Синергетически усиленные ингибирующие эффекты совместной доставки ловастатина и доксорубицина, опосредованной наночастицами пуллулана, в трижды отрицательные клетки рака молочной железы

Введение

Тройной отрицательный рак молочной железы (TNBC) - это особый подтип рака молочной железы, который не имеет рецептора эстрогена (ER), рецептора прогестерона (PR) и рецептора 2 эпидермального фактора роста человека (HER2) и имеет худший прогноз, чем другие подтипы рака молочной железы [ 1,2,3]. Доступные таргетные методы лечения в основном зависят от нацеливания на специфические рецепторы на поверхности опухолевой клетки. Поскольку в TNBC отсутствует специфический поверхностный маркер для активного нацеливания на лечение, стоит изучить другие подходы нацеливания. Например, пассивное нацеливание, которое включает уникальный эффект повышенной проницаемости и удерживания (EPR) на солидных опухолях [4], позволяет частицам определенного диапазона размеров нацеливаться на сайт опухоли [5, 6]. Наночастицы (НЧ) - это своего рода носитель лекарства, который может использовать эффект ЭПР и обогащаться в местах солидных опухолей [4].

Недавно мы показали, что ловастатин (LV), один из липофильных статинов, используемых для лечения гиперлипидемии [7], избирательно ингибирует TNBC, воздействуя на раковые стволовые клетки [8, 9]. Кроме того, мы продемонстрировали, что инкапсуляция NP может усиливать ингибирующий эффект LV на TNBC на мышиной модели имплантации клеток рака груди [8]. Наши исследования вместе с предыдущими результатами [10, 11] предполагают, что липофильные статины, особенно LV, могут быть использованы в качестве противораковых препаратов для лечения TNBC. Однако остается неизвестным, может ли LV преодолеть химиорезистентность или усилить терапевтические эффекты химиотерапевтических препаратов при TNBC.

Сообщалось о синергизме между LV и различными типами химиотерапевтических агентов, такими как доксорубицин (DXR), 5-фторурацил [12], цисплатин [13] и 1-β-D-арабинофуранозилцитозин [14], в отношении различных типов раковых клеток. DXR - это антрациклиновое соединение со сложными функциями связывания с ДНК и ингибирования синтеза нуклеиновых кислот. Кроме того, LV индуцировал апоптоз клеток рака яичников в синергизме с DXR [15]. Кроме того, LV является прямым ингибитором выходящего белка P-гликопротеина [16], АТФ-управляемой помпы, которая может легко выводить DXR во внеклеточный компартмент [17, 18]. Таким образом, LV может усиливать терапевтический эффект других терапевтических агентов, а комбинация LV и этих препаратов может повышать терапевтическую эффективность против TNBC.

Современные комбинированные методы лечения полны проблем. С одной стороны, комбинированная химиотерапия может быть серьезно ограничена быстрым метаболизмом, плохой растворимостью в воде и низкой биодоступностью химиотерапевтических препаратов [19, 20]. С другой стороны, из-за различной фармакокинетики, свойств мембранного транспорта и неспецифического биораспределения различных лекарств достижение достаточных концентраций и определенных соотношений вводимых лекарств в отдельных клетках затруднено [21,22,23]. Эти факторы влияют на терапевтическую эффективность и уровень синергизма или антагонизма комбинации. Совместное инкапсулирование двух терапевтических агентов в наноразмерном носителе лекарственного средства является эффективным способом преодоления этих проблем, поскольку оно позволяет лекарствам, загруженным в носитель, поддерживать правильное соотношение для синергетических эффектов [24, 25].

Совместно инкапсулированные наноносители в основном включают липосомы, полимерные мицеллы и микросферы или наночастицы [26,27,28,29]. Полимерные мицеллы из-за их превосходных характеристик (например, с химически конъюгированными и физически инкапсулированными двойными загрузками лекарств, высокой загрузкой лекарств и высокой биосовместимостью) привлекают большое внимание [26, 30]. В нашем предыдущем исследовании мы приготовили серию НЧ с пуллуланом, гидрофильным полисахаридом с высокой биосовместимостью, и изучили влияние различных факторов на их поведение при высвобождении лекарств [31]. В этом текущем исследовании мы подготовили новую полимерную мицеллу PLV с различными соотношениями подачи пуллулана и LV и охарактеризовали распределение по размеру, дзета-потенциалу и морфологии. Мы выбрали наименьший результирующий NP для загрузки DXR, потому что он с большей вероятностью будет интернализован клетками в соответствии с предпосылкой использования эффекта EPR. Кроме того, мы измерили количество загруженного лекарственного средства, эффективность инкапсуляции и количество высвобождаемого лекарственного средства PLV / DXR NP в средах с различными значениями pH. Мы оценили клеточное поглощение загруженных FITC НЧ PLV / DXR, чтобы изучить проникновение НЧ в опухолевые клетки и синергизм DXR и LV в комбинации, а также цитотоксичность НЧ на MDA-MB-231 (TNBC) и MDA-MB. -453 (не TNBC) клеток (Схема 1).

Схематическое изображение наночастиц (НЧ) и клеточного эксперимента in vitro. НЧ пуллулан-ловастатина (PLV) были сформированы путем самосборки полимера, образованного пуллуланом и LV в водном растворе. В процессе формирования NP DXR загружали в гидрофобное ядро ​​NP. Затем PLV / DXR использовался для экспериментов in vitro на клетках с клетками MDA-MB-231 и MDA-MB-453, представляющими клетки тройного отрицательного рака молочной железы (TNBC) и не-TNBC соответственно

Материалы и методы

Материалы

Пуллулан (200 кДа) был из Хаясибара (Токио). LV и DXR гидрохлорид были от J&K Scientific (Пекин). Гидрохлорид 1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимида (EDCI) и 4-диметиламиноприидин (DMAP) были от Aladdin Reagent (Шанхай). Другие реагенты, такие как растворители, были от Sinopharm Chemical Reagent Co. (Пекин). Клеточные линии рака груди MDA-MB-231 (TNBC) и MDA-MB-453 (не TNBC) были приобретены в Центре клеточных ресурсов Шанхайского института биологических наук. Реагент CellTiterBlue был от Promega (Мэдисон, Висконсин, США). Среда Игла, модифицированная Дульбекко (DMEM) (каталожный номер SH30022.01), была получена от компании HyClone (США), а фетальная телячья сыворотка (FBS) (каталожный номер 04-001-1ACS) была получена от компании Biological Industries (Израиль).

Синтез LV-привитого пуллулана (PLV)

Сначала моноэфир янтарной кислоты LV (LV-SA) был синтезирован с помощью следующих стадий. Вкратце, 0,60 г янтарного ангидрида (SA, 6,0 ммоль) и 2,0 г LV (5,0 ммоль) растворяли в 20 мл безводного пиридина и перемешивали в течение 48 часов при 50 ° C. Полученный реакционный раствор медленно выливали в 1500 мл ледяной раствор HCl с pH 3 при постоянном перемешивании для осаждения большого количества белого осадка, и pH суспензии доводили до pH 3 с помощью концентрированной HCl с последующей вакуумной фильтрацией. . Затем осадок промывали ледяным раствором HCl с pH-3, а затем ddH ₂ . О до нейтрального с образованием сырого продукта. Наконец, неочищенный продукт перекристаллизовывали из системы растворителей ацетон-вода с получением чистого LV-SA, и выход составил 72%. PLV получали путем конъюгирования группы карбоновой кислоты LV-SA с гидроксилом пуллулана при молярных отношениях LV-SA к пуллулану 1/2, 1/3 и 1/4. Вкратце, 0,5 г (1,03 ммоль) приготовленного LV-SA, 0,15 г DMAP (1,23 ммоль) и 0,24 г EDCI (1,23 ммоль) растворяли в 20 мл диметилсульфоксида (ДМСО) и перемешивали при 50 ° C в течение 4 часов. Пуллулан (0,33 г, 1/2; 0,50 г, 1/3; 0,67 г, 1/4) растворяли в ДМСО с получением 2% (мас. / Об.) Раствора. Затем раствор пуллулана медленно добавляли к реакционному раствору для проведения реакции при 50 ° C в течение 48 часов. Реакционные смеси помещали в мешки для диализа (MWCO =8 ~ 12 кДа) и подвергали диализу против 25% этанола / воды и воды. Затем образцы сушили вымораживанием [32]. Конъюгаты PLV с различным соотношением LV к пуллулану в сырье были охарактеризованы с помощью FTIR-анализа с использованием FTIR-спектрофотометра (гранулы KBr, Nicolet, TM Nexus 470-ESP, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Конъюгаты PLV также были подтверждены ¹ Спектроскопия ЯМР 1Н (растворитель ДМСО-d6, BRUKER AVANCE-500, Bruker, Billerica, MA, USA) и рассчитывалась степень замещения (DS) LV для каждого конъюгата.

Подготовка и характеристика НП

50 мг конъюгата PLV растворяли в 12,5 мл ДМСО при осторожном встряхивании при 37 ° C (для полного набухания конъюгата) с получением раствора конъюгата 4 мг / мл. 5 мл раствора конъюгата разбавляли до 2 мг / мл ДМСО для диализа против 1000 мл дистиллированной воды в течение 8 часов с 10-кратным обменом с использованием диализного мешка (8 ~ 14 кДа). Затем раствор обрабатывали ультразвуком с использованием ультразвукового устройства зондового типа (ультразвуковой измельчитель ячеек GA92-IIDA, Suzhou Jiangdong Precision Instruments) при 100 Вт с импульсным режимом (импульс 2,0 с, выкл 2,0 с) в течение 2 мин в бане с ледяной водой. . Были получены самоорганизованные НЧ PLV, и образцы хранили при 4 ° C. Для приготовления НЧ PLV / DXR 2 мг DXR растворяли в 5 мл ДМСО и затем добавляли по каплям в 5 мл раствора конъюгата, затем таким же методом получали НЧ PLV / DXR. В типичной процедуре получения НЧ PLV / DXR, нагруженных FITC, 1 мг DXR растворяли в 2 мл ДМСО и затем добавляли по каплям в 2,5 мл раствора конъюгата. Затем по каплям добавляли 1 мл раствора FITC (0,6 мг / мл) в ДМСО, и тем же методом были приготовлены НЧ PLV / DXR, нагруженные FITC.

НЧ PLV, НЧ PLV / DXR и НЧ PLV / DXR, нагруженные FITC, фильтровали через мембраны с размером пор 0,45 мкм, затем определяли размер частиц, дзета-потенциалы и индексы полидисперсности (PDI) с помощью динамического светорассеяния (DLS, Zetasizer 3000 HS, Malvern Instruments, Малверн, Великобритания). Морфологические особенности НЧ PLV наблюдали с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ; Tecnai G2 20 S-Twin, FEI Hong Kong) при ускоряющем напряжении 80 кВ.

Определение грузоподъемности и эффективности захвата

Раствор PLV / DXR NP (5 мл) обрабатывали ультразвуком в течение 5 минут (импульс 2,0 с, выключение 2,0 с) для высвобождения лекарства из NP. Поглощение DXR в растворе измеряли при 480 нм с использованием спектрофотометра УФ-видимого диапазона (Shimadzu UV-2550, Киото, Япония) для расчета концентраций лекарственного средства. Эффективность инкапсуляции DXR (EE) и грузоподъемность (LC) рассчитывались следующим образом:

Выпуск лекарства in vitro

Профиль высвобождения DXR из PLV / DXR NPs измеряли в 0,1 М фосфатном буферном растворе при 37 ° C методом диализа, как описано [33]. Обычно 6 мл PLV / DXR NP (что соответствует 139,4 мг DXR) переносили в диализный мешок (MWCO =3500 Да), а затем инкубировали при 37 ° C в 15 мл PBS (pH 7,4 и 5,4). В заранее заданное время отбирали 3 мл внешнего буферного раствора и заменяли 3 мл свежего PBS (pH 7,4 или 5,4). Количество высвободившегося DXR измеряли флуоресцентной спектрофотометрией. Процент высвобождения лекарства ( Q %) рассчитывалась следующим образом:

где W - вес NP, C _n - концентрация образца при Tn , V - общий объем среды выпуска, V _n - объем пробы (2 мл), а C _я - концентрация образца при T _я ( я =0, 0,5, 1,… n часов, оба V ₀ и C ₀ равны нулю).

Культура клеток

Клеточные линии рака груди человека MDA-MB-231 и MDA-MB-453 культивировали в полной среде DMEM, содержащей 10% FBS, во влажных условиях 37 ° C, 5% CO ₂ и нормоксия (21% O ₂ ). Все экспериментальные клетки были получены из клеток с логарифмической фазой роста.

Цитотоксичность in vitro

Клетки MDA-MB-231 и MDA-MB-453, высеянные в 96-луночные планшеты (4 × 10 ³ клеток / лунку в объеме 100 мкл) выращивали в обычных условиях культивирования в течение 24 часов. Затем добавляли НЧ PLV / DXR с различными концентрациями препарата (массовое соотношение DXR и LV составляло 8,13) и инкубировали в течение 48 часов. Наконец, добавляли 20 мкл реагента CellTiter Blue (Promega), используемого для измерения пролиферации клеток, и инкубировали в течение 1–4 ч при 37 ° C. Поглощение при 530/590 нм измеряли с помощью автоматического считывателя микропланшетов. Жизнеспособность клеток выражали в процентах от оптической плотности по отношению к контрольной группе без обработки.

Анализ синергетического эффекта in vitro

Изобольный анализ использовали для количественной оценки синергизма и антагонизма, вызываемого парными лекарственными средствами. Согласно принципу эквивалентной дозы Таллариды и аддитивной модели Loewe, генерируется изобола, которая представляет собой линию, определяющую аддитивный эффект парных препаратов [34, 35]. На практике, как мы описали ранее [8], мы сначала получили кривые доза-эффект для свободного DXR и свободного LV и после преобразования дозы и эффекта лекарственного средства использовали линейную регрессию для получения уравнений линейной регрессии для расчета комбинированных доз парных препараты, дающие указанный эффект. Данные для построения изоболы проиллюстрированы в таблице 1. Точки на изоболе устанавливают DXR / LV в различных соотношениях для получения 50% максимального эффекта. ИС ₅₀ парной дозы лекарства, расположенной ниже изоболы, указывает на синергетический эффект, тогда как IC ₅₀ над изоболой указывает на антагонистический эффект.

Использование клеток in vitro

PLV / DXR FITC NP получали диализом. Поглощение клетками PLV / DXR FITC NP проверяли с использованием флуоресцентного ридера для микропланшетов. Были засеяны клетки MDA-MB-231 и MDA-MB-453 (2 × 10 ⁵ / лунку) на чашки диаметром 2,5 см и инкубировали при 37 ° C в течение 24 часов. Затем клетки инкубировали с концентрациями PLV-DXR FITC NP при 37 ° C в течение 1, 2 и 4 часов. Затем культуральную среду удаляли и дважды промывали холодным PBS. Клетки фиксировали 4% параформальдегидом в течение 5 мин и помещали на предметные стекла, используя среду для закрепления, содержащую DAPI. Затем клеточное поглощение НЧ визуализировали с помощью флуоресцентной микроскопии.

Статистический анализ

Данные выражены как среднее ± стандартное отклонение и были проанализированы с помощью t Стьюдента. контрольная работа. Различия считались статистически значимыми при P <0,05.

Результаты

Цитотоксичность in vitro и синергетический эффект DXR и LV

Чтобы оценить ингибирующий эффект LV и DXR на пролиферацию клеток TNBC и не-TNBC, жизнеспособность клеток оценивали с помощью анализа Alamar blue. Сначала мы определили ингибирующий эффект LV и DXR на две клеточные линии TNBC с помощью теста на бесплатное лекарство. Ряд соотношений концентраций LV / DXR был получен путем установки константы концентрации одного лекарственного средства и изменения концентрации другого лекарственного средства. Для линии клеток MDA-MB-231 и LV, и DXR вызывали зависимое от концентрации ингибирование, но LV оказывал значительный ингибирующий эффект при концентрациях до 3,0 мкМ (рис. 1).

Цитотоксичность свободного доксорубицина (DXR) и свободного ловастатина (LV) в клетках рака молочной железы. Цитотоксичность свободного DXR, LV, DXR и LV in vitro в сочетании с MDA-MB-231 ( a , b ) и MDA-MB-453 ( c , d ) раковые клетки

IC ₅₀ значения для LV при различных обработках DXR и для DXR при различных обработках LV показаны в таблице 2, и мы также построили эти IC ₅₀ значения (рис. 2a), чтобы визуально отразить комбинированный эффект DXR / LV. IC ₅₀ для одного свободного DXR составляло 0,865 мкМ, а для одного свободного LV - 10,07 мкМ. Когда концентрация DXR увеличилась с 0,125 до 0,625 мкМ (пятикратное увеличение), IC ₅₀ для LV снизилась с 10,92 до 0,28 мкМ (39-кратное снижение), а когда концентрация DXR увеличилась с 0,625 до 3,125 мкМ (5-кратное увеличение), IC ₅₀ значение для ЛЖ снизилось с 0,28 до 0,0004085 мкМ (снижение в 685 раз). Точно так же, когда концентрация LV увеличилась с 1,0 до 3,0 мкМ (трехкратное увеличение), IC ₅₀ значение DXR снизилось с 1,005 до 0,3033 мкМ (снижение в 3,3 раза), а когда концентрация LV увеличилась с 3,0 до 10 мкМ (увеличение в 3,3 раза), IC ₅₀ значение DXR снизилось с 0,3033 до 0,007196 мкМ (42-кратное снижение). Таким образом, при той же скорости ингибирования пролиферации клеток MDA-MD-231 DXR может значительно снизить необходимое количество LV, а LV также может значительно снизить необходимое количество DXR. Это открытие важно для химиотерапии опухолей, потому что DXR является сильнодействующим химиотерапевтическим препаратом с нежелательными побочными эффектами, и его следует поддерживать в низкой концентрации, а LV имеет минимальные побочные эффекты [36]. Для клеток MDA-MB-453 DXR показал зависимое от концентрации ингибирование, но LV не показал значительного ингибирования при исследованных концентрациях. Кроме того, DXR оказывал значительное ингибирующее действие на клетки MDA-MB-453 в концентрациях до 3,0 мкМ, что было намного менее эффективным, чем для клеток MDA-MB-231 (рис. 1). Недавно мы обнаружили, что LV избирательно ингибирует панель клеточных линий TNBC по сравнению с клеточными линиями без TNBC [8]; следовательно, комбинация LV и DXR может быть подходящей для лечения TNBC, но не не-TNBC клеток.

Синергизм DXR и LV. IC ₅₀ значения для DXR и LV с разными концентрациями LV и DXR, рассчитанные с помощью GraphPad Prism 7 ( a ) и изоболический метод ( b )

Для дальнейшей количественной оценки синергизма DXR и LV мы использовали изобольный метод. При различных соотношениях DXR / LV для достижения 50% максимального эффекта (Таблица 1) мы построили изоболу, которая указала на аддитивный эффект отношения DXR / LV (Рис. 2b). IC ₅₀ дозы DXR / LV при 0,025 / 7,09, 0,3033 / 3,0 и 0,625 / 0,28 (мкМ / мкМ) были ниже изоболы, что позволяет предположить, что DXR / LV при этих соотношениях будет давать синергетический эффект. Таким образом, этот синергетический эффект (1 + 1> 2) будет способствовать дальнейшему достижению фармакологически статистически минимизированных доз лекарства с максимальной эффективностью лекарства [37]. Эти три синергетических соотношения, по-видимому, представляют следующие результаты:(1) низкая доза DXR (0,025 мкМ) может лучше повысить терапевтическую эффективность LV, поскольку 0,025 мкM DXR может привести к большему отрицательному наклону кривой зависимости эффекта от дозы LV (рис. 2б); (2) при высокой концентрации DXR добавление небольшого количества LV может значительно способствовать эффекту DXR против клеток MDA-MB-231, поскольку IC ₅₀ для одного только DXR составлял 0,865 мкМ, но добавление только 0,28 мкМ LV уменьшало IC ₅₀ DXR до 0,625 мкМ, то есть 0,28 мкМ LV полностью заменил эффективность 0,24 мкМ DXR (таблица 2); и (3) когда доза LV была примерно в 10 раз больше, чем DXR, соотношение DXR / LV должно иметь лучший синергетический эффект, потому что точка (0,3033, 3,0) находилась дальше всего от изоболы (рис. 2b).

Синтез и структурная характеристика конъюгатов PLV

Амфифильные конъюгаты PLV синтезировали, как показано на схеме 2. PLV получали этерификацией пуллулана и LV. Структуры конъюгатов PLV подтверждены FTIR и ¹ Спектры ЯМР 1Н (рис. 3). Согласно FTIR-анализу (рис. 3а), были успешно получены конъюгаты PLV. Для спектров конъюгатов PLV, помимо сохранения характерных пиков пуллулана (1644, 1642 и 1648 см ^-1 ) усиленные пики на 1459 см ⁻¹ и 1360 см ⁻¹ также показаны пики изгибных колебаний –CH ₃ и –CH ₂ - соответственно для LV. Кроме того, мы наблюдали сильный сдвиг волнового числа пиков поглощения -C =O при растяжении (сложноэфирная связь в LV) на 1725 см ^-1 из конъюгатов PLV из-за вновь образованной сложноэфирной связи, и эти пики усиливались с увеличением молярного отношения LV к пуллулану (рис. 3a).

Химический синтез амфифильных конъюгатов PLV. LV и янтарный ангидрид (SA) реагировали при катализе пиридином с образованием LV-SA при 50 ° L. Затем LV-SA был связан с пуллуланом сложноэфирной связью при катализе EDC и DMAP с образованием полимера PLV

Структурная характеристика конъюгатов пуллулан-ловастатин (PLV). а FTIR-спектры пуллулана, LV, PLV (1/2), PLV (1/3) и PLV (1/4) с максимумом при 1644, 1642 и 1648 см ^-1 как характерные пики пуллулана. Пунктирные линии на 1360, 1459 и 1725 см ⁻¹ показать пики изгибных колебаний –CH ₃ - и –CH ₂ - для LV. б ¹ Спектры ЯМР 1Н для пуллулана, LV, PLV (1/2), PLV (1/3) и PLV (1/4)

Мы подтвердили успешный синтез конъюгатов PLV с помощью ¹ Спектры ЯМР 1Н (рис. 3б). ¹ Спектры H-ЯМР показали характерные пики пуллулана и новые пики, отнесенные к CH ₃ , CH ₂ и протоны CH фрагмента LV при 0,5 ~ 2,7 м.д. (красная рамка), что указывает на успешную конъюгацию LV с пуллуланом. Мы использовали характеристические пики пуллулана при 4,94 ~ 5,14 м.д. (а), соответствующие протонам гликозидной связи α-1,6 и α-1,4 C ₁ для определения единиц глюкозы в пуллулане [38]. Сигналы при 4,12 м.д. (б) соответствуют протону C ₁₃ в LV. Таким образом, DS остатков LV на 100 единиц глюкозы пуллулана рассчитывали по соотношению C ₁₃ протоны (4,05 ~ 4,15 частей на миллион) LV в протоны сахаров (4,94 ~ 5,14 частей на миллион) по следующему уравнению:DS = I _4,05–4,15 / Я _{4,94 ~ 5,14} × 100%. Данные DS для LV представлены в таблице 3.

Характеристики НП PLV

Синтезированный конъюгат PLV может самособираться в мицеллы в водном растворе. Средний размер и индекс полидисперсности (PDI) составляли 177,2 нм и 0,138 соответственно для НЧ PLV (1/2); 189,7 нм и 0,160 для НЧ PLV (1/3); 219,8 нм и 0,050 для НЧ PLV (1/4) (таблица 3; рис. 4а, б). Кроме того, дзета-потенциал для НП PLV (1/2), PLV (1/3) и PLV (1/4) составлял -11,66, -10,51 и -8,30 мВ соответственно. Размер PLV NP уменьшался с увеличением DS LV без значительного изменения дзета-потенциала. Изменение размера в основном объясняется усилением гидрофобного взаимодействия между LV-группами, что приводит к образованию более компактных гидрофобных ядер [39]. Ранее мы исследовали НЧ пуллулана с различными значениями DS холестерина и обнаружили, что в определенной степени, чем больше гидрофобная DS амфифильного полимера, тем меньше размер образующихся НЧ [33]. В этом исследовании, поскольку DS гидрофобной группы LV была больше, размер NP также был меньше. Кроме того, изображения ПЭМ (рис. 4c) показали, что НЧ обычно имели сферическую форму с хорошей монодисперсностью. НЧ PLV (1/2) с самым высоким DS, приводящим к максимальной нагрузке LV и наименьшим размером, были выбраны для следующих экспериментов.

Характеристика наночастиц (НЧ). а Размер частиц и распределение PLV. б Дзета-потенциал PLV. c Изображение PLV (1/2), полученное с помощью просвечивающей электронной микроскопии. г Размер и распределение частиц PLV / DXR и PLV / DXR, загруженных FITC. е Дзета-потенциал PLV / DXR и PLV / DXR, загруженных FITC. е Фотография PLV / DXR, загруженных PLV, PLV / DXR и FITC

НЧ PLV / DXR также имели сферическую морфологию и больший размер, 225,6 нм, чем пустые НЧ PLV. Эффективность инкапсуляции и емкость загрузки PLV / DXR NP составляли 20,92% и 1,93% соответственно. Гидрофобное взаимодействие между гидрофобным ядром НЧ и гидрофобной группой лекарственного средства определяет величину нагрузки лекарственного средства в НЧ. Учитывая, что растворимость в воде гидрохлорида DXR, используемого в этом эксперименте, была немного больше, гидрофобное взаимодействие между DXR и гидрофобным ядром NP было слабым, что привело к меньшему количеству DXR, фактически инкапсулированного в NP. Чтобы дополнительно прояснить захват NP опухолевыми клетками, FITC загружали в NP PLV / DXR. При загрузке FITC средний размер загруженных FITC НЧ PLV / DXR составлял 253,8 нм, а средний дзета-потенциал - 15,09 мВ (рис. 4d, e).

Выпуск лекарства in vitro

Чтобы выявить характер высвобождения DXR из PLV / DXR NP, профили высвобождения DXR in vitro оценивали в PBS при pH 7,4 и 5,4, имитируя условия в нормальных физиологических тканях и внутриклеточном микроокружении, соответственно. НЧ PLV / DXR демонстрировали две фазы высвобождения DXR:быстрое высвобождение в первые 8 ч и продолжительное высвобождение после этого (рис. 5), что согласуется с профилем высвобождения типичных НЧ. Кроме того, при снижении pH с 7,4 до 5,4 кумулятивное высвобождение DXR значительно ускорялось до 76,15% и 97,90%, соответственно, через 72 часа. Следовательно, высвобождение DXR из НЧ PLV / DXR было до некоторой степени чувствительным к pH, что особенно полезно для повышения терапевтической эффективности и снижения побочных эффектов in vivo [40].

Профили высвобождения DXR из PLV / DXR in vitro в фосфатно-солевом буфере при pH 7,4 и 5,4 в разное время после диализа

Использование сотовой связи загруженных FITC PLV / DXR NP

Мы получили изображения флуоресцентной микроскопии клеток MDA-MB-231 (рис. 6a) и MDA-MB-453 (рис. 6b) через 0,5, 1 и 4 часа соответственно после воздействия FITC-нагруженных НЧ PLV / DXR и обнаружили зависящее от времени увеличение интенсивности как красной, так и зеленой флуоресценции от 0,5 до 4 ч после обработки NP (рис. 6), что указывает на зависящее от времени поглощение клетками DXR и FITC-нагруженных NPs, соответственно. Кроме того, количество FITC, проникающего в клетки MDA-MB-231, было больше, чем количество FITC, проникающих в клетки MDA-MB-453. Дальнейшая количественная оценка интенсивности флуоресценции выявила значительную разницу в поглощении DXR между клетками MDA-MB-231 и MDA-MB-453 через 1 час после обработки NP (рис. 6c).

Поглощение клетками рака молочной железы лекарств, загруженных в НЧ PLV / DXR. Изображения флуоресцентной микроскопии загруженного FITC PLV / DXR, полученного MDA-MB-231 ( a ) и MDA-MB-453 ( b ) ячейки через 0,5, 1 и 4 часа (синий для DAPI, красный для DXR, зеленый для FITC). c Количественный анализ клеточного поглощения DXR клетками MDA-MB-231 и MDA-MB-453 после лечения PLV / DXR

Цитотоксичность НЧ PLV / DXR in vitro

Подтвердив ингибирующий эффект DXR и LV на жизнеспособность клеток MDA-MB-231 и MDA-MB-453 и продемонстрировав синергетический эффект DXR и LV, мы определили цитотоксичность PLV / DXR для этих двух клеток in vitro. линии. Клетки MDA-MB-231 и MDA-MB-453 инкубировали с NP PLV / DXR в концентрации, эквивалентной концентрации свободного DXR. Цитотоксичность НЧ PLV / DXR возрастала с увеличением концентрации DXR и была выше для MDA-MB-231, чем для клеток MDA-MB-453 (фиг. 7a). Этот результат согласуется с тенденцией цитотоксичности свободных лекарств (рис. 7b) и указывает на то, что загрузка свободных лекарств в NP не влияет на ингибирующее поведение лекарств. НЧ PLV / DXR обладают более сильным ингибирующим действием на пролиферацию MDA-MB-231, чем клетки MDA-MB-453, что согласуется с преимущественным ингибирующим действием LV на TNBC. Ингибирование роста клеток MDA-MB-231 было больше с PLV / DXR NP, чем с свободным DXR (IC ₅₀ 0,6012 против 0,865 мкМ), что предполагает, что НЧ могут способствовать клеточному захвату и удержанию загруженного лекарства внутри клетки, вызывая повышенную цитотоксичность по сравнению со свободным лекарством.

Цитотоксичность in vitro лекарственного средства с доставкой NP по сравнению со свободным лекарственным средством. Цитотоксичность PLV / DXR ( a ) и бесплатный DXR ( b ) против клеток MDA-MB-231 и MDA-MB-453

Обсуждение

В этом исследовании НЧ PLV / DXR, подготовленные для профилирования высвобождения лекарственного средства in vitro, устойчиво высвобождали DXR в течение 72 часов, что было устойчивым при pH 5,4 (97,9%). НЧ PLV / DXR более сильно ингибировали пролиферацию TNBC MDA-MB-231, чем клетки MDA-MB-453, не относящиеся к TNBC. Обе клеточные линии показали зависящее от времени поглощение НЧ, но клетки MDA-MB-231 потребляли больше НЧ, чем клетки MDA-MB-453. Таким образом, совместная доставка LV и DXR NP на основе пуллулана может эффективно ингибировать пролиферацию клеток рака молочной железы TNBC, что может указывать на мощную систему доставки лекарств для лечения TNBC.

Недавно использование LV для профилактики и лечения TNBC получило признание, и исследования дополнительно показали, что LV преимущественно ингибирует пролиферацию клеток TNBC и индуцирует апоптоз [10, 41]. Однако клинически LV в основном находятся в пероральных препаратах, но другие противоопухолевые препараты для химиотерапии, включая DXR, в основном находятся в форме инъекций. Эта ситуация приводит к нежелательной химиотерапевтической эффективности комбинирования LV и других лекарственных средств из-за трудностей в достижении опухолевой ткани в ожидаемых дозах и времени. Составить рецептуру LV в виде инъекции трудно из-за его нерастворимости в воде. Следовательно, системы доставки наночастиц необходимы для использования LV для противоопухолевой эффективности, а также для совместной инкапсуляции нескольких препаратов для упрощения комбинированной химиотерапии.

Наша группа недавно приготовила нанокомпозит на основе церасомов для инкапсуляции LV, что в некоторой степени решило проблему водорастворимости LV, но эффективность загрузки лекарственного средства в целом была невысокой (5 ~ 6%) [8]. Zhang et al. разработали нанокапсулы конъюгата камптотецин-флоксуридин для нагрузки LV. Эти нанокапсулы, состоящие из двух химиотерапевтических препаратов, одобренных Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США, обеспечивали сверхвысокую нагрузочную способность камптотецина-флоксуридина (68,3%), но эффективность загрузки для LV все еще была низкой (2,8%) [29]. В настоящем исследовании мы использовали LV для гидрофобной модификации пуллулана для получения амфифильных конъюгатов PLV, а затем приготовили NP PLV / DXR, что не только решило проблему водорастворимости LV, но и обеспечило высокую способность загружать лекарство (15,69%). для LV и 1,93% для DXR).

Стратегия инкапсуляции двух или более противоопухолевых препаратов в наноноситель широко используется для эффективной доставки лекарств [42]. Sui et al. использовали DXR-привитые НЧ пуллулана, загружающие сорафениб, для достижения синергетической химиотерапии против рака молочной железы мыши [30]. В нашем исследовании использовалась аналогичная методология для НЧ PLV / DXR, демонстрирующая более высокую ингибирующую эффективность для клеток MDA-MB-231 по сравнению с одним DXR. Однако НЧ PLV / DXR не проявляли синергетических эффектов, что могло быть связано с задержкой эндоцитоза НЧ и высвобождения ЛЖ, что заслуживает дальнейшего изучения.

Комбинированный индекс широко используется для количественной оценки синергических эффектов двух препаратов [43,44,45]. Метод анализа изоболограмм, используемый для количественной оценки синергетических эффектов, позволяет эффективно избежать ложноположительных результатов [35]. В этом исследовании мы проверили оптимальное соотношение синергизма из ряда соотношений DXR / LV на основе анализа изоболограмм.

Наше исследование дает обоснование для разработки более эффективной системы совместной доставки, чтобы вызвать синергетически усиленные ингибирующие эффекты на TNBC. Поскольку наша работа является предварительной и основана на предположении, что эффект ЭПР возможен, необходимы дальнейшие исследования in vivo эффективности этой новой системы совместной доставки на TNBC с использованием моделей ортотопического роста опухоли молочной железы и моделей ксенотрансплантатов, полученных от пациентов.

Заключение

В этом исследовании мы разработали новые НЧ с двойной загрузкой лекарственного средства путем химической трансплантации LV в пуллулан и физической инкапсуляции DXR, которые обладали превосходной монодисперсностью, высокой способностью к загрузке лекарственного средства и хорошими характеристиками высвобождения лекарственного средства. НЧ PLV / DXR продемонстрировали устойчивое поведение pH-чувствительного высвобождения DXR. НЧ PLV / DXR более эффективно усваивают и ингибируют пролиферацию TNBC MDA-MB-231, чем клетки MDA-MB-453, не относящиеся к TNBC. Кроме того, мы продемонстрировали синергетический эффект смеси свободного DXR / LV, которая обеспечивает режим комбинированной химиотерапии для потенциального будущего клинического лечения TNBC.

Доступность данных и материалов

Выводы, сделанные в этой рукописи, основаны на данных, которые все представлены и показаны в этой статье.

Сокращения

¹ H ЯМР:

Протонный ядерный магнитный резонанс

DLS:

Динамическое рассеяние света

DMAP:

4-диметиламиноприидин

DMEM:

Модифицированный носитель Орла, созданный Дульбекко

DMSO:

Диметилсульфоксид

DS:

Степени замещения

DXR:

Доксорубицин

EDCI:

1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимид гидрохлорид

EE:

Эффективность инкапсуляции

EPR:

Повышенная проницаемость и удерживание

ER:

Рецептор эстрогена

FBS:

Фетальная бычья сыворотка

FTIR:

Инфракрасное преобразование Фурье

HER2:

Рецептор 2 эпидермального фактора роста человека

LC:

Грузоподъемность

LV:

Ловастатин

LV-SA:

Моноэфир ловастатина янтарной кислоты

NP:

Наночастицы

PDI:

Индексы полидисперсности

PLV:

Ловастатин, инкапсулированный в пуллулан

НП PLV / DXR:

Наночастицы PLV, нагруженные доксорубицином

PR:

Рецептор прогестерона

SA:

Янтарный ангидрид

TNBC:

Тройной отрицательный рак груди