Синтез наночастиц золота с использованием экстракта мимозы tenuiflora, оценки цитотоксичности, клеточного поглощения и катализа

Введение

Опосредованный растениями биосинтез наноматериалов - это экологически чистый метод, который позволяет синтезировать НЧ в одном горшке. Это связано с тем, что те же биовосстанавливающие агенты экстрактов растений действуют как стабилизирующие агенты для образующихся частиц с низким содержанием токсичных соединений [1,2,3]. В этом смысле Mimosa tenuiflora (Mt) кора имеет высокое содержание конденсированных танинов, которые имеют структуру из четырех флавоноидных единиц [4], сапонинов, глюкозы, алкалоидов ( N , N -диметилтриптамин) и крахмал [5,6,7,8]. Эти соединения (конденсированные танины) могут действовать как восстановители ионов металлов, но, в частности, флавоноиды связаны с комплексообразованием металлов [4].

Этаноловый экстракт Mt использовался в качестве антибактериального средства для грамотрицательных, грамположительных и дрожжевых [9]. Также как противопротозойное средство (с использованием флавоноидов листьев и цветов Mt) [10] и для регенерации кожи [6]. Кроме того, он может излечивать серьезные кожные язвы, свойства которых были приписаны молекулам и полифенолам коры Mt [11]. Растительные экстракты проявляют свойства антиоксидантов и, в частности, содержат полифенолы, которые используются в зеленом синтезе металлических НЧ, таких как Au, Ag, Fe, Pt, Pd, Cu, их сплавы и оксиды [12, 13]. Оптические свойства систем НЧ, такие как резонансная частота поверхностного плазмонного резонанса (ППР), зависят не только от внутренних характеристик наноматериалов (размер, форма, диэлектрическая проницаемость), но и от свойств окружающей среды, окружающей НЧ, в качестве растворителя, в котором они находятся. дисперсный или природа стабилизирующих молекул, которые покрывают НЧ. Эти параметры имеют решающее значение для определения положения пика SPR в системах NP [14,15,16].

С одной стороны, каталитические свойства AuNP описаны в нескольких работах, связанных с деградацией органических соединений, таких как пестициды, фенольные соединения и красители [17,18,19], и используются в каталитических процессах, связанных с восстановлением окружающей среды, например, как очистка загрязненной воды [20]. В последние годы появилось несколько отчетов о AuNP, синтезированных с экстрактами растений, таких как черный кардамон [21], и оценках каталитической активности при разложении красителей, используемых в промышленности, таких как метиленовый синий (MB) [22], метиловый оранжевый [19] или родамин. В [23]. Однако, в противоположном направлении, в некоторых работах сообщается, что НЧ, покрытые стабилизирующими молекулами, проявляют плохую каталитическую активность из-за участков, доступных для катализа, на поверхности НЧ, занятой органическими молекулами [24, 25]. Кроме того, AuNP используются в качестве молекулярных сенсоров, например, для колориметрического обнаружения ионов токсичных металлов [7] и терапевтических (терапевтических и диагностических) приложений [26].

Функционализированные AuNP с молекулами на поверхности демонстрируют оптические и биологические свойства, связанные с составом, толщиной, организацией и конформацией, которые определяют их особенности [27]. Нанотехнология сталкивается с различными проблемами, такими как агрегация AuNP в кровотоке [28]. AuNP в концентрации менее 20 мкг / мл и размером около 20 нм не проявляют цитотоксических эффектов в линиях здоровых и злокачественных клеток, и их использование позволило проанализировать взаимодействие между NP и клетками [13, 29, 30]. Затем нанотехнологии предлагают возможность взаимодействовать в одном масштабе с клеточными рецепторами [31], что позволяет узнать о клеточных процессах [32, 33] и антимикробных свойствах [34], например, при окислительном стрессе, которые генерируют каскад передачи сигналов для различные эффекты, такие как цитотоксичность или ответ антиоксидантной защиты [35]. Кроме того, функционализированные AuNP действуют как переносчик лекарств, гена или белка [36] и биомедицинских приложений [37, 38]. Более того, лиганды AuNPs в качестве белков и полимеров создают химическую среду, которая способствует интернализации NPs, чтобы достичь цитоплазмы, ядра или выйти за пределы мембраны [39].

В данной работе AuNP были синтезированы с использованием богатого полифенольным экстрактом коры Mt. Цитотоксичность AuMt оценивали в клетках HUVEC, а интернализацию клеток контролировали с помощью конфокальной микроскопии через 24 часа. Каталитическая активность AuMt в отношении разложения МБ в присутствии боргидрида натрия (NaBH ₄ ) при комнатной температуре. Наши результаты сравнивались с аналогичными работами по катализу с AuNP, синтезированными «зелеными» методами.

Материалы и методы

Материалы и химические вещества

Для синтеза AuMt 15 г коры Mt дерева разрезали на кусочки и помещали в колбу на 100 мл. Добавляли семьдесят миллилитров этанола (Fermont, чистота 99%) и 30 мл сверхчистой воды (18 МОм, Millipore), затем покрывали алюминием и оставляли при комнатной температуре на 15 дней. Раствор фильтровали с использованием фильтровальной бумаги Whatman (8 мкм), а затем с помощью acrodisc (0,20 мкм). Полученный раствор использовали как восстановитель (экстракт Mt) для синтеза AuMt. Часть фильтрата выпаривали на роторном испарителе, а затем лиофилизировали для анализа DPPH и общего количества полифенолов и построения калибровочной кривой для экстракта Mt. Концентрация экстракта Mt составила 32,5 мг / мл, определенная по калибровочной кривой. Тетрахлорозавровая кислота (HAuCl ₄ , Sigma-Aldrich чистотой 99%) был использован в качестве металлического прекурсора. Концентрации предшественников, используемых в синтезе, составляли 5,3 мМ для AuMt1 и 2,6 мМ для AuMt2. Объем восстанавливающего агента поддерживали постоянным (1,6 мл), а образец общего объема доводили до 6 мл сверхчистой водой. Дополнительный файл 1:Таблица S1 показывает составы, используемые в синтезе AuMt1 и AuMt2, а также значения pH для каждого реагента. Синтез проводили при 25 ° C в лабораторных условиях освещения. Использовался следующий протокол. В пробирку на 50 мл добавляют раствор экстракта Mt, затем сверхчистую воду и, наконец, раствор предшественника золота, немедленно перемешивая в вортексе при 3000 об / мин в течение 10 с. Синтез AuMtNP был визуально подтвержден в течение нескольких минут по изменению окраски смеси. Процесс очистки НЧ состоит из центрифугирования суспензии при 14000 об / мин в течение 1 ч, удаления надосадочной жидкости, добавления воды и диспергирования ультразвуком, повторяя процесс дважды. После добавления этанола AuMt снова диспергируют ультразвуком и центрифугируют при 14000 об / мин в течение 1 часа. Супернатант отбрасывают, осаждают и сушат в печи при температуре 40 ° C. Затем полученный нанокомпозит состоит из AuNP с молекулами экстракта Mt на поверхности.

Зависимое от времени изменение pH синтеза AuMtNP

PH синтеза AuMtNP измеряли по мере проведения реакции. Для этого использовался многопараметрический настольный измеритель pH / проводимости (Orion ™ VERSA STAR ™). Прибор калибровали при 25 ° C с использованием стандартного буферного раствора для калибровки при pH =4,01. Рециркуляционная баня использовалась для контроля температуры образцов на уровне 25 ° C (± 0,1 ° C) во всех измерениях. pH измеряли, поскольку реакцию проводили в течение 180 с сразу после смешивания реагентов. Это же устройство использовалось для измерения pH реагентов.

УФ-видимые спектры, 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил (DPPH) и анализ общего количества полифенолов

Двухлучевой УФ / видимый спектрометр Perkin-Elmer Lambda 40 использовали для получения спектра УФ-видимого экстракта в диапазоне измерений 200-400 нм со скоростью сканирования 240 нм / мин. ППР AuMt контролировали в диапазоне от 250 до 875 нм.

Кинетику образования AuMt определяли путем измерения оптической плотности при 550 нм каждую секунду, в то время как реакция синтеза НЧ развивалась внутри кварцевой ячейки при магнитном перемешивании.

Для тестов DPPH все тесты были выполнены в трех экземплярах. Были протестированы различные концентрации экстракта Mt (25, 12,5, 6,25 и 3,125 мкг / мл). Сто микролитров этанола добавляли к 100 мкл каждой концентрации в дополнение к раствору DPPH (300 мкМ). Затем образцы инкубировали в течение 2 ч в темноте перед измерением оптической плотности при 517 нм. Результаты сравнивали с витамином С и катехинами (70 мкмоль / л), и обе молекулы использовали в качестве контроля. Для улавливания активности в качестве холостого опыта использовали радикал DPPH, растворенный в этаноле [40, 41]. Процент поглощающей активности рассчитывали по формуле. (1).

где образец абсорбция образца и контроль это пустая абсорбция. Данные были проанализированы с использованием дисперсионного анализа (ANOVA) с тестами множественного сравнения Тьюки.

Для анализа общего количества полифенолов использовали те же концентрации, добавляя 0,25 N Folin-Ciocalteu и 5% карбоната натрия с 1-часовой инкубацией в отсутствие света. Поглощение измеряли при 750 нм. Результаты выражены в эквивалентах галловой кислоты [42, 43].

Определение дзета-потенциала и размера DLS

Дзета-потенциал (ζ) наночастиц измеряли с помощью Zetasizer NS (Malvern, PA), а размеры измеряли с помощью динамического рассеяния света (DLS) Zetasizer NS (разрешение 0,5 нм). Прибор рассчитывает ζ путем определения электрофоретической подвижности ( μ _e ) с использованием уравнения Генри. (2) [44]:

где ε , η , и f (ka) обозначают диэлектрическую проницаемость среды, вязкость среды и функцию Генри, соответственно. Два значения обычно используются в качестве приближения для f (ka) определение, либо 1,5, либо 1,0. Электрофоретические определения ζ обычно проводят в водном растворителе и умеренной концентрации электролита. е (ka), в этом случае, принимает значение 1,5 и упоминается как классическое приближение Смолуховского, уравнение. (3) [45].

Образцы помещали в U-образную складчатую капиллярную ячейку для ζ измерения. Каждый образец был измерен при комнатной температуре (25 ° C) в трех экземплярах.

Оценка стабильности NP в дополненной культуральной среде (s-DMEM)

Стабильность AuMtNP оценивалась в s-DMEM с помощью DLS и ζ . Гидродинамический диаметр (2R _H ) AuMt1 и AuMt2 измеряли при 37 ° C в сверхчистой воде и s-DMEM при концентрациях от 25 до 200 мкг / мл. Для AuMt1 и AuMt2 в s-DMEM, ζ измеряли при 37 ° C, чтобы установить, изменяет ли питательная среда поверхностный заряд NP. Наночастицы добавляли в пробирку Эппендорфа с предварительно термализованной s-DMEM и перемешивали в вортексе при 3000 об / мин в течение 30 с. Инкубацию при 37 ° C выдерживают в течение 15 мин, прежде чем проводить измерения при той же температуре.

Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (FTIR)

Экстракт Mt и AuMt FTIR получали с помощью Perkin-Elmer Frontier FTIR с использованием твердого образца. Спектр был получен в режиме пропускания при разрешении 2 см ^{- 1} , от 4500 до 500 см ⁻¹ .

Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия (XPS)

Эксперимент XPS проводился с использованием Perkin-Elmer (модель PHI 5100, разрешение основано на FWHM пика Ag3d5 / 2 0,80 эВ, двухстандартный анод источника XR (Mg / Al) и 15 кВ, 300 Вт, 20 мА ). Обзорный анализ сканирования проводился со скоростью сканирования 0,5 эВ / с. Для анализа с высоким разрешением использовалась скорость сканирования 0,025 эВ / с.

Просвечивающая электронная микроскопия (ТЕМ)

Для ПЭМ 10 мкл образца наносили на медные сетки, покрытые фомвар-углеродной пленкой (Electron Microscopy Sciences, 300 Mesh). Сетки оставляют сохнуть на 1 ч и помещают в вакуумную камеру на 12 ч. Оборудование для электронной микроскопии представляет собой автоэмиссионное оборудование Jeol 2010 F, работающее при 200 кэВ. Энергодисперсионная рентгеновская спектроскопия (EDS) - это детектор Bruker Quantax 200, охлаждаемый Пельтье и связанный с системой ПЭМ. Межплоскостные расстояния между кристаллическими плоскостями, обнаруженные с помощью ПЭМ высокого разрешения (ПЭМВР), были определены с помощью цифрового анализа микрофотографий (версия 3.0 Gatan).

Дифракция рентгеновских лучей

Данные были собраны с использованием системы дифрактометра Bruker D8 QUEST, оснащенной многослойным зеркальным монохроматором и запаянной трубкой CuKα Microfocus ( λ =1,54178 Å). Кадры были собраны в T =300 КБ по данным сканирования.

Цитотоксический эффект AuMt

Цитотоксический эффект AuMt оценивали в клетках HUVEC с использованием анализа 3- (4,5-диметилтиазолил-2) -2,5-дифенилтетразолийбромида (МТТ). Клетки выращивали на среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM, Sigma-Aldrich), с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (GibcoBRL) при 37 ° C и 5% CO ₂ . Клетки HUVEC подсчитывали в камере Нойбауэра, а жизнеспособность определяли с помощью теста исключения трипанового синего (Sigma-Aldrich).

Для анализа МТТ количество клеток доводили до 100000 клеток / мл, и 100 мкл на лунку помещали в 96-луночные планшеты. AuMt1 и AuMt2 оценивали при концентрациях 200, 100, 50 и 25 мкг / мл. Обработанные клетки инкубировали 24 и 48 ч при 37 ° C, 5% CO ₂ . . По истечении времени инкубации планшет промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), добавляли раствор МТТ и инкубировали в течение 4 часов. Диметилсульфоксид (ДМСО) добавляли для растворения кристаллов МТТ. Поглощение измеряли при 570 нм на многомодовом планшет-ридере (Synergy HTX, BioTek) с использованием программного обеспечения Gen5. Жизнеспособность клеток была рассчитана с использованием уравнения. (4):

где образец абсорбция образца и контроль абсорбция холостого образца [46, 47].

Статистический анализ

Данные выражены в виде средних значений ± стандартное отклонение (SD). Существенные различия между группами анализировали с помощью теста Тьюки, однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) в зависимости от ситуации. P значения менее 0,05 считались статистически значимыми. Программное обеспечение Origin Pro 9.1 используется для управления данными, статистического анализа и построения графиков. Используемые знаки:* p <0,05. Сравнивали эффективность лечения (AuMt1 и AuMt2) и контрольной группы в течение 24 и 48 часов.

Для анализа живых / мертвых клеток HUVEC высевали на предметные стекла и обрабатывали AuMt1 и AuMt2. Через 24 часа инкубации слайды окрашивали с использованием набора для определения жизнеспособности / цитотоксичности живых / мертвых / цитотоксичности (ThermoFisher) в соответствии с рекомендациями производителя. Образцы исследовали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM800, Carl Zeiss).

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия:флуоресценция AuMt

Конфокальный микроскопический анализ проводили на приборе LSM 800 (Carl Zeiss, Йена, Германия), установленном на инвертированном микроскопе Axio Observer.Z1 (Carl Zeiss, Йена, Германия). Для исследования использовались три лазера с длиной волны 405, 488 и 640 нм с максимальной мощностью 5, 10 и 5 мВт соответственно. Флуоресценция регистрировалась с помощью высокочувствительных детекторов на основе GaAsP. Светлопольные изображения были получены путем сбора проходящего лазерного света на фотоумножителе (ФЭУ). Для флуоресценции AuMt, анализа живых / мертвых и распределения NP в исследовании клеток HUVEC использовали сухой объектив Plan-Apochromatic × 40 / 0,95. Для трехмерной реконструкции ячеек с AuMt использовался масляный объектив Plan-Aprochromatic × 63 / 1,40.

Для характеристики флуоресценции AuMt каплю 20 мкл коллоидной дисперсии NP наносили на покровное стекло и сушили при комнатной температуре перед анализом с помощью CLSM. Лазер с длиной волны 640 нм использовался в качестве источника возбуждения при мощности 0,5%, и флуоресценция регистрировалась между 650 и 670 нм. Светлопольные изображения AuMt формировали с помощью лазера с длиной волны 488 нм (мощность 0,2%) в режиме проходящего света. Флуоресценция и яркое поле были собраны на отдельных дорожках.

Интернализация сотовой связи

Для интернализации AuMt на клетках HUVEC ядро ​​окрашивали 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI), а актиновые волокна - антителом против β-актина, соединенным с флуоресцеин-5-изотиоцинатом (FITC), чтобы ограничить клеточную границу. . DAPI возбуждали лазером 405 нм при мощности 1,0%, а FITC - лазером 488 нм при 0,20% мощности. Эмиссия DAPI и антител против β-актина собиралась между 410 и 500 нм и 500-700 нм, соответственно. AuMt возбуждали лазером с длиной волны 640 нм (мощность 0,50%), и собирали эмиссию между 650 и 700 нм.

3D-реконструкции ячейки-AuMt и ортогональные проекции были сделаны из 30 изображений в режиме Z-стека (всего Z length =8 мкм), собирая флуоресценцию от DAPI, FITC и AuMt, как описано выше. Флуоресцентные сигналы собирались на отдельных дорожках для каждого Z должность. Для наглядности сигнал FITC был опущен при 3D-реконструкции.

Было проведено относительное сравнение клеточного поглощения наночастиц. Для этого средняя интенсивность флуоресценции AuMt1 и AuMt2 в клетках HUVEC была определена на основе анализа конфокальных изображений с использованием программного обеспечения ImageJ [48].

Катализ

Каталитическая активность по MB при концентрации 3,33 × 10 ⁻⁵ M, анализировали с помощью УФ-видимой спектроскопии. При гомогенном катализе 90 мкл НЧ (2 мг / мл) добавляли непосредственно в кварцевую ячейку, содержащую МБ и 200 мкл NaBH ₄ . в концентрации 100 мМ. Образец гомогенизировали перемешиванием магнитом внутри ячейки спектрофотометра. Реакцию проводили при 25 ° C.

Результаты и обсуждения

Синтез

При визуальном осмотре было обнаружено, что синтез НЧ происходит очень быстро в обеих системах. Наиболее интенсивный цвет системы AuMt1 показан на вставке Дополнительного файла 1:Рисунок S1 указывает на более высокое содержание НЧ из этого синтеза. Это связано с тем, что AuMt1 имеет двойную концентрацию металлического прекурсора по сравнению с AuMt2. В Дополнительном файле 1:Таблица S1 реагенты, используемые при синтезе наночастиц, имеют кислый pH. Дополнительный файл 1:На рисунке S1 показаны изменения pH в реакциях по мере проведения синтеза AuMtNP. Реакции начинаются в кислой среде (pH <2,65), и по мере развития синтеза НЧ кислотность растет. Это связано с депротонированием гидроксильных групп, присутствующих в полифенольных молекулах экстракта Mt. Фактически, это первая стадия процесса восстановления оксида, которая приводит к переносу электронов от депротонированной гидроксильной группы к Au ³⁺ ионы. В качестве продуктов окислительно-восстановительной реакции Au ³⁺ ионы восстанавливаются до атомов металла Au ⁰ и полифенольное кольцо, дающее 2 электрона, окисляется. Процесс описан на вставке Дополнительного файла 1:Рисунок S1.

Анализ УФ-видимого спектра, DPPH и общего количества полифенолов

УФ-видимый спектр экстракта коры Mt показан на рис. 1а, где сигнал состоит из четко определенной полосы с максимумом в 280 нм и шириной 50 нм. Этот спектр очень похож на описанный для Rumex hymenosepalus экстракт корня, который имеет высокое содержание полифенольных соединений [49]. Определение содержания полифенолов в экстракте коры Mt важно, потому что эти молекулы могут вносить значительный вклад в качестве восстановителей в синтез AuNP, обеспечивая необходимые электроны для восстановления Au ³⁺ ион в металлическое золото (Au ⁰ ). После образования наночастиц полифенольные соединения абсорбируются на их поверхности, обеспечивая стабильность наноматериалов.

Характеристика экстракта Mt. а Mt извлекает УФ-видимый спектр и b Ингибирование DPPH с помощью однофакторного анализа ANOVA (* p <0,05)

Для анализа DPPH было замечено, что для 12,5 мг / л экстракта Mt мы получили 50% -ное ингибирование (L50), подобное значениям, указанным для витамина С и катехинов (46 и 58%, соответственно). Это указывает на то, что экстракт Mt обладает антиоксидантной способностью, очень похожей на чистые соединения, используемые в качестве контроля, рис. 1b, где значимые различия (* p <0,05) от контрольных значений отмечены звездочкой. Значение 425 мг / г, полученное при анализе общего количества полифенолов, указывает на то, что почти половина экстрагированной массы эквивалентна галловой кислоте. Высокая антиоксидантная способность и высокое содержание полифенолов в экстракте Mt предполагают, что его можно использовать в качестве хорошего восстанавливающего и стабилизирующего агента для синтеза наноматериалов в рамках устойчивой химии [50, 51].

Характеристика

Кинетика образования и спектры UV-Vis AuMt

На рис. 2а показано изменение оптической плотности на пике ППР AuNP (550 и 560 нм для AuMt1 и AuMt2 соответственно) по мере того, как происходит реакция синтеза наноматериала. Экспериментальные данные согласуются с сигмоидальной функцией Больцмана [52], где наблюдаются как минимум три стадии роста. В первом случае поглощение медленно растет в начале реакции синтеза, когда Au ³⁺ ионы восстанавливаются до Au ⁰ и образуют агрегаты из нескольких атомов, которые соединяются, образуя небольшие НЧ. На втором этапе мелкие наночастицы увеличивают свой размер за счет автокаталитического роста, и оптическая плотность растет быстро. На последней стадии, при перекристаллизации НЧ, оптическая плотность достигает стационарной фазы. Как видно на рис. 2, максимальное поглощение достигается через 60 с для AuMt1 и 120 с для AuMt2. Интересно, что первая стадия роста составляет 20 с для AuMt1, в то время как для AuMt2 она почти равна нулю (менее 1 с), что объясняется более высокой долей восстанавливающих молекул (экстракта Mt) по сравнению с металлическим прекурсором. Это способствует быстрому образованию зародыша в НЧ AuMt2 по сравнению с AuMt1; тем не менее, следующая стадия роста НЧ для AuMt2 невысока, и получаются НЧ большего размера. Сообщалось, что синтез AuNP с использованием мальтозы и твин-80 в качестве стабилизатора демонстрирует кинетику роста со временем реакции, очень похожим на описанное в этой работе [53]. В другом отчете о зеленом синтезе [54] указывается, что самая низкая доля восстанавливающих агентов / агентов-предшественников генерирует НЧ меньшего размера.

УФ-видимая характеристика AuMt1 и AuMt2. а Кинетическая формация и b УФ-видимые спектры

На рис. 2б представлены характерные спектры поглощения AuMt в области 250–875 нм. ППР для AuMt1 показывает симметричную полосу с максимумом поглощения в 550 нм и шириной 200 нм. Пик плазмона AuMt2 претерпевает небольшое красное смещение, локализованное теперь на 560 нм с асимметричной полосой и большей шириной, чем 300 нм, что связано с разницей в размерах между двумя наноматериалами (d _AuMt1 AuMt2 ) _{1 2} . О подобном поведении сообщалось при синтезе AuNPs с цитратом натрия в качестве восстановителя, где красное смещение и уширение плазмонов приписываются более высоким модам колебаний, которые влияют на сечение экстинкции за счет увеличения размера NP [55]. Кроме того, оба спектра показывают полосу поглощения при 280 нм, соответствующую полифенольным молекулам экстракта, что позволяет предположить, что экстракт Mt действует как стабилизатор AuMtNP.

Размер, дзета-потенциал и стабильность AuMtNP

Размеры AuMtNP с помощью DLS и Z-потенциала были протестированы в разных условиях для одной концентрации (50 мкг / мл), как показано в таблице 1. AuMt1 и AuMt2 показали высокие отрицательные значения (≤ 30 мВ) в воде, что способствует электростатической стабильности обеих наночастиц. системы. Согласно Qu et al. [56], ζ значение постепенно увеличивается с размером NP; в нашем случае AuMt1 имеет меньший размер, чем AuMt2 в воде, размер которого контролируется синтезом НЧ. Эти значения размера совпадают с NP ζ значения, где более высокие ζ соответствует НП большего размера. Дзета-потенциалы ( ζ ) AuMtNPs, диспергированных в s-DMEM, показывают менее отрицательные значения по сравнению с полученными в сверхчистой воде (таблица 1). Это снижение может быть связано с присутствием катионов DMEM и присутствующими белками FBS, которые покрывают поверхности AuMtNP, что вызывает уменьшение электростатических взаимодействий. Несмотря на это ζ При уменьшении, значение остается близким к -25 мВ для обеих систем, что указывает на то, что наночастицы сохраняют свою электростатическую стабильность после инкубации s-DMEM [57]. Кроме того, в таблице 1 показаны результаты, полученные методом DLS для гидродинамических диаметров AuMtNP (2R _H ) измерено при 37 ° C в сверхчистой воде и питательных средах. В s-DMEM размер обеих систем увеличивался за счет адсорбции белка на поверхности наночастиц [58]. Для AuMt1 рост 2R _H за счет короны белка составляет 33,8 нм, а для AuMt2 - 42,9 нм. Ожидается, что чем больше размер наночастиц, тем больше будет поверхность для поглощения белка [59]. Этим можно объяснить немного меньшее значение ζ для AuMt2 по сравнению с AuMt1 в s-DMEM. Для AuMt1 и AuMt2 взаимодействие с белками s-DMEM происходит за счет молекул экстракта, которые прикреплены к поверхности наночастиц. Эти молекулы незначительно различаются между AuMt1 и AuMt2, как показано на результатах XPS. Мы также измерили pH растворов в том же диапазоне концентраций. Было обнаружено, что изменения pH не наблюдается, и его среднее значение было около 7,5 для AuMt в сверхчистой воде и 7,2 для s-DMEM (таблица 1).

Дополнительный файл 1. На рисунке S2 показаны гидродинамические диаметры AuMtNP при диспергировании в сверхчистой воде и s-DMEM при 37 ° C в диапазоне концентраций от 25 до 200 мкг / мл. Для каждой исследуемой системы гидродинамический диаметр не изменяется с концентрацией наночастиц, и только для AuMt2 s-DMEM при 100 мкг / мл размер частиц увеличивается по сравнению с наименьшей оцененной концентрацией, что может указывать на процессы агрегации НЧ при этих концентрациях. [32].

Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (FTIR)

Спектр FTIR, показанный на рис. 3, соответствует экстракту Mt, AuMt1 и AuMt2. Характерные широкие полосы с центром около 3250 см ⁻¹ связаны с фенольным ОН в основном из дубильных веществ и флавоноидов. Пики на 1594 см ⁻¹ соответствуют изгибной вибрации N-H при 1705 см ⁻¹ в кетон ациклическое растяжение и область между 1000 и 1300 см ^-1 до C – O протянуть. Пики в диапазоне от 1600 до 500 см ⁻¹ идентифицируются с полифенолами, сигналы на 1235 и 1160 см ^-1 связаны с растяжением ароматической связи C – O, а при 1020 см ⁻¹ растяжению алифатической полосы C – O и при 1235 см ⁻¹ особенно связаны с характеристикой циклической природы эфира. Эти сигналы могут быть связаны с наиболее распространенными соединениями в экстракте Mt, такими как танин мимозы, флавон-сакуранетин, тритерпеноиды, сапонины, халконы и N , N -диметилтриптамин алкалоид (дополнительный файл 1:рисунок S3). Образцы AuMt1 и AuMt2 имеют одинаковые характерные пики в области полифенолов, подтверждающие стабилизацию НЧ молекулами экстракта Mt [60]. Мы наблюдаем изменение на 1331 см ⁻¹ в полосе ширины и уменьшение интенсивности пика для AuMt1 и AuMt2 соответствует связи между AuNP и C-H группой полифенолов; 1723 см ⁻¹ сдвигается окислением полифенолов в карбоксильные соединения при восстановлении Au ³⁺ в Au ⁰ [51, 61, 62].

ИК-Фурье спектры. Экстракт Mt (зеленый), AuMt1 (черный) и AuMt2 (красный)

Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия (XPS)

При анализе сканирования XPS для AuMt1 и AuMt2 образцы четко показали присутствие кислорода (O 1 s ), углерод (C 1 s ) и золото (Au 4 f ), пики которых сосредоточены около 532, 284 и 85 эВ соответственно, как показано на рис. 4a, b. Эксперименты XPS с высоким разрешением были проведены для установления относительного количества различных функциональных групп молекул, покрывающих поверхности AuNP. Au4 f XPS-спектры высокого разрешения для AuMt1 и AuMt2 состоят из двух симметричных пиков, разделенных расстоянием 3,7 эВ (рис. 4б, д). Пики, связанные с 4 f _5/2 spin-orbital coupling are located on binding energy (BE) of 88.6 and 87.7 eV for AuMt1 and AuMt2, respectively. For 4f 7/2, spin-orbital coupling peaks are located on 84.9 and 84.0 eV. The link of intensities (I4f _7/2  > I4f _5/2 ) and location and separation (ΔBE = 3.7 eV) between peaks confirm that gold ions (Au ³⁺ ) are reduced completely to metallic gold Au ⁰ [63]. Au4f signals, for AuMt1, are slightly shifted (~ 0.9 eV) at higher energies with respect to sample AuMt2. This can be explained in terms of NP size differences between samples. AuMt1 has a half population of NPs with size less to 40 nm, while AuMt2 NPs have a mean diameter of 150 nm, determined by TEM. Peak shift for Au4f signals, due to the presence of small NPs, has been reported by other authors who relate the Au4f BE increase with decreasing NP size [64, 65]. Also, the shift effect could be due to the interaction of functional groups capped on surfaces of AuNPs [66]. In Fig. 4c, f, the high-resolution XPS spectra of C1s are shown for AuMt1 and AuMt2. Spectra were deconvoluted by 3 Gaussian bands associated with C=O, C–O, and C–C or C=C. For AuMt1, peaks are centered on 286.9, 286.1, and 284.5 eV, for AuMt2 on 287.0, 286.3, and 284.7 eV, respectively. Comparing the experimental XPS curves for C 1s , we see appreciable differences between AuMt1 and AuMt2. The main difference comes from a significant decrease in AuMt1 of the signal associated with C–O group. Comparing the percentage contributions of each group, obtained from the deconvolutions (Additional file 1:Table S2), we see that in AuMt2 contribution of C–O signal is 27.8% while in AuMt1 is 16.6%. This difference can be explained in terms of the oxide-reduction reaction that gives rise to the process of AuNP formation. The synthesis of AuMt1 is added twice the metal precursor (HAuCl₄ is 0.01 M) than in synthesis of AuMt2. In both cases, the same amount of extract is used as a reducing agent, so in AuMt1, more hydroxyl groups (−C–OH) are consumed to reduce a greater number of Au ³⁺ ions. Thus, a decrease of C–O signal in AuMt1 confirms that hydroxyl groups participate in the synthesis reaction. High-resolution XPS of O 1s revealed that carbonyl C=O is the most abundant group (Additional file 1:Figure S4 and Table S2). In addition, the content of the C=O group is higher in the AuMt1 sample, which confirms what was previously discussed.

XPS spectra of AuMt1 and AuMt2. а , d Survey spectra, b , e Au4f high resolution, and c , f C1s high resolution

XPS and FTIR indicate that AuMtNPs interact mainly with carbonyl groups (ketones) in addition to hydroxyl groups of Mimosa tannins, saponins, and other molecules that participate in the reduction of Au ³⁺ to Au ⁰ and stabilization of AuMtNPs [63, 67, 68].

Transmission Electron Microscopy

AuMt1 TEM micrographs are shown in Fig. 5a, b and AuMt2 in Fig. 5d, e showing products’ shape distribution. AuMt1 has the biggest diversity in shapes. AuMt shape is determined by the relationship between the variation of metal precursor concentration and Mt extract at a fixed concentration. In this case, NPs were observed without cleaning the extract to observe the interaction that forms around the AuMt. As observed in the micrographs, an extract is placed on the surface; however, NPs are kept dispersed and no aggregation is shown. Figure 5c, f show size distribution for each sample, and AuMt1 have an average size dispersion of 40 nm and AuMt2 of 150 nm.

Size distributions by TEM. а , b , c AuMt1 and d , e , f AuMt2

In Fig. 6a, AuMt TEM micrographs were also analyzed by EDS (Fig. 6b), which showed Au presence. Other chemical elements such as Cl, O, and Ca, on EDS spectrum, come from the extract that surrounds NPs. According to the crystallographic tab (JCPDS file:04-0784), the obtained distances between 2.35 and 2.03 Å (Fig. 6c) correspond to Au crystalline planes (111) and (200).

Nanostructural characterization of AuMt. а TEM, b EDS, c single HRTEM, and FFT and d XRD

X-ray Diffraction (XRD)

Figure 6d shows the characteristic AuMt XRD diffraction peak at 2Ɵ , which are in 38.17, 44.37, 64.81, and 77.66 ^o corresponding with the planes (111), (200), (220), and (311), respectively; these planes correspond with the face-centered cubic Au (space group Fm ³ m, JCPDS File No. 89-3722). High Score Plus and Origin software were used for the analysis [69].

Biological Tests

Cytotoxicity by MTT and Live/Dead Assay

To evaluate AuMt1 and AuMt2 toxicity, tests were performed on HUVEC cells using MTT. Four concentrations and two times for both materials were evaluated. In Fig. 7a, it is observed that at 24 h for AuMt1, cell viability decreases between 10 and 20%, only in concentrations higher than 25 μg/mL. For AuMt2, a similar effect is obtained in cell viability; however, the concentration of 100 μg/mL seems to have no effect on these tests. In Fig. 7b, MTT tests at 48 h for AuMt1 and AuMt2 are shown. For AuMt1, it is easy to notice that concentration with the greatest effect is 50 μg/mL, where the viability drops almost 30% compared to the control. The concentration of 50 μg/mL seems to be the concentration with the highest toxic effect; however, when the obtained data were analyzed, it is found that there is no significant difference between the obtained data on 24 and 48 h, a similar result obtained for 100 and 200 μg/mL, Fig. 7c. For AuMt2, a toxic effect between 20 and 30% is observed only on 100 and 200 μg/mL, while 25 and 50 μg/mL show no significant difference, compared to the observed effect at 24 h, Fig. 7d. This seems to correlate with AuMt2 size growth in s-DMEM (Additional file 1:Figure S2) where at a concentration of 100 μg/mL, they begin to aggregate. In the work published by Chandran et al. [70], they used gold nanoparticles coated with branched polyethyleneimine (BPEI), lipoic acid (LA), and polyethylene glycol (PEG), where they see an important toxicity in HUVEC cells by nanoparticles coated with BPEI, which have sizes of 40 and 80 nm, where viability is between 20 and 30%. When these particles are covered with human serum proteins, it is found that toxicity decreases; this is due to the corona effect. Recently, Zhaleh et al. [71] have reported the biogenic synthesis of 40-nm gold nanoparticles using leaf extracts from Gundelia tournefortii L. plant. Interestingly and in contrast to our results, the authors indicate that MTT cell viability tests for these particles in HUVEC, the cell viability was 95% at 1000 μg/mL; however, they do not establish if the low cytotoxicity is due to the fact that there is no material internalization or if the particles are harmless due to protein corona. In this sense, bioreductive compounds present in Gundelia tournefortii L extract are different from those reported for Mimosa tenuiflora extract (Additional file 1:Figure S3). Thus, the interactions of these two nanoparticle systems with proteins present in FBS are very different, which may explain the differences in cytotoxic responses.

Viability assay using MTT in HUVEC cell. а For 24 h and b 48 h. 0ne-way ANOVA analysis with (*p <0,05). Comparison between 24 and 48 h for c AuMt1 and d AuMt2 with ANOVA analysis with Tukey tests (n.s. no significance and (*p  < 0.05))

As mentioned above, AuMt1at a 50-μg/mL concentration shows the highest toxicity and cellular uptake. We believe that toxicity may be due to the fact that the nanomaterial has a low affinity to s-DMEM proteins, since it has only 16.6% of hydroxyl groups on the surface to promote hydrogen bonding with S-DMEM proteins. The fact that the material toxicity decreases as AuMt1 concentration increases may be due to a cellular detoxification response, like an exocytosis caused by high intracellular content of gold [70]. For AuMt2, the toxicity effect at 100 and 200 μg/mL may be due to nanomaterial agglomeration, which could be attaching to the membrane causing adverse effects for the cells; however, more experiments are required to confirm this hypothesis.

Only one concentration (50 μg/mL) was chosen to be evaluated by live/dead fluorescent dye; this is due to the purpose of confirming the MTT results and later analyzing the metallic NP internalization in HUVEC cells, avoiding a field saturation by NPs. When cells were stained with live/dead fluorescent dye kit, it was found that a large part of the cell population favorably marked for calcein and just a few for ethidium homodimer, indicating that cell culture is viable, as shown in Fig. 8.

Live/dead assay in HUVEC cells. а , d , и g with calcein; б , e , и h with ethidium homodimer; и c , f , и я merge by confocal microscopy

Confocal Laser Scanning Microscopy:Fluorescence of AuMt

In Fig. 9a, d are shown micrographs of AuMt1 and AuMt2 in bright field and in Fig. 9b, e, their corresponding fluorescence, captured by confocal microscopy. Red fluorescence of AuMt (collected emission 650–700 nm) was excited employing 640 nm diode laser, and a mayor size of NPs can be appreciated in AuMt2 sample than AuMt1. In the merge images in Fig. 9c, f, it can be observed how the luminescence comes exclusively from the dark points associated with the NPs. This indicates that the cleaning process effectively removed the extract that is not complexed to the nanomaterial, so there is no background emission. It is interesting to observe that an intense fluorescence of the NPs captured by the confocal system is achieved at a very low excitation power of the laser (below 0.5 mW). So, this NPs system can be fluorescently traced efficiently in cellular systems with little risk of phototoxicity. Some authors have reported fluorescent emission about 610 nm, suggesting intrinsic Au fluorescence [72, 73]. AuNPs emission is related to the core size confinement effect that generates discreet electronic states [74]. However, in our case, the metal surface is covered with flavonoids, which show fluorescence, and when complexing with AuNPs, the fluorescence of both is enhanced. Different authors have reported that fluorescence is largely enhanced by charge transfer from the surface ligands to the metal core via S–Au bonds [75]. It has also been reported that ligands (thiol molecules, DNA oligonucleotides, dendrimers, polymers, peptides, and proteins) affect AuNPs optical and electronic properties since its fluorescent properties can be significantly affected by their surface chemistry [76].

AuMt1 and AuMt2 fluorescence. а , d Bright field. б , e Confocal. c , f Merge

Cellular Internalization

Cells were also analyzed, by confocal microscopy, after 24 h incubation, with AuMt1 and AuMt2 at a concentration of 50 μg/mL. The nucleus is shown in blue color using DAPI Fig. 10a, and the cytoskeleton structure was stained with anti-beta actin in green color Fig. 10b and merge Fig. 10c. The observed micrographs were obtained through 3 different channels on separate tracks, where the excitation wavelengths were 405, 488, and 640 nm for DAPI, anti-beta actin, and AuMt, respectively.

AuMt1 and AuMt2 cellular internalization. а , d , и g with DAPI; б , e , и h with beta-actin; и c , f , и я merge by confocal microscopy

As previously described, cells were also analyzed by confocal microscopy, for AuMt1 and AuMt2 internalization, at a concentration of 50 μg/mL. Confocal micrographs show that AuMt are internalized in HUVEC cells cytosolic space, and many of these particles are surrounding the nucleus, without being internalized in it. When not observing particles in the nucleus, a more meticulous analysis was carried out, by cell orthogonal projection and a 3-D reconstruction. Observing the micrographs of both reconstructions, it is possible to notice that AuMt is distributed differentially. In Fig. 11a, b for AuMt1, it can be observed that a material is dispersed in the cytoplasm, while in AuMt2, the material is concentrated in the nuclear periphery, as shown in Fig. 11c, d. We were not able to find NPs in the nucleus, and this suggests that the nanomaterial has little or no genotoxic potential, since it has no way of interacting with nuclear DNA, which is a quality for a nanocarrier. Efficient cellular uptake depends on NP size, shape, charge, and coating, the parameters that can affect their interactions with cell proteins. The fact that polyphenolic compounds are found on AuMt surface could facilitate the nanomaterial internalization, which would make it a candidate as a possible pharmacological nanocarrier [77,78,79].

Orthogonal projections and 3-D images. а , c AuMt1 and AuMt2 cellular internalization analysis through orthogonal projection and b , d 3-D reconstruction by confocal microscopy

The obtained results for an AuMtNP cellular uptake in HUVEC by a confocal microscopy at 50 μg/mL suggests that AuMt1 interacts with the cells in a greater quantity than AuMt2 in a 3:1 ratio, as seen in Additional file 1:Figures S5–S7. If we consider that protein corona in AuMt1 is 9.1 nm smaller than in AuMt2, we can suggest that AuMt1-efficient internalization by HUVEC cells is given by a combination of factors such as AuMt1 smaller size, the highest absolute value of z potential and the lower thickness of protein corona. This indicates a poor protein coverage that allows partial exposure of the nanoparticle surface, which is rich in extract molecules. Therefore, nanoparticles can interact by means of extract molecules with surface-specific membrane receptors that facilitate the internalization of AuMt1.

Catalytic Tests

Catalysis

Analysis of catalytic reaction was realized to calculate the degradation percentage ( %D) using the Eq. (5):

using the A ₀ absorbance at t  = 0 and A is the absorbance at time t . Langmuir-Hinshelwood equation was used to calculate the slope of the regression plot \( \ln \left(\frac{A}{A_0}\right) \) versus irradiation time [80], which is expressed in Eq. (6) and K is the first-order rate constant of the degradation ratio:

For the analysis of catalytic activity on MB degradation, the absorbance at 660 nm was monitored. Figure 12 shows the AuMt1 and AuMt2 catalytic activity, where a decrease on maximum absorption of MB is observed as time progresses Fig. 12a, d. MB degradation and its conversion to leucomethylene is confirmed by progressive decreases of the absorbance at 292, 614, and 660 nm correspond to MB and by the increase in time of the absorbance at 256 nm associated with leucomethylene. Homogeneous catalysis reaches a 50% MB degradation at 190 s Fig. 12b, while the degradation ratio K for the total process is 8.24 × 10 ⁻³ s to AuMt1 Fig. 11c. AuMt2 reaches a 50% of MB degradation in 400 s, Fig. 12e, and K takes the value of 3.54 × 10 ⁻³ /s, Fig. 12f.

AuMt1 and AuMt2 Catalysis. а , d UV-Vis spectra. б , e Percentage. c , f Ratio of MB degradation

On this way, AuMt1 have a more efficient response than AuMt2. We observed a size-dependent effect (AuMt) in degradation ratio [81], and a total surface area of NPs is inversely proportional to the NP size [37]. Table 2 shows a comparison between different green syntheses of AuNPs and their K obtained in size function.

Conclusions

In this work, we show for the first time that the extracts of bark of Mimosa tenuiflora allow the production at room temperature of gold nanoparticles by means of one-pot synthesis. AuNP sizes are easily controlled by regulating a metal precursor/reducing an extract ratio. It was observed that AuMt1 and AuMt2 cellular uptakes generate a moderate cytotoxic effect at 24 and 48 h post exposition. However, toxicity does not behave in a dose-dependent manner, which suggests different action mechanisms for AuMt1 and AuMt2. XPS and FTIR indicate that AuMtNPs interact mainly with carbonyl groups (ketones) in addition to hydroxyl groups of Mimosa tannins, saponins, and other molecules that participate in the reduction of Au ³⁺ to Au ⁰ and stabilization of nanomaterials. Polyphenols adsorbed on AuMtNPs facilitate nanoparticle internalization. AuMt2 were located near the nuclear periphery, but for AuMt1, it was observed that nanoparticles distribute on the whole cell and present a 3 fold uptake in comparison to AuMt2. Due to the fluorescence property at low excitation power and a high cellular uptake, AuMtNPs synthesized with Mt bark extracts are candidates for its implementation as drug nanocarriers and fluorescent probes in cells. However, other strategies must be addressed, in order to reduce the nanomaterial toxicity. Finally, it was observed that AuMtNPs showed a relevant catalytic activity on MB degradation using NaBH4 as a reducing agent.

Доступность данных и материалов

All datasets are presented in the main paper.

Сокращения

ANOVA:

Analysis of variance

AuMt:

Colloids formed by AuNPs and molecules of Mt

AuNPs:

Наночастицы золота

CLSM:

Confocal laser scanning microscopy

DLS:

Динамическое рассеяние света

DMEM:

Среда Игла, модифицированная Дульбекко

DMSO:

Диметилсульфоксид

DPPH:

2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl

EDS:

Energy dispersive X-rays spectroscopy

FTIR:

Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье

HAuCl₄ :

Tetracloroauric acid

HRTEM:

High-resolution TEM

HUVEC:

Эндотелиальные клетки пупочной вены человека

МБ:

Methylene blue

Mt:

Mimosa tenuiflora

MTT:

3-(4,5-Dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide

NaBH₄ :

Sodium borohydride

PBS:

Физиологический раствор с фосфатным буфером

PdI:

Polydispersity index

PMT:

Photomultiplier tube

ROI:

Region of interest

SD:

Standard deviations

SPR:

Поверхностный плазмонный резонанс

ТЕМ:

Просвечивающая электронная микроскопия

УФ-видимый:

Видимость в ультрафиолете

XPS:

Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия

XRD:

Рентгеновская дифракция