Наночастицы оксида циркония запускают ROS-опосредованную цитоксичность и подавляют остеогенное дифференцирование в 3T3-E1 остеобластах

Аннотация

Наночастицы оксида циркония (ZrO₂) всё чаще используются в биосенсорах, терапии рака, имплантах и стоматологии из-за их высокой механической прочности и низкой сообщаемой токсичности. Однако по мере расширения применения растёт и потенциальное человеческое воздействие, делая чёткий токсикологический профиль необходимым. Наночастицы диоксида титана (TiO₂), известные как слабо токсичные, служили эталоном в этом исследовании. Мы изучили цитоксичность TiO₂ и ZrO₂ НЧ в остеобласто-подобных клетках 3T3-E1, фокусируясь на генерации реактивных видов кислорода (ROS), апоптозе, морфологических изменениях и остеогенном дифференцировании. Оба НЧ индуцировали ROS в концентрационно-зависимом режиме, приводя к апоптозу и изменённой морфологии клеток при высоких концентрациях. Высокие дозы также нарушали остеогенное дифференцирование, при этом ZrO₂ НЧ демонстрировали более выраженную токсичность, чем TiO₂ НЧ. Эти находки подчёркивают необходимость тщательного управления дозой при рассмотрении ZrO₂ наночастиц в биомедицинских приложениях.

Введение

Инженерные наночастицы (НЧ) проникли в различные секторы, от электроники до медицины. ZrO₂ НЦ, ценные за свою механическую надёжность, теперь широко используются в биосенсорах, онкотерапии, имплантах и стоматологических материалах. Несмотря на их преимущества, расширяющееся применение ZrO₂ НЧ поднимает обоснованные опасения о потенциальных рисках для здоровья и окружающей среды. Существующие токсикологические данные скудны и иногда противоречивы: некоторые исследования сообщают об отличной биосовместимости по сравнению с другими оксидами, такими как оксид железа, TiO₂ или ZnO, в то время как другие обнаруживали мягкую цитоксичность или клеточный ущерб.

Предыдущая работа также демонстрировала, что наночастицы могут улучшать остеогенное дифференцирование в остеобластах. Тем не менее, профиль безопасности ZrO₂ НЧ, особенно в отношении функции костных клеток, остаётся неясным. Это исследование оценивает цитоксические эффекты ZrO₂ НЧ на клетках 3T3-E1, используя TiO₂ НЧ как хорошо охарактеризованный контроль. Оценяемые исходы включают клеточную жизнеспособность, ROS продукцию, апоптоз, морфологию и остеогенные маркеры.

Материалы и методы

Подготовка и характеристика наночастиц

TiO₂ (CAS 637262) и ZrO₂ (CAS 544760) НЧ приобрели у Sigma-Aldrich и охарактеризовали передаточной электронной микроскопией (TEM), зета-потенциалом и динамическим рассеянием света (DLS). TEM дала морфологию и первичный размер частиц, в то время как DLS оценила агломерацию в полном культурном milieux. Перед воздействием на клетки НЧ ультразвуково обрабатывали 30 мин и разбавляли до нужных концентраций в α-MEM.

Культура клеток 3T3-E1

Клетки 3T3-E1 поддерживали в α-MEM с 10% FBS и 1% антибиотик/антимикотик, при 37 °C, 5% CO₂. Среду обновляли через день.

Анализ пролиферации клеток

Клеточную жизнеспособность kvantifировали CCK-8 анализом. Клетки (5 × 10³ на ячейку) воздействовали TiO₂ или ZrO₂ НЧ (0–150 мкг/мл) в течение 24 или 48 ч, с или без 10 мМ N-ацетил-L-цистеина (NAC). После 2 ч инкубации с CCK-8 реактивы переносили в свежую пластинку для избежания НЧ интерференции, и абсорбцию измеряли при 450 нм.

Апоптоз анализ Annexin V

После 48 ч воздействия клетки собирали, окрашивали FITC-Annexin V и йодидом пропидия, и анализировали потоковой цитометрией для квантификации раннего и позднего апоптоза.

Анализ генерации ROS

Внутриклеточные ROS измеряли DCFH-DA после 48 ч воздействия НЧ (0–100 мкг/мл). Флуоресценцию детектировали потоковой цитометрией.

Конфокальная микроскопия

В 24 ч клетки на стеклышках фиксировали, пермеабилизировали и окрашивали для α-тюбулина (зелёный), F-актина (красный) и ядер (синий). Визуализацию проводили на Olympus FV10i конфокальном микроскопе.

Детекция индукции минерализации

Клетки культивировали 7, 14 или 21 день с 10 или 100 мкг/мл НЧ, затем фиксировали и окрашивали альцизарновым красным S для визуализации минерализованных нодулов.

Извлечение РНК и RT-PCR

Общая РНК изолировали, обраттранскрибировали и kvantifировали SYBR-green RT-PCR. Остеогенные гены (RUNX2, COL1α1, ALP, OPN, OCN, BSP) изучали на днях 3, 7, 14 и 21.

Статистический анализ

Данные выражены как среднее ± SEM. ANOVA с пост-хок тестами Бонферрони или Даннета T3 оценивали значимость (p < 0,05).

Результаты

Характеристика наночастиц

TEM раскрыл TiO₂ и ZrO₂ НЧ как стержнево-сферические с первичными диаметрами 25,4 ± 2,8 нм и 31,9 ± 1,9 нм соответственно. DLS показала гидродинамические размеры 81,2 нм (TiO₂) и 93,1 нм (ZrO₂), указывая на умеренную агломерацию в среде. Зета-потенциалы +32,9 мВ (TiO₂) и +42,4 мВ (ZrO₂), предполагая хорошую коллоидную стабильность (Рис. 1).

Рисунок 1. (a) TEM изображения TiO₂ и ZrO₂ НЧ. (b) DLS распределение размеров. (c) Распределение НЧ на клетках 3T3-E1 после 1 ч воздействия.

Оценка цитоксичности

CCK-8 анализы не выявили значительной токсичности при 10 мкг/мл для любого НЧ. Жизнеспособность снижалась при концентрациях выше 20 мкг/мл, достигая <50% при 150 мкг/мл после 48 ч (Рис. 2). NAC частично восстанавливал жизнеспособность, подтверждая участие ROS.

Рисунок 2. Клеточная жизнеспособность после воздействия TiO₂ (a) и ZrO₂ (b) НЧ, с и без NAC.

Генерация ROS

Оба НЧ индуцировали ROS в концентрационно-зависимом режиме, с пиком при 100 мкг/мл после 48 ч. ZrO₂ НЧ производили более высокие уровни ROS при более низких концентрациях, чем TiO₂. NAC эффективно подавлял ROS (Рис. 3).

Рисунок 3. Уровни ROS после воздействия НЧ.

Апоптоз и некроз

Потоковая цитометрия указала на дозо-зависимый апоптоз. При 50 мкг/мл поздние апоптотические/некротические клетки выросли до 43% (ZrO₂) и 29% (TiO₂). При 100 мкг/мл ранний апоптоз был более выражен при TiO₂ (34%) по сравнению с ZrO₂ (17%) (Рис. 4).

Рисунок 4. Профили апоптоза и некроза после воздействия НЧ.

Морфологические изменения

Конфокальная визуализация раскрыла минимальные изменения при 10 мкг/мл. При 100 мкг/мл клетки сжимались, демонстрировали округлую морфологию и показывали разрушенные актиновые филаменты и микротрубки. Количественный анализ подтвердил уменьшение площади клетки (Рис. 5).

Рисунок 5. Изменения площади клетки после 24 ч воздействия.

Рисунок 6. Цитоскелетная организация после НЧ обработки.

Минерализация

Альцизарновый красный окраски не показали значительной минерализации при 10 мкг/мл за 14–21 день. При 100 мкг/мл минерализованные нодулы были уменьшены и менее определённые, указывая на нарушенную остеогенную способность (Рис. 7).

Рисунок 7. Альцизарновый красный окрас минерализованных нодулов.

Генная экспрессия

RT-PCR раскрыл регуляцию вверх RUNX2, COL1α1 и ALP при 10 мкг/мл, с пиком на 3 день. Высокодозное (100 мкг/мл) воздействие регулировало вниз эти гены к 7 дню. Позднефазовые маркеры (OPN, OCN, BSP) были увеличены при 10 мкг/мл, но подавлены при 100 мкг/мл (Рис. 8).

Рисунок 8. Остеогенная генная экспрессия во времени.

Обсуждение

Наши данные подтверждают, что ZrO₂ НЧ биосовместимы при низких концентрациях, но становятся цитотоксичными выше 20 мкг/мл, преимущественно через ROS-опосредованный апоптоз и цитоскелетное разрушение. По сравнению с TiO₂, ZrO₂ оказывает более сильное оксидативное напряжение и более быстрый апоптоз при эквивалентных дозах. Наблюдаемое ROS производство, вероятно, происходит от взаимодействия наночастиц с митохондриальными мембранами, согласуясь с предыдущими отчётами об органелльном ущербе ZrO₂.

Нарушение остеогенного дифференцирования при высоких дозах НЧ согласуется с уменьшенной минерализацией и регуляцией вниз ключевых остеогенных генов. Эти находки подчёркивают важность оптимизации дозы для любого ZrO₂-базированного биоматериала, особенно в нагрузочных имплантах, где остеоинтеграция критична.

Заключение

Наночастицы оксида циркония в целом безопасны для костных клеток при низких концентрациях, но демонстрируют дозо-зависимую цитоксичность, генерацию ROS, апоптоз и подавление остеогенеза при более высоких уровнях. Эти инсайты необходимы для рационального проектирования ZrO₂-содержащих биоматериалов.

Аббревиатуры

Ag:

Серебро

ALP:

Щёлочная фосфатаза

Col1α1:

Коллаген 1α1

DLS:

Динамическое рассеяние света

FBS:

Фетальная грызунья сыворотка

NAC:

N-ацетил-L-цистеин

NPs:

Наночастицы

OC:

Остеокалцин

OD:

Оптическая плотность

OPN:

Остеопонтин

PBS:

Фосфатно-буферный раствор

ROS:

Реактивные виды кислорода

RUNX2:

Runt-связанный транскрипционный фактор 2

Si:

Кремний

TEM:

Передаточная электронная микроскопия

TiO₂:

Диоксид титана

ZrO₂:

Оксид циркония

α-MEM:

Минимальная существенная среда альфа