Исследование расширенной ультразвуковой терапии высокой интенсивности с помощью сонодинамических микропузырьков N2O

Введение

Злокачественные опухоли - одно из основных заболеваний, угрожающих жизни и здоровью человека [1]. Сфокусированный ультразвук высокой интенсивности (HIFU) - это новый метод неинвазивной локальной абляции опухолей. HIFU успешно применяется при лечении доброкачественных и злокачественных солидных опухолей печени, почек, поджелудочной железы, предстательной железы, груди, костей и матки [2, 3]. Однако присущие HIFU ограничения, такие как затухание ультразвуковой энергии во время лечения, ослабление накопления энергии в целевой области и повреждение нецелевых здоровых тканей, снижают его терапевтический эффект [4, 5]. Фокусное поле, сформированное облучением HIFU, невелико, обычно в миллиметрах. Удаление больших опухолей занимает много времени. Увеличение времени облучения HIFU приведет к повышению температуры тела, даже до 39,2 ° C. По мере увеличения глубины опухоли в организме энергия абляции HIFU также должна увеличиваться [6]. Это увеличивает риск физического повреждения пациента и снижает эффективность и безопасность лечения HIFU. Поэтому в последние годы исследователи взяли на себя обязательство найти способы повысить терапевтическую эффективность HIFU [7,8,9]. Микропузырьки могут синергетически улучшать терапевтическую эффективность HIFU [7, 10]. Газ в микропузырьке относится к материалам с высоким акустическим импедансом. Микропузырьки увеличивают рассеяние и отражение ультразвуковой волны в целевой области, когда HIFU облучает область опухолевой ткани [11, 12]. Микропузырьки повышают температуру целевой области опухоли и усиливают тепловой эффект лечения HIFU за счет увеличения накопления энергии HIFU в целевой области [13]. Кроме того, микропузырьки в качестве ядра экзогенной кавитации также снижают порог кавитации ткани и усиливают кавитационный эффект HIFU, когда он проходит через кровообращение в опухолевую ткань [14]. В последние годы исследования показали, что сонодинамическая терапия (SDT) может синергетически повышать эффективность лечения HIFU [15, 16]. Взаимодействие между соносенсибилизаторами и ультразвуком производит активные формы кислорода (АФК), включая синглетный кислород и гидроксильные радикалы, которые убивают опухолевые клетки и подавляют рост опухоли посредством апоптоза и некроза [17]. В последние годы SDT добилась большого прогресса в неинвазивном лечении опухолей. Это позволяет снизить дозу лекарства и мощность HIFU-облучения по сравнению с традиционными монотерапиями. Чтобы в полной мере использовать преимущества этих двух методов, это исследование объединило микропузырьки и сонодинамический эффект для дальнейшего повышения эффективности HIFU. Соносенсибилизаторы - важная часть SDT [18, 19]. Большинство изучаемых в настоящее время традиционных соносенсибилизаторов являются фотосенсибилизаторами. N ₂ О - фотосенсибилизатор [20, 21], выделяющий токсичные вещества в условиях облучения ультрафиолетом. В этом исследовании соночувствительность N ₂ O также первоначально был исследован. Ранее мы обнаружили, что применение N ₂ Ингаляционная анестезия при операции HIFU усиливала степень повреждения тканей, в том числе увеличивалась толщина брюшной полости и кожный застой [22]. Комбинированное использование N ₂ O и HIFU оказали синергетическое действие на повреждение тканей. Но каков биологический эффект N ₂ O имеет в лечении HIFU неясно. N ₂ О представляет собой относительно стабильный газ с небольшими молекулами, не имеющий биотрансформации и тканевой специфичности в клетках. Он может широко применяться в тканях и не оказывает токсического действия на организм [23, 24]. Так что это привлекательная перспектива в качестве соносенсибилизатора. В этом исследовании микропузырьки нанометрового размера (N ₂ O-mbs) получали с использованием обернутого липидом N ₂ O и C ₃ F ₈ . Дозировка N ₂ О был снижен, и его диапазон действия in vivo также эффективно ограничивался областью опухолевой ткани. Сонодинамический эффект N ₂ Были изучены O и его синергетический эффект на эффективность HIFU.

Материалы и методы

Материалы

1,2-дигексадеканоил-рац-глицеро-3-фосфохолин (DPPC) и 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин- N - [метокси (полиэтиленгликоль) -2000] (DSPE-mPEG2000) были приобретены у Avanti Polar Lipids (Алабастер, Алабастр, США). Глицерин и агароза были получены от Sigma Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). N ₂ O и C ₃ F ₈ были приобретены у Chongqing Ruixin Gas Co., Ltd (Китай). 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), 1,1'-диоктадецил-3,3,3', 3'-тетраметилиндокарбоцианин перхлорат (DiI), 2 ', 7'-диацетат дихлорфлуоресцина (DCFH-DA) , 3-амино, 4-аминометил-2 ', 7'-дифлуоресцеин, диацетат (DAF-FM DA) и CCK-8 были приобретены в Beyotime Biotechnology (Чунцин, Китай). Кальцеин-AM (CAM) и иодид пропидия (PI) были получены от Santa Cruz Biotechnology (Техас, США). Аннексин V-FITC / PI получали от Nanjing Keygen Biotech (Нанкин, Китай). Синглетный кислородный датчик зеленого цвета (SOSG) был приобретен у Invitrogen (Нью-Йорк, США).

Подготовка N ₂ O-mbs и C ₃ F ₈ -mbs

N ₂ O-mbs были приготовлены вращающейся пленкой в ​​сочетании с методом механических колебаний. Мы взяли DPPC и DSPE-PEG2000 в качестве материалов оболочки и N ₂ О как ядро. Вкратце, 5 мг DPPC, 2 мг DSPE-PEG2000 и 10 мл хлороформа одновременно выливали в круглодонную колбу, перемешивали и полностью растворяли под действием ультразвуковых волн. Затем липидные пленки формировали на роторном испарителе (60 мин, 55 ° C, 100 об / мин). Затем добавляли 2 мл 10% глицерина для гидратации липидных пленок и приготовления суспензии. 500 мкл из которых добавляли в пробирку для капсул. Трубка капсулы закрывалась резиновым колпачком. Воздух в трубке заменен на N ₂ . O и C ₃ F ₈ с помощью газового вытеснителя. Затем суспензию подвергали механическим колебаниям с помощью серебряно-ртутного капсульного смесителя (YJT-2, Shanghai Medical Device Co., Ltd., Китай) в течение 150 с. Наконец, полученную суспензию подвергали дифференциальному центрифугированию для получения целевого N ₂ O-mbs, и центрифугировали при 300 об / мин в течение 5 минут, а затем центрифугировали при 800 об / мин в течение 5 минут. N ₂ O-mbs ресуспендировали в PBS и затем хранили при 4 ° C для дальнейшего использования.

C ₃ F ₈ -mbs были изготовлены с использованием того же метода механических колебаний, который описан ранее [25]. DiI-маркированный N ₂ O-mbs можно получить, добавляя DiI во время образования фильерной пленки. Стоит отметить, что N ₂ O имеет низкую молекулярную массу и нестабилен. N ₂ О в микропузырьке легко переливается. Следовательно, период полураспада микропузырька сокращается. С ₃ F ₈ представляет собой макромолекулярный инертный газ, который широко используется при исследовании ультразвуковых контрастных веществ для микропузырьков. С ₃ F ₈ может повысить стабильность микропузырьков. Следовательно, в этом исследовании N ₂ O и C ₃ F ₈ (2:1) были смешаны как N ₂ Ядро O-mbs для повышения их стабильности.

Изготовление и определение производительности N ₂ O-mbs

Морфология и распределение по размерам N ₂ O-mbs наблюдались с помощью светлопольной оптической микроскопии. Концентрации N ₂ O-mbs и C ₃ F ₈ -mbs рассчитывались глобулиметром в соответствии с инструкциями по расчету. Средний размер частиц и дзета-потенциал N ₂ O-mbs определяли с помощью системы динамического рассеяния лазерного света (Malvern Instruments, Малверн, Великобритания). Строение и морфология N ₂ O-mbs охарактеризовали с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ, Hitachi H-7600, Hitachi Ltd., Токио, Япония). Подготовленные N ₂ O-mbs хранили при 4 ° C. Для наблюдения за стабильностью N ₂ O-mbs, морфологию и концентрацию регистрировали в первый, второй и третий сутки. В то же время были определены средний размер частиц и дзета-потенциал микропузырьков.

Культура клеток и модель животных

Клетки рака груди человека (MDA-MB-231; Jinxique Technology Development Co., Ltd., Чунцин, Китай) пассировали в лаборатории в течение менее 3 месяцев после реанимации. Клетки поддерживали в инкубаторе 37 ° C с 5% CO ₂ . с использованием DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 50 мкг / л стрептомицина и 50 мкг / л пенициллина. Когда клетки достигли 80% слияния, их использовали для эксперимента.

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с рекомендациями Комитета по этике животных Медицинского университета Чунцина. Некоторое количество самок голых мышей (возраст 4–6 недель, вес 15–20 г) было приобретено в Центре экспериментов на животных Медицинского университета Чунцина (Чунцин, Китай). Для создания солидной опухоли клетки MDA-MB-231 (1 × 10 ⁶ клеток / мл), суспендированные в физиологическом растворе (100 мкл), вводили подкожно в правый задний бок каждой мыши. Всех мышей с опухолями использовали для терапевтических экспериментов, когда объем опухоли достигал около 150 мм ³ .

Внутриклеточное поглощение и оценка биосовместимости N ₂ О-мб

Клетки MDA-MB-231 в фазе роста высевали с плотностью приблизительно 1 × 10 ⁵ . клеток на колбу для конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) в течение 24 часов. Затем 100 мкл (1 × 10 ⁵ пузырьков / мл) меченного DiI N ₂ Добавляли раствор для полного разбавления среды O-mbs, чтобы заполнить конфокальную чашку средой. Чашку закрывали герметиками для микропланшетов и хранили перевернутой в инкубаторе, сохраняя N ₂ O-mbs контактирует с клетками. После 2 и 4 часов совместной инкубации клетки осторожно промывали 3 раза PBS, фиксировали 4% параформальдегидом (PFA) в течение 20 минут и окрашивали DAPI в течение 20 минут. Наконец, поведение N ₂ при нацеливании на ячейки O-mbs наблюдали с помощью CLSM (Nikon A1, Япония).

Цитотоксичность N ₂ O-mbs оценивали с помощью стандартного анализа CCK-8. Клетки MDA-MB-231 высевали в 96-луночный планшет (5 × 10 ⁴ клеток / лунку) в течение 24 часов. Затем 100 мкл различных концентраций (1 × 10 ⁴ / мл, 1 × 10 ⁵ / мл и 1 × 10 ⁶ / мл) N ₂ O-mb были добавлены. После 24 ч инкубации в каждую лунку добавляли раствор CCK-8 (10 мкл). Затем клетки MDA-MB-231 культивировали при 37 ° C в течение еще 2 часов. Наконец, оптическую плотность каждой лунки измеряли при 450 нм с помощью считывающего устройства для микропланшетов Bio-Tek (Bio-Tek Instruments, Thermo Fisher Scientific, Winooski, VT, USA).

Десять здоровых голых мышей-самок весом примерно 20 г были случайным образом разделены на две группы. N ₂ O-mbs ( n =5) группе внутривенно вводили N ₂ O-mbs (200 мкл, 1 × 10 ⁵ / мл) и контрольной группы ( n =5) вводили физиологический раствор (200 мкл). Через 21 день основные органы (сердце, печень, селезенка, легкие и почки) у всех мышей были вырезаны и окрашены гематоксилин-эозином (H&E).

In Vitro SDT Эффективность N ₂ O-mbs

Метод обнаружения кислородных радикалов основан на предыдущем отчете [26]. Вкратце, 10 мкл SOSG (500 мкМ) смешивали с 2 мл раствора образца. Обработки были сгруппированы следующим образом:группа C (пустая контрольная группа), добавляли только PBS; N ₂ Группа O-mbs, 100 мкл N ₂ O-mbs (1 × 10 ⁵ / мл) в 2 мл раствора PBS; С ₃ F ₈ -mbs группа, 100 мкл C ₃ F ₈ -mbs (1 × 10 ⁵ / мл) в 2 мл раствора PBS; Группа LIFU, PBS облучали ультразвуком (2 Вт / см ² ; Институт ультразвуковой визуализации медицинских наук Чунцина, Чунцин, Китай) на 100 с; LIFU – N ₂ Группа O-mbs, PBS с добавленным N ₂ O-mbs облучали ультразвуком; LIFU – C ₃ F ₈ -mbs группа, PBS с добавленным C ₃ F ₈ -mbs облучали ультразвуком. Параметры обработки экспериментальной группы были установлены как 2 Вт / см ² . и 100 с - путем анализа и сравнения экспериментальных результатов и изучения литературы [27, 28]. Параметры ультразвука, используемые для лечебных целей, были следующими:частота - 650 кГц; фокусное расстояние 12,5 мм; режим пульсовой волны, скважность 50%; и длительность импульса 1 с. Генерация синглетного кислорода ( ¹ О ₂ ) определяли с помощью флуоресцентной спектрометрии (Cary Eclipse, Agilent Technologies) путем измерения интенсивности флуоресценции ( λ возбуждение / λ эмиссия =504 нм / 525 нм). Выбор интенсивности и продолжительности ультразвука соответствовал экспериментам на клетках in vitro.

После того, как образование внеклеточных активных форм кислорода (ROS) было обнаружено с помощью анализа SOSG, производство внутриклеточных ROS было обнаружено с помощью набора для анализа ROS на основе DCFH-DA. Клетки MDA-MB-231 высевали с плотностью приблизительно 1 × 10 ⁵ . клеток на колбу CLSM. Затем они были случайным образом распределены на шесть групп:контрольная группа (без лечения), N ₂ Группа только O-mbs (100 мкл, 1 × 10 ⁵ пузырьков / мл), C ₃ F ₈ -mbs only group (100 мкл, 1 × 10 ⁵ пузырьков / мл), группа только LIFU (2 Вт / см ² в течение 100 с), LIFU – C ₃ F ₈ -mbs группа, LIFU – N ₂ Группа O-MBS. После инкубации в течение 24 часов для прикрепления клеток каждая группа подвергалась соответствующему экспериментальному вмешательству, описанному выше. Затем такое же количество DCFH-DA (30 мкМ) добавляли в соответствующую чашку в каждой группе, и чашку инкубировали в течение 20 мин в темноте. Затем клетки осторожно промывали 3 раза PBS, чтобы удалить зонд DCFH, который не попал в клетку. Наконец, генерацию внутриклеточных АФК определяли с помощью CLSM. Для дополнительной проверки эффективности SDT N ₂ O-mbs, клетки высевали в 6-луночные планшеты, культивировали в течение 24 часов и случайным образом распределяли на шесть групп, как описано выше. Затем в каждой группе проводились соответствующие процедуры. Клетки в каждой группе были переварены и приготовлены в виде клеточных суспензий в соответствующих концентрациях и помещены в чашку CLSM. Наконец, клетки сканировали с помощью CLSM после совместного окрашивания красителями САМ и PI, чтобы дифференцировать мертвые (красные) и живые (зеленые) клетки. Апоптоз выявляли с помощью проточной цитометрии и окрашивания аннексином V-FITC / PI. После 1 ч обработки каждую группу клеток центрифугировали и клетки собирали. После совместного окрашивания аннексином V-FITC / PI была проведена проточная цитометрия (Becton – Dickinson, Franklin Lakes, NJ).

Сонодинамический эффект in vitro N ₂ O-mbs повышает эффективность лечения HIFU

Система HIFU (JC200, HIFU Technology Co., Ltd., Чунцин, Китай), состоящая из диагностического ультразвукового устройства, терапевтического ультразвукового устройства и центральной системы обработки, использовалась, как описано ранее [29]. Параметры HIFU, используемые для лечебных целей, были установлены следующим образом:рабочая частота 0,94 МГц; фокусное расстояние 140 мм; диаметр 220 мм; и частота диагностического преобразователя в реальном времени 3,5 MH. Интегрированные преобразователи были погружены в дегазированную воду. Чтобы оценить усиливающий эффект N ₂ O-mbs при обработке HIFU, клетки MDA-MB-231 центрифугировали, 5 × 10 ⁵ / мл, и распределены на четыре группы:контрольная группа (без лечения), группа только HIFU (125 Вт, 5 с), HIFU – N ₂ Только группа O-mbs, HIFU – C ₃ F ₈ -mbs только группа. Затем для каждой группы были выполнены различные соответствующие процедуры. Обработанные клетки центрифугировали и промывали PBS, дважды окрашивали аннексином V-FITC / PI и собирали для проточной цитометрии. Датчик оксида азота (NO) DAF-FM использовали для обнаружения NO в супернатанте каждой группы обработки. Все эксперименты проводились 3 раза. ПЭМ использовали для определения ультраструктурной морфологии обработанных клеток. После каждой обработки обработанные клетки немедленно фиксировали 2% OsO ₄ . , обезвоженный в определенном количестве спирта и полностью заключенный в Epon 812 (Electron Microscopy Sciences, Форт Вашингтон, Пенсильвания). Были приготовлены ультратонкие срезы (100 нм), окрашены уранилацетатом и цитратом свинца и исследованы под электронным микроскопом.

Сонодинамический эффект N ₂ Ex Vivo и In Vivo O-mbs повышает эффективность абляции HIFU

Свежие ткани бычьей печени были закуплены на местной бойне и использованы в течение 12 часов после убоя. Свежую бычью печень ex vivo с небольшим количеством соединительной ткани и меньшим количеством кровеносных сосудов нарезали на сечения 10 см × 5 см × 5 см и дегазировали в течение 1 ч при 37 ° C. Печень крупного рогатого скота была разделена на три группы:C ₃ F ₈ -mbs группа, N ₂ Группа O-mbs и группа PBS. Сначала свежевыделенную бычью печень помещали в емкость, содержащую деаэрированную воду. Затем 200 мкл (1 × 10 ⁵ пузырьков / мл) микропузырьков в PBS вводили непосредственно в бычью печень, как показано на фиг. 6a. Под контролем диагностического ультразвукового преобразователя фокусная точка HIFU располагалась в месте инъекции. Затем терапевтический датчик использовался для выполнения 5-секундной абляции при различной мощности (100 Вт, 125 Вт, 150 Вт) в месте инъекции бычьей печени. Наконец, объем коагуляционного некроза целевой области в ткани бычьей печени был рассчитан в соответствии с измеренными максимальной длиной, шириной и глубиной (мм) по следующему уравнению: V (мм ³ ) =π / 6 × длина × ширина × глубина. Кроме того, значение серого цвета целевой области до и после абляции HIFU в каждой группе было записано на диагностических ультразвуковых изображениях.

Двадцать мышей с опухолями были случайным образом разделены на четыре группы ( n =5 на группу), включая контрольную группу (без какой-либо обработки), группу HIFU – PBS, группу HIFU – C ₃ F ₈ -mbs группа и HIFU – N ₂ Группа O-MBS. HIFU (125 Вт, 5 с) аблацию опухоли применяли после того, как мышам внутривенно вводили 200 мкл C ₃ F ₈ -mbs группа, N ₂ O-mbs и PBS. Процедура HIFU-абляции солидных опухолей была аналогична таковой для выделенной ex vivo бычьей печени. Сначала мышей анестезировали 1% пентобарбиталом (8 мл / кг). Участок опухоли мыши был инокулирован в контейнер, содержащий деаэрированную воду. Под контролем диагностического ультразвукового преобразователя фокус HIFU располагался на ткани опухоли. Массу тела мышей и объем опухоли регистрировали с 3-дневным интервалом. Наконец, всех мышей умерщвляли через 21 день после обработки, и опухолевые ткани вырезали у мышей, а затем отправляли на H&E, окрашивание ядерным антигеном пролиферирующих клеток (PCNA), мечение на конце концов дезоксинуклеотидилтрансферазы dUTP (TUNEL).

Статистический анализ

Все данные были представлены и проанализированы с помощью GraphPad Prism (версия 7, GraphPad Software Inc., Ла-Хойя, Калифорния, США). Данные выражены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Каждый эксперимент повторяли не менее 3 раз. Статистический анализ выполняли с помощью однофакторного дисперсионного анализа с пост-тестом Бонферрони (сравнение всех групп) или пост-тестом Даннета (сравнение всех групп с контрольной группой). Значение p <0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

Характеристика N ₂ O-mbs

Приготовление N ₂ O-mbs модифицированным методом механических колебаний дает высокостабильную суспензию молочно-белого цвета (рис. 1а). N ₂ Размер частиц и морфология O-mbs существенно не изменились после 72 часов хранения при комнатной температуре. Под световым микроскопом N ₂ Наблюдались O-mbs с однородным размером, хорошей дисперсией и высокой стабильностью (рис. 1b). Концентрация N ₂ O-mbs было 5,12 ± 0,45 × 10 ⁸ . пузырей / мл. Как показано на изображениях ПЭМ (рис. 1c), размер N ₂ O-mbs были распределены равномерно, и средний размер составлял приблизительно 450 нм. N ₂ Результаты динамического рассеяния света O-mb показали гидродинамический диаметр 458,1 ± 17,26 нм (индекс полидисперсности =0,368; рис. 1d), что согласуется с результатами ПЭМ. Потенциал N ₂ O-mbs составило -16,2 ± 0,35 мВ (рис. 1e) (дополнительный файл 1:рис. S1).

а Фотографии N ₂ O-mbs, диспергированные в деионизированной воде; б изображение N ₂ O-mbs под светлопольной оптической микроскопией; c изображение N ₂ , полученное с помощью просвечивающего электронного микроскопа O-mbs; г распределение размеров N ₂ O-mbs; е кажущийся дзета-потенциал N ₂ O-mbs

Внутриклеточное поглощение и биосовместимость N ₂ O-mbs

Цитотоксичность N ₂ O-mbs против клеток in vitro исследовали методом CCK-8. Мы определили жизнеспособность клеток контрольной группы как 100%. После 24 часов инкубации результаты определения жизнеспособности клеток не показали значительной цитотоксичности по отношению к клеткам MDA-MB-231. Даже при высоком N ₂ При концентрациях O-mb жизнеспособность клеток оставалась более 95% (рис. 2а). Цитотоксичность N ₂ O-mbs in vivo анализировали на здоровых голых мышах. Как показано на рис. 2b, гистопатологический анализ основных органов (сердце, печень, селезенка, легкие и почки) показал, что N ₂ O-mbs не вызывали значительных токсических повреждений у мышей. Эти результаты показали, что N ₂ O-mbs обладают высокой биосовместимостью.

а Жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа CCK-8; б Окрашивание H&E основных органов (сердце, печень, селезенка, легкие и почки) у здоровых голых мышей-самок, получавших или не получавших N ₂ O-mbs; c изображения из a в d показать клетку в ярком поле, ядра клетки окрашены DAPI, N ₂ O-mbs, окрашенные DiI, и объединенные результаты трех флуоресцентных изображений; масштабная линейка =50 мкм [ NS нет значимости по сравнению с контрольной группой (0 пузырьков / мл)]

Внутриклеточное поглощение N ₂ O-mbs в течение длительного времени инкубации (2 часа и 4 часа) визуализировали с помощью CLSM. Инкубация клеток с DiI-меченным N ₂ O-mbs привело к накоплению большого количества N ₂ O-mbs в мембране раковых клеток и цитоплазме. Как показано на рис. 2c, наблюдается хорошая совместная локализация красного флуоресцентного N ₂ O-mbs с голубыми флуоресцентными клетками. Это открытие предполагает, что N ₂ O-mbs эффективно интернализуются в раковые клетки MDA-MB-231.

Сонодинамический эффект N ₂ O-mbs In Vitro

SOSG - это широко используемый зонд для обнаружения синглетного кислорода, который является высокочувствительным и надежным для обнаружения образования свободных радикалов кислорода. Чтобы изучить потенциал N ₂ O-mbs в качестве соносенсибилизатора, SOSG использовался для обнаружения генерации ROS in vitro [30, 31]. SOSG сочетается с ¹ О ₂ с образованием СОСГ-ЭП, характеризующегося увеличением интенсивности флуоресценции. Как показано на рис. 3а, после ультразвукового облучения раствора СОСГ, содержащего N ₂ O-mbs значение интенсивности флуоресценции значительно увеличилось; по сравнению с остальными группами, продукция свободных радикалов кислорода была значительно увеличена ( p <0,01).

а Спектр флуоресценции СОСГ с N ₂ O-mbs, облученные LIFU; б жизнеспособность клеток определяли с помощью анализа CCK8; c конфокальные изображения внутриклеточной генерации АФК (зеленая флуоресценция указывает на положительное окрашивание на АФК, окрашенные DCFH-DA); г среднее значение интенсивности флуоресценции (DCFH-DA) каждой группы, рассчитанное с помощью Image J. (Данные показаны как среднее ± стандартное отклонение, n =5 на группу, * p <0,05, по сравнению с LIFU – C ₃ F ₈ -mbs группа)

Помимо обнаружения образования АФК в водном растворе после ультразвукового облучения N ₂ O-mbs, набор для анализа DCFH-DA ROS использовали для определения внутриклеточной продукции ROS с помощью N ₂ О-мбс. Как показано на фиг. 3b, группа положительного контроля продемонстрировала самую высокую интенсивность флуоресценции. Следующий по силе сигнал зеленой флуоресценции появился только в LIFU – N ₂ Группа O-mbs, выявляющая последующее производство ROS в одновременном присутствии N ₂ O-mbs и облучение LIFU. Однако явной флуоресценции не было обнаружено ни в одной из оставшихся групп (рис. 3c). Жизнеспособность клеток контрольной группы была определена как 100%. Результаты анализа CCK-8 показали приблизительно 46% гибели клеток в LIFU – N ₂ Группа O-mbs (рис. 3г). Цитотоксичность N ₂ O-mbs в комбинации с LIFU оценивали с помощью CLSM по наблюдению гибели клеток после лечения. САМ использовали для окрашивания живых клеток с зеленой флуоресценцией. PI использовали для окрашивания мертвых клеток с красной флуоресценцией. Как показано на рис. 4а, в LIFU – N ₂ было много мертвых клеток. Группа O-MBS. Кроме того, результаты проточной цитометрии показали, что скорость апоптоза группы клеток MDA-MB-231 была значительно выше, чем у других групп ( p <0,05) после объединенного N ₂ O-mbs с обработкой LIFU (рис. 4b). Комбинированный C ₃ F ₈ -mbs с обработкой LIFU не вызывали явной гибели клеток или апоптоза. Результаты также показали, что обширный апоптоз и некроз произошли в ответ на SDT. Результаты проточной цитометрии соответствовали результатам CLSM. Эти результаты показывают, что N ₂ O-mbs в сочетании с LIFU индуцируют апоптоз опухолевых клеток in vitro (дополнительный файл 2:рисунок S2; дополнительный файл 3:рисунок S3).

а Проточно-цитометрический анализ апоптоза и некроза опухолевых клеток; б конфокальные изображения совместно окрашенных CAM / PI клеток MDA-MB-231 после различных обработок. Масштабная линейка составляет 100 мкм

Оценка синергетического эффекта HIFU in vitro на раковые клетки

Результаты проточной цитометрии показаны на рис. 5а. Оба N ₂ O-mbs и C ₃ F ₈ -mbs увеличивал смертность клеток MDA-MB-231 после абляции HIFU. Кроме того, по сравнению с HIFU-C ₃ F ₈ -mbs, N ₂ O-mbs значительно увеличивали апоптоз MDA-MB-231 ( p <0,05; Рис. 5б). Результаты теста NO показали, что интенсивность флуоресценции супернатанта HIFU – N ₂ Группа O-mbs также была значительно выше, чем у остальных групп ( p <0,05) (рис. 5в). Изменения в цитоплазме и органеллах наблюдали с помощью ПЭМ (рис. 5d). Клетка в контрольной группе (без какой-либо обработки) показала полную морфологию клеток. В цитоплазме клеток группы HIFU обнаружено большое количество вакуолярных веществ. Но у клеток все еще есть полноценные клеточные мембраны и ядерные мембраны. Однако как HIFU – N ₂ Группа O-mbs и HIFU – C ₃ F ₈ -mbs группа показала потерю целостности клеточной мембраны и полный распад клеточной структуры. Следует отметить, что наблюдения с помощью ПЭМ были лишь моментом в процессе гибели клеток и апоптоза после лечения в каждой группе. N ₂ O-mbs как экзогенные микропузырьки оказывают явно синергетический эффект на лечение HIFU. В HIFU – N ₂ Группа O-mbs, сонодинамический эффект N ₂ O-mbs может способствовать дальнейшему апоптозу клеток. Результаты были подтверждены как при обнаружении проточной цитометрии, так и в эксперименте in vivo (дополнительный файл 4:рисунок S4; дополнительный файл 5:рисунок S5)

а Результаты анализа связывания аннексина V-FITC / PI; б средняя скорость апоптоза клеток в каждой группе; c количественный анализ образования NO N ₂ O-mbs, облученные HIFU; г просвечивающая электронная микроскопия изображения клеток. Масштабные линейки составляют 100 мкм. (Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение, n =5 на группу, * p <0,05, по сравнению с контролем, HIFU , HIFU – C ₃ F ₈ -mbs группы)

N ₂ O-mbs как синергист для HIFU-терапии

После HIFU-абляции изолированной бычьей печени в целевой области появилась серо-белая область коагуляционного некроза (рис. 6b). Средние изменения интенсивности эха в целевой области до и после HIFU показаны на рис. 6c. По сравнению с таковыми из группы PBS, целевые значения интенсивности эхо-сигнала C ₃ F ₈ -mbs группа и N ₂ Группа O-mbs значительно увеличилась после лечения HIFU ( p <0.05) and increased as the HIFU ablation intensity increased. The coagulative necrotic volume of the latter two groups and the echo intensity of the B-mode ultrasound images of the target area both increased as the HIFU power increased (Fig. 6d, e).

а Schematic illustration of ex vivo HIFU ablation on degassed bovine livers; б photography of the targeted area in excised bovine liver after HIFU ablation; c real-time ultrasound images before and after HIFU irradiation on bovine livers at 100 W, 125 W and 150 W for 5 s; г quantitative analysis of echo intensity; е quantitative analysis of coagulative necrosis volume of the targeted area in the excised bovine liver after HIFU ablation. (The data were shown as mean ± SD, n =5 per group, *p <0.05, compared with 100 W, 5 s, 125 W, 5 s groups)

The synergistic effect of N₂ O-mbs on HIFU therapy was further verified in vivo. As shown in Fig. 7a, the digital photos of mice and corresponding tumor tissue were recorded 21 days after different treatment. Tumor growth was more effectively inhibited after N₂ O-mbs combined with HIFU treatment. The synergistic effect of N₂ O-mbs on HIFU treatment was also evaluated by H&E, PCNA, and TUNEL staining (Fig. 7b), which demonstrated that N₂ O-mbs combined with HIFU irradiation could cause larger scale of tumor cell necrosis as compared with HIFU–C₃ F ₈ -mbs group. The cell morphology changes exhibited in HIFU–N₂ O-mbs were more obvious than other groups, including karyopyknosis, karyorrhexis and karyolysis, indicating the substantial necrosis of cancer cells.

а Digital photos of tumor-bearing mice and ex vivo tumors 21 days after different treatments; б H&E, PCNA and TUNEL staining of tumor sections after various treatments; c the corresponding calculated tumor volume of each group after 21 days of different treatments; г body weight of tumor-bearing mice for each group. The scale bars in HE staining are 100 μm; the scale bars in TUNEL and PCNA staining are 50 μm. (The data were shown as mean ± SD, n =5 per group, *p <0.05, compared with HIFU-C₃ F ₈ -mbs group)

In addition, the tumor volume of HIFU–N₂ O-mbs exhibited a more significant inhibited tendency than HIFU–C₃ F ₈ -mbs within the 21 days (Fig. 7c, d).

Discussion

HIFU, as a new method of oncotherapy, has been clinically recognized and has achieved notable progress in the treatment of many solid tumors [32]. The thermal effect, cavitation effect, mechanical effect and acoustic chemical effect play significant roles in killing tumor cells and causing irreversible damage to the target area tissue during HIFU ablation [33]. HIFU has limited impact on surrounding normal tissues and is essentially a non-invasive tumor treatment. However, the energy carried by the ultrasound is attenuated due to increased transmission distance, absorption by the blood flow in the target area and the blockage of bones or gas in the body during the HIFU treatment, so that the energy transferred to the target area is reduced. However, prolonging the ablation time and increasing the treatment power increases the risk of normal tissue damage, such as skin burns, neurovascular damage and other complications [34]. Therefore, it is necessary to increase the efficacy of HIFU. Many studies have confirmed that both microbubbles and SDT can improve the efficacy of HIFU [15, 16, 35]. N ₂ O-loaded microbubbles prepared in this study have a smaller particle size, but similar characteristics as ultrasonic microbubble contrast agents. Studies have shown that nano/microbubbles have the same imaging capability as microbubbles in vitro, but have greater capability than microbubbles in vivo [36]. So, N₂ O-mbs not only could be used for ultrasound guidance and localization for HIFU treatment, but also could be used as exogenous microbubbles to enhance the efficacy of HIFU (Additional file 6:Figure S6). At the same time, the sonodynamic effect of N₂ O-mbs could effectively improve the efficacy of HIFU. The generation of ROS after ultrasonic excitation is one of the most important factors for sonosensitizers [16]. To verify the sonosensitivity of N₂ O-mbs, the production of ROS in both extracellular and intracellular environments was detected in this study. The consistent result of both tests showed that N₂ O-mbs can generate ROS in both aqueous solution and intracellularly. Studies have also shown that gases (N₂ и O ₂ ) trapped in cavitation nuclei in solution can undergo cleavage reactions and produce N and O free radicals [37, 38], as follows:

The cavitation effect and the advantage of microbubble packaging reduce the difficulty of the N₂ O reaction [39]. When incubated with cells, N₂ O-mbs exhibit good biocompatibility. The high selectivity, high affinity and high drug loading of nanoparticles [40], as well as the active phagocytosis by cells, promote efficient N₂ O-mbs binding to cancer cells. The nanobubbles display increased penetration, stability and ease of cell entry or aggregation around the cells [36]. In addition, the sonoporation effect of ultrasound can effectively promote the transfer of microbubbles into cells [41].

In contrast to the traditional microbubble contrast agent C₃ F ₈ -mbs, N₂ O-mbs have a greater inhibitory effect on cell growth after ultrasonic irradiation, which is characterized by increased intracellular ROS, decreased cell viability, and apoptosis and necrosis. These results preliminarily suggested the sonodynamic toxic effect of N₂ O-mbs.

In the HIFU synergy experiment, the treatment parameters in the experimental group were set to 125 W for 5 s by analyzing and comparing the experimental results and consulting the literature, which validated a low HIFU power could induce sufficient ablation effect and reduce adverse effects. The results showed that N₂ O-mbs increased the necrosis and advanced apoptosis of more tumor cells. N ₂ O-mbs acted as a nanoscale microbubble synergizer and its sonodynamic effect in response to HIFU may be the reason for the different experiment results. As a microbubble, N₂ O-mbs increased the deposition of HIFU energy in the target area and increased the temperature of the target area and increased the thermal effect of HIFU treatment [11]. The generation of the cavitation effect is closely related to the cavitation threshold and cavitation nucleus concentration [42]. N ₂ O-mbs were cavitation nucleus that reduce the cavitation threshold of HIFU and facilitate the cavitation effect. Therefore, N₂ O-mbs effectively promoted cell necrosis. As a nanoscale microbubble synergizer, N₂ O-mbs were lysed and generate free radicals and nitrogen oxide in response to ultrasound. Studies have confirmed that ROS are important factors in apoptosis induction [43]. It is worth noting that many kinds of free radicals can cause damage to cells. In addition to the generation of oxygen radicals, N₂ O can generate other types of free radicals in cleavage reactions, such as nitrogen free radicals, which contribute to the killing of tumor cells. A small amount of nitric oxide (NO) production was detected in the cell supernatant after HIFU treatment, further indicating that the N₂ O cleavage reaction occurred. An et al. [44] reported that NO may have an anti-tumor function, the mechanism of which involves NO attacking suspected iron enzymes that cause cells to fail to grow and divide when they are trapped. In addition, unstable NO can interact with oxygen molecules to form hydroxyl radicals (HO ^· ) and NO₂ . Hydroxyl radicals are extremely cytotoxic and promote tumor cell apoptosis. NO is also an endothelium-derived relaxing factor. The generation of NO may be the reason for hyperaemia and abnormal swelling in patients during HIFU operation. In an excised bovine liver experiment, we carefully compared the echo intensity of B-mode ultrasound images, pathological changes and coagulative necrotic volume of the target area after HIFU ablation in the presence of N₂ O-mbs, C₃ F ₈ -mbs and PBS. All of these results were consistent. Compared with PBS, N₂ O-mbs effectively enhanced the ablation effect of HIFU. This synergistic effect was also better demonstrated in the ablation of solid tumor in vivo, manifested by tumor cell apoptosis increased, tumor volume reduced and tumor growth inhibition. This finding further indicates that N₂ O-mbs may be a novel auxiliary agent for ultrasound that can be used to promote HIFU thermal tumor ablation. The synergistic effect of N₂ O-mbs in HIFU and the synergistic mechanism provide new ideas and theoretical practice for HIFU synergist research. But, the other related mechanisms of the synergy should be further explored. The effect of tumor ablation by HIFU combined with N₂ O-mbs should be further addressed.

Заключение

In summary, we have developed N₂ O-mb nanoparticles. The characterization and biocompatibility of the N₂ O-mbs were determined. The sonosensitivity of N₂ O-mbs was examined by detecting the production of ROS in aqueous solution and intracellularly. Compared with C₃ F ₈ -mbs, N₂ O-mbs generated ROS and promoted the apoptosis and necrosis of tumor cells, which exhibited extraordinary sonosensitivity. In the HIFU synergy experiments, the sonodynamic effects of N₂ O-mbs significantly increased the apoptosis and necrosis of tumor cells in vitro, and increased the coagulative necrotic volume and echo intensity in the ex vivo isolated bovine liver target area, and effectively inhibited tumor growth in vivo. These results suggested that N₂ O-mbs could be a new kind of sonosensitizer and a novel auxiliary agent for ultrasound therapy that can be used for the ablation of tumors by HIFU.

Доступность данных и материалов

Выводы, сделанные в этой рукописи, основаны на данных, которые все представлены и показаны в этой статье.

Сокращения

N₂ O-mbs:

N ₂ O microbubbles

C₃ F ₈ -mbs:

С ₃ F ₈ microbubbles

HIFU:

high-intensity focused ultrasound

LIFU:

low-intensity focused ultrasound

SOSG:

singlet oxygen sensor green

SDT:

sonodynamic therapy

DPPC:

1,2-dihexadecanoyl-rac-glycero-3-phosphocholine

DSPE-mPEG2000:

1,2-distearoyl-sn-glycero-3phosphoethanolamine-N -[methoxy(polyethylene glycol)-2000

DAPI:

4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол

DiI:

1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate

DCFH-DA:

2′,7′-dichlorofluorescin diacetate

DAF-FM:

3-amino,4-aminomethyl-2′,7′-difluorescein, diacetate

CAM:

Calcein-AM

CCK-8:

Cell Counting Kit-8

CLSM:

confocal laser scanning microscopy

ТЕМ:

transmission electron microscope

DMEM:

Модифицированный носитель Орла, созданный Дульбекко

FBS:

fetal bovine serum

PBS:

phosphate-buffered saline

DI:

deionized water

ROI:

regions of interest

ROS:

reactive oxygen species

NO:

nitric oxide