 2,8%, что было значительно выше, чем у свободных FITC (контроль), FRT-PFP и FA-FRT-PFP + FA. Кроме того, Дополнительный файл 1:Рисунок S2 показывает клеточное поглощение наночастиц в нормальных клетках яичников. Нет значительных различий между группами FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA и FA-FRT-PFP в клеточном захвате. Вероятно, это связано с тем, что нормальные клетки яичников (HUM-CELL-0088) имеют низкую экспрессию рецепторов FA по сравнению с клетками SK-OV-3.

Клеточное поглощение. а , b Конфокальные флуоресцентные изображения клеток, обработанных свободным FITC и FITC-меченным FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA и FA-FRT-PFP. Зеленый и синий цвета представляют собой флуоресценцию FITC и DAPI соответственно. Масштабная линейка =25 мкм. c , d Сигнал флуоресценции FITC и соответствующие статистические данные внутри клеток, обработанных свободным FITC и FITC-меченным FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA и FA-FRT-PFP

Ультразвуковая визуализация in vitro

Для подтверждения того, что FA-FRT-PFP улучшает ультразвуковое изображение с помощью ADV in vitro, наночастицы инкубировали с клетками в течение 5 часов и облучали с LIFU или без него (2,0 Вт / см ² ). Как показано на фиг. 6а, в отсутствие облучения LIFU клетки во всех тестируемых группах не показали усиленных ультразвуковых сигналов, в то время как после облучения LIFU клетки, обработанные FA-FRT-PFP, показали высокую интенсивность УЗИ по сравнению с контрольными FRT-PFP и FA-FRT. -ПФП + ФА группы соответственно. Для ультразвуковой визуализации количественный анализ значений оттенков серого был рассчитан с использованием программного обеспечения ImageJ. Результаты согласуются с данными визуализации УЗИ (рис. 6b), показывающими, что интенсивность УЗИ клеток, обработанных FA-FRT-PFP, увеличивалась после облучения LIFU при 2,0 Вт / см ² на 3 мин. FA-FRT-PFP попадает в клетки и в кислой среде лизосом (pH =~ 5,0) разбирается и высвобождает PFP в цитоплазму [34, 35]. После облучения LIFU PFP легко генерировал фазовые превращения капель в газ, что увеличивало интенсивность УЗИ.

Ультразвуковая визуализация in vitro. а Ультразвуковые изображения и соответствующие статистические данные ( b ) клеток, обработанных PBS (контроль), FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA и FA-FRT-PFP, с облучением LIFU или без него (2,0 Вт / см ² , 3 мин)

Анализ противоопухолевой эффективности и гибели клеток in vitro

На рис. 7а показана цитотоксичность FA-FRT-PFP при концентрациях до 0,5 мг / мл. В отсутствие облучения LIFU FA-FRT-PFP не показал очевидного подавления жизнеспособности в клетках SK-OV-3. Анализы CCK-8 использовали для анализа противоопухолевой эффективности FA-FRT-PFP в сочетании с LIFU. Как показано на фиг. 7b, в отсутствие облучения LIFU FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA и FA-FRT-PFP не проявляли заметной цитотоксичности по сравнению с контрольными группами. В сочетании с 4-минутным облучением LIFU, FA-FRT-PFP проявлял значительную цитотоксичность, которая была выше, чем у FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA, с максимальной скоростью ингибирования клеток, приближающейся к 90% при 40 мкг / мл. Это может быть связано с тем, что FA-FRT-PFP легче захватывается цитоплазмой, а затем лизосомами, по сравнению с FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA. В кислой среде лизосом FA-FRT-PFP высвобождает PFP в цитоплазму. За 4 мин облучения LIFU высвободившийся PFP газифицируется, вызывая кавитацию и разрыв, создавая серию сил физического удара, которые значительно усиливают эффект уничтожения опухолей [36,37,38]. Кроме того, Дополнительный файл 1:Рисунок S3 показывает цитотоксичность наночастиц в нормальных клетках яичников. Нет значительных различий между группами FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA и FA-FRT-PFP по цитотоксичности при их сочетании с LIFU. Результат может быть связан с тем, что клетки HUM-CELL-0088 имеют низкую экспрессию рецептора FA, которая не оказывает целенаправленного действия на FA.

Противораковая эффективность in vitro. а Жизнеспособность клеток SK-OV-3 после 24 ч инкубации с различной концентрацией FA-FRT-PFP. б Жизнеспособность клеток SK-OV-3, обработанных 40 мкг / мл PBS (контроль), FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA и FA-FRT-PFP в сочетании с облучением LIFU или без него (2,0 Вт / см ² , 4 мин) и дальнейшая инкубация 21 ч

Как показано на фиг. 8a, b, в отсутствие облучения LIFU клетки показали минимальную гибель клеток во всех группах. Через 4 мин облучения LIFU клетки, обработанные FA-FRT-PFP, показали значительный некроз (~ 91,6%) по сравнению с другими группами из-за физических ударных волн, генерируемых LIFP-индуцированной кавитацией PFP или продуванием пузырьков. Кроме того, Дополнительный файл 1:Рисунок S4 показывает уровень экспрессии белка TNF в клетках. Без LIFU клетки практически не экспрессировали белок TNF. В то время как с LIFU клетки в группе FA-FRT-PFP имеют высокий уровень экспрессии TNF по сравнению с таковым в группах FRT-PFP и FA-FRT-PFP + FA, что указывает на то, что белок TNF был жизненно важным FA-FRT-PFP. + LIFU-индуцированный белок, связанный со смертью [39]. Основываясь на превосходном эффекте терапии рака in vitro [40,41,42], FA-FRT-PFP является многообещающим для будущей терапии рака in vivo.

а Анализ проточной цитометрии и соответствующие статистические данные клеток SK-OV-3, обработанных 40 мкг / мл PBS (контроль), FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA и FA-FRT-PFP в сочетании с LIFU или без него. облучение (2,0 Вт / см ² , 4 мин) и дальнейшая инкубация 23 ч

Заключение

Таким образом, мы успешно разработали наночастицы фазового превращения на основе FRT и PFP, модифицированные целевой молекулой FA (FA-FRT-PFP). FA-FRT-PFP как новый тераностический препарат, нацеленный на США, имел множество преимуществ:(1) FA-FRT-PFP имел наноразмерный размер частиц; (2) FRT использовался в качестве носителя, который можно было разбирать и повторно собирать для загрузки и выпуска капель PFP в кислых и нейтральных условиях соответственно; (3) при 3-х минутной поддержке LIFU и кислых условиях FA-FRT-PFP высвобождает PFP и вызывает фазовые превращения через ADV, что может значительно увеличить его контрастность в УЗИ; (4) при 4-минутном облучении LIFU и кислой среде высвободившийся PFP может легко вызвать внутриклеточный «эффект взрыва», приводящий к физическим противоопухолевым характеристикам. Эти результаты демонстрируют, что FA-FRT-PFP с помощью LIFU обеспечивает новую стратегию для ультразвуковой молекулярной визуализации и терапии опухолей.

Доступность данных и материалов

Выводы, сделанные в этой рукописи, основаны на данных, которые все представлены и показаны в этой статье.

Сокращения

ADV:

Акустическое испарение капель

ARP:

Платформа акустического реагирования.

CCK-8:

Набор для подсчета клеток-8

EDC:

1-Этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимид

FA:

Фолиевая кислота

FBS:

Фетальная бычья сыворотка

FITC:

Флуоресцеина изотиоцианат

FRT:

Ферритин

LIFU:

Сфокусированный ультразвук низкой интенсивности

NHS:

N-гидроксисукцинимид

PFP:

Перфторпентан

США:

Ультразвук