Нацеленные на митохондрии и загруженные ресвератролом двойные функциональные нанолисты дисульфида титана для фототермической химиотерапии опухолей

Введение

Рак остается опасным для жизни заболеванием и является причиной высоких показателей смертности во всем мире [1]. Хирургия, химиотерапия, лучевая и гормональная терапия по-прежнему остаются основными терапевтическими методами, применяемыми в клинической практике [2, 3]. Из этих методов химиотерапия является широко приемлемым вариантом лечения как клиницистами, так и пациентами из-за ее относительно высокой эффективности [4, 5]. Химиотерапия связана с некоторыми серьезными проблемами, например, лекарственной устойчивостью, рецидивом опухоли и неспецифичностью [5,6,7]. Поэтому разработка новых химиотерапевтических агентов и стратегий для преодоления этих препятствий имеет большую актуальность [8]. В последние годы загрузка противоракового препарата на функционализированный носитель, который может одновременно обеспечивать целевую доставку и контролируемое высвобождение лекарства, стала популярным подходом для максимизации терапевтического эффекта и уменьшения побочных эффектов [9,10,11] . Большая удельная площадь, которая может обеспечить лучшее соотношение нагрузки лекарственного средства, важна для отличного носителя лекарственного средства [12].

Кроме того, для повышения специфичности лекарственного средства носитель обычно модифицируется с помощью молекулы, нацеленной на клетку, такой как нацеленная на рецептор клеточной поверхности фолиевая кислота и глутатион [13,14,15,16,17]. Поскольку многие химиотерапевтические препараты действуют на специфические субклеточные органеллы, разработка системы доставки, специфичной для органелл, может значительно усилить терапевтический эффект и уменьшить побочные эффекты [18,19,20]. Следовательно, выбор целевого участка внутри опухолевых клеток жизненно важен для системы доставки лекарств. Митохондрии являются не только «энергетической фабрикой» клеток, но также и ключевой мишенью химиотерапевтических препаратов, нацеленных на митохондрии, чтобы инициировать внутренний путь апоптоза [21,22,23]. Следовательно, разработка системы доставки противораковых лекарств, нацеленной на митохондрии, может иметь жизненно важное значение для более эффективной химиотерапии рака. К настоящему времени разработаны различные виды систем доставки лекарств, такие как мезопористый диоксид кремния, материалы на основе углерода и белок [17, 24, 25, 26]. Хотя сообщается, что эти носители эффективны для доставки лекарств и терапии опухолей, все еще очень желательны новые высокоэффективные системы доставки лекарств.

В этом исследовании мы сконструировали наноплатформу доставки лекарств, нацеленную на митохондрии и запускаемую БИК, на основе двумерного дисульфида титана (TiS ₂ ) нанолисты для контролируемой и таргетной химиотерапии опухолей. ТиС ₂ является членом дихалькогенидов переходных металлов, которые имеют большую удельную площадь [27,28,29]. После отшелушивания с помощью ультразвуковой обработки с протеином поверхность TiS ₂ Нанолисты можно модифицировать другими функциональными молекулами посредством ковалентных или нековалентных взаимодействий. Кроме того, для модификации TiS ₂ была выбрана специфическая для митохондрий опухоли молекула IR780 (йодид IR-780). нанолисты. IR780 наделяет нанолисты способностью нацеливания на митохондрии, которая осуществляется как за счет активного транспорта, опосредованного полипептидами, транспортирующего органические анионы, так и за счет свойства липофильных катионов [30, 31]. Сообщалось, что IR780 в качестве липофильного катиона демонстрировал большее накопление в митохондриях опухолевых клеток из-за высокой величины потенциала митохондриальной мембраны в опухолевых клетках, чем в нормальных клетках [32, 33]. Кроме того, IR780 также является фототермическим агентом, чувствительным к ближнему инфракрасному излучению. Готовая наноплатформа, получившая название IR780-TiS ₂ , было подтверждено, что он биосовместим и может эффективно загружать противораковый препарат ресвератрол (RV) (IR780-TiS ₂ / RV) [24]. IR780-TiS ₂ / RV обладал способностью нацеливаться на митохондрии и фототермическим эффектом. БИК применяли в качестве внешнего стимула для запуска местного высвобождения лекарственного средства при БИК-облучении. Эксперименты in vitro и in vivo показали, что IR780-TiS ₂ / РВ обладает высокоэффективным химиотерапевтическим действием. Дальнейшее изучение механизма показало, что гибель клеток, вызванная IR780-TiS ₂ / RV был через митохондриально-опосредованный внутренний путь апоптоза. Эта система доставки лекарств, нацеленная на митохондрии (схема 1), может стать потенциальным химиотерапевтическим агентом в будущем клиническом применении.

Схема приготовления IR780-TiS ₂ / RV, который использовался в качестве системы доставки лекарств, запускаемой ближним инфракрасным излучением, для химиотерапии опухолей, опосредованной внутренним путем апоптоза

Материалы и методы

Материалы

Sigma-Aldrich предоставила йодид IR-780 (IR780), TiS ₂ порошок, флуоресцеинизотиоцианат (FITC) (Сент-Луис, Миссури, США). Бычий сывороточный альбумин (BSA ≥ 98,0%) был приобретен у BioSharp Co., Ltd. (Корея). Набор для подсчета клеток-8 (CCK-8) был закуплен у Dojin Chemical Laboratory Co., Ltd. (Кумамото, Япония). Реагенты для клеточных культур, включая среду DMEM и фетальную бычью сыворотку (FBS), были предоставлены Gibco (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Химические вещества были получены от Sigma-Aldrich (Шанхай, Китай).

Синтез IR780-TiS ₂ / RV

Первым шагом было приготовление водорастворимого TiS ₂ нанолисты согласно предыдущему отчету [34]. Подробно, 5 мг TiS ₂ смешивали с 5 мл воды и перемешивали в течение 20 мин. ТиС ₂ Затем к 5 мг BSA добавляли водную суспензию и обрабатывали в ледяной бане с ультразвуковой диссоциацией с использованием ультразвуковой обработки на наконечнике 500 Вт и 20 кГц (Sonics, VCX130, США) в течение 6 часов. После этого приготовленную смесь центрифугировали при 12000 об / мин в течение 10 мин, в результате чего был получен TiS ₂ нанолисты в супернатанте.

Во-вторых, TiS ₂ нанолисты были конъюгированы с IR780. Триэтиламин (ТЭА) применяли в качестве связывающего кислоту агента. Пять миллиграммов IR780 растворяли в 2 мл ДМСО и перемешивали при 60 ° C в течение 8 часов с добавлением TEA. Суспензию смеси диализовали в дистиллированной воде в течение 2 дней, а затем центрифугировали при 9000 об / мин в течение 8 минут для удаления агрегированного продукта. Супернатант собирали, в результате чего получали IR780-TiS ₂ . .

Наконец, RV был загружен на IR780-TiS ₂ . IR780-TiS ₂ (1 мг / мл) смешивали с RV (2 мг / мл, растворенным в ДМСО), который слегка перемешивали в течение ночи при комнатной температуре. После этого ДМСО и свободный RV удаляли диализом в дистиллированной воде в течение ночи с получением IR780-TiS ₂ / RV. На основании литературных данных коэффициент загрузки RV, определяемый спектрофотометром UV-vis (UV-2550, Shimadzu, Япония), рассчитывается в соответствии со следующим уравнением:

где A _а (мг), А _б (мг) и A _c (мг) представляют начальную несвязанную RV и IR780-TiS ₂ соответственно.

Спектрометр Bruker TENSOR 27 для инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье (FTIR) (Bruker Optics Ltd., Ковентри, Великобритания) был использован для определения химической структуры TiS ₂ , IR780-TiS ₂ , и R780-TiS ₂ / RV. Анализ Брунауэра-Эмметта-Теллера (БЭТ) был проведен для определения удельной поверхности образцов, рассчитанной из N ₂ результат адсорбции с помощью анализатора площади поверхности (Quantachrome ChemBET-3000) на основе уравнения БЭТ.

Клеточная линия и клеточная культура

Клетки рака толстой кишки мыши CT26 были получены из банка клеток коллекции типовых культур Китайской академии наук (Шанхай, Китай). Клетки культивировали в полной среде DMEM (10% FBS + 90% DMEM) в увлажненном инкубаторе с 5% CO ₂ при 37 ° С.

Локализация in vitro IR780-TiS ₂ / RV

FITC использовался для маркировки IR780-TiS ₂ / RV или TiS ₂ / RV. Вкратце, FITC растворяли в растворе этанола (2,0 мг / мл) и смешивали с IR780-TiS ₂ / RV или TiS ₂ / RV водный раствор (1,0 мг / мл) при 4-часовом перемешивании в темноте при комнатной температуре. Смесь диализовали в дистиллированной воде в течение ночи для удаления избыточного FITC и этанола, в результате чего получали меченный FITC IR780-TiS ₂ / RV или TiS ₂ / Раствор на колесах. Чтобы подтвердить совместную локализацию наночастиц в митохондриях in vitro, клетки, обработанные FITC-меченным IR780-TiS ₂ / RV или TiS ₂ / РВ в течение 5 ч и окрашивали митохондриально-специфическим красителем MitoTracker. После этого клеточная интернализация IR780-TiS ₂ / RV или TiS ₂ / RV наблюдали с помощью CLSM (Ix81-FV1000, Olympus, Co.). Вкратце, клетки CT26 инкубировали с TiS ₂ , меченным FITC. / RV и IR780-TiS ₂ / РВ (с такой же концентрацией ФИТЦ) в течение 5 ч. Затем клетки обрабатывали растворами MitoTracker Red FM (100 нМ) при 37 ° C в течение 30 мин. После трехкратной промывки PBS клетки наблюдали с помощью CLSM. Программное обеспечение ImageJ использовалось для анализа интенсивности флуоресценции клеток.

Исследование химиотерапии опухолей и апоптоза, инициированных БИК, in vitro

4 × 10 ³ клеток / лунку Клетки CT26 в 96-луночных культуральных планшетах обрабатывали свободным RV, IR780-TiS ₂ , IR780-TiS ₂ / RV и TiS ₂ / RV с разными концентрациями RV в течение 5 часов, а затем были облучены с или без NIR в течение 3 минут (808 нм, 0,3 Вт / см ² ). После дополнительной 24-часовой инкубации жизнеспособность обработанных клеток анализировали с помощью анализа CCK-8. Обработанные клетки также окрашивали родамином123 (Sigma) и анализировали с помощью FCM (FC 500 MCL; Beckman Coulter, США). Обнаружение апоптоза клеток также выполняли с помощью анализа FCM с использованием набора для обнаружения апоптоза Annexin V-FITC / PI (Bender MedSystems, Вена, Австрия), как описано ранее.

Вестерн-блот

Клетки CT26 обрабатывали PBS (контроль), RV, TiS ₂ . / RV, IR780-TiS ₂ / RV и IR780-TiS ₂ / RV + NIR (эквивалент RV, 30 мкг / мл; эквивалент IR780, 0,5 мкг / мл) для 5-часовой инкубации. После дополнительной 24-часовой инкубации клетки собирали, соответственно, с помощью вестерн-блоттинга, который был основан на протоколе, описанном ранее [23]. Вкратце, клетки лизировали и ингибировали протеазой и Тритоном Х-100. Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия использовали для выделения и разделения белков, которые затем переносили на PVDF-мембрану и блокировали с использованием 5% обезжиренного молока. После этого разведенные первичные антитела инкубировали при 4 ° C в течение 12 часов, включая цитохром c (1/1000, Boster, Wuhan, China), расщепленную каспазу-3 (1/1000, CST), расщепленную каспазу-9 (1 / 1000, CST) и актин (1/1000, Mouse, Boster, Wuhan, China), а затем инкубировали со вторичным антителом. Наконец, для обнаружения белков использовали реагент ECL.

Модель животного

Для создания модели подкожной опухоли CT26, 1 × 10 ⁷ Клетки CT26 (100 мкл, в PBS) вводили подкожно в спину голых мышей Balb / c. Объем опухоли =длина × ширина ² / 2. Все процедуры с животными выполнялись в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Национального института здоровья и одобрены Комитетом по этике животных центральной больницы Чжумадянь (Хэнань, Китай).

Биораспространение In Vivo

Биораспределение IR780-TiS ₂ / RV у голых мышей с опухолью был обнаружен через 24 часа после внутривенной инъекции в хвост с помощью IR780-TiS ₂ / РВ (150 мкл, 6 мг / кг). Основные органы, включая сердце, печень, селезенку, легкие, почки и опухоль, взвешивали и переваривали раствором царской водки. Содержание элемента Ti в этих тканях было определено количественно методом ICP-OES.

Химиотерапия опухолей, инициированная БИК, in vivo

Мыши с опухолью CT26 были случайным образом разделены на шесть групп ( n =6), включая физиологический раствор, физиологический раствор + NIR, RV, IR780-TiS ₂ / RV, TiS ₂ / RV и IR780-TiS ₂ / RV + NIR (эквивалент RV, 1 мг / кг; эквивалент IR780, 0,5 мг / кг). Условия ближнего ИК-излучения:808 нм, 0,3 Вт / см ² . , и 3 мин. В течение 30 дней лечения объем опухолей и вес мышей регистрировали каждые 3 дня. После лечения органы, включая сердце, печень, селезенку, легкие и почки в различных группах, были зафиксированы и окрашены H&E.

Статистический анализ

Результаты представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Студенческий t Тест был использован для изучения значимых различий между двумя группами. P <0,05 считалось значимым, а P <0,01 считалось очень значимым.

Результаты и обсуждение

Подготовка и определение характеристик IR780-TiS ₂ / RV

Для приготовления IR780-TiS ₂ / РВ, во-первых, биосовместимый TiS ₂ Нанолисты были приготовлены с использованием бычьего сывороточного альбумина (BSA) и методом эксфолиации с помощью ультразвуковой обработки, как сообщалось ранее [34, 35]. Далее IR780-TiS ₂ был синтезирован в реакции замещения между атомом хлора IR780 и аминогруппами БСА, абсорбированного на TiS ₂ нанолисты с использованием кислотосвязывающего агента ТЕА. Наконец, IR780-TiS ₂ наноплатформа загрузила противораковый препарат RV посредством физического поглощения. Принципиальная схема IR780-TiS ₂ / RV показан на схеме 1. Дополнительный файл 1. На рисунке S1 показано ПЭМ-изображение расслоенного TiS ₂ с помощью белка. , который представлял собой отображаемую структуру нанолиста. Диаграмма XRD TiS ₂ также были обнаружены нанолисты, что свидетельствовало о хорошей кристалличности приготовленного TiS ₂ нанолисты, согласующиеся с наблюдениями с ПЭМ (дополнительный файл 1:рисунок S2). После функционализации IR780-TiS ₂ Нанокомпозит / RV имел чешуйчатую морфологию с шагом решетки 0,25 нм, как показано с помощью просвечивающей электронной микроскопии (рис. 1a, b), и средним диаметром около 123,6 нм и дзета-потенциалом -37,2 мВ по данным Nanosizer (Malvern Инструменты) (рис. 1в, г). После 2-недельного хранения в воде, FBS или физиологическом растворе средний размер IR780-TiS ₂ / RV оставалась постоянной на уровне примерно 123 нм (рис. 1e), что указывает на стабильность IR780-TiS ₂ / RV, возможно, из-за прилипания BSA к поверхности TiS ₂ нанолисты. На рисунке 1f показаны спектры поглощения свободного IR780, свободного RV, TiS ₂ . нанолисты и IR780-TiS ₂ / RV. Спектр поглощения IR780-TiS ₂ / RV показал пики свободного IR780 и свободного RV, что указывает на то, что и IR780, и RV были успешно конъюгированы с TiS ₂ нанолисты. Коэффициент загрузки RV IR780-TiS ₂ было около 112% ( W / Вт ), что было достигнуто за счет нековалентных взаимодействий (например, π - π стэкинг и гидрофобные взаимодействия). Кроме того, согласно результату BET, рассчитанная площадь поверхности составила 15,2 м ² . / г и 122,1 м ² / г для объемного TiS ₂ и TiS ₂ нанолисты соответственно. Отслоившийся TiS ₂ нанолисты показывают гораздо большую площадь поверхности по БЭТ, чем у объемного TiS ₂ , которые обеспечивают большую активную площадь для загрузки лекарственного средства. Нагрузка была высокой, вероятно, из-за большой удельной поверхности и адгезии BSA к IR780-TiS ₂ нанолисты [23]. Для дальнейшего подтверждения RV и IR780 были загружены в TiS ₂ нанолисты, ИК-Фурье спектры TiS ₂ нанолисты, IR780-TiS ₂ , и IR780-TiS ₂ / RV были измерены. В Дополнительном файле 1:Рисунок S6, все характерные пики TiS ₂ нанолисты появились в ИК-Фурье спектрах IR780-TiS ₂ / RV. Кроме того, появились три новых пика (~ 3191 см ⁻¹ , ~ 1510 см ⁻¹ , 1230 см ⁻¹ ) в спектре IR780-TiS ₂ / RV, что указывает на существование RV и IR780 [36, 37].

а ПЭМ изображение IR780-TiS ₂ / RV. б Электронно-микроскопическое изображение IR780-TiS ₂ с высоким разрешением. / RV. c Распределение по размерам и d Распределение дзета-потенциала IR780-TiS ₂ / RV. е Гидродинамическое изменение размера частиц IR780-TiS ₂ / RV в воде, FBS и физиологическом растворе в течение 2 недель. е Спектры поглощения RV, IR780, TiS ₂ нанолисты и IR780-TiS ₂ / RV

После 3-минутного облучения в ближнем инфракрасном диапазоне малой мощности (808 нм, 0,3 Вт / см ² ), IR780-TiS ₂ / RV температура раствора увеличивалась пропорционально концентрации IR780-TiS ₂ / RV (0, 5, 10 мкг / мл) и 10 мкг / мл IR780-TiS ₂ Раствор / RV достиг максимальной температуры 47,6 ° C (рис. 2а). Дополнительно IR780-TiS ₂ / RV сохранил свой первоначальный фототермический эффект даже после пяти циклов NIR-облучения, в то время как свободный IR780 показал пониженный фототермический эффект (рис. 2b). Эти результаты указывают на IR780-TiS ₂ / Нанокомпозит RV обладает высокой фотостабильностью.

а Фототермический эффект IR780-TiS ₂ / RV под БИК-излучением (808 нм, 0,3 Вт / см ² ) в течение 3 мин. б Изменение температуры IR780 и R780-TiS ₂ / RV после пяти циклов облучения NIR (808 нм, 0,3 Вт / см ² , 3 мин). c Схема выпуска РВ с фототермическим триггером. г Кинетика высвобождения RV из IR780-TiS ₂ / RV в буфере PBS (pH =7,4 и 6,5) с или без облучения NIR (808 нм, 0,3 Вт / см ² ). ** P <0,01 по сравнению с группой pH =7,4 и pH =6,5

Затем соотношение высвобождения RV было измерено в различных условиях pH и NIR-облучения (рис. 2c, d). Через 24 часа коэффициент высвобождения RV составлял 8,56% в физиологических условиях (pH 7,4), но он был значительно увеличен до 16,2% при pH 6,5, что указывает на то, что оно может быть увеличено в слабокислых условиях. Кроме того, коэффициент высвобождения правого желудочка снова был значительно увеличен до 44,8% при pH 6,5 и 3-минутном БИК-облучении (808 нм, 0,3 Вт / см ² ). Эти результаты демонстрируют, что ближнее инфракрасное излучение может быть управляемым внешним стимулом, запускающим высвобождение правого желудочка из IR780-TiS ₂ / RV. Этот эффект, вероятно, связан с теплом, выделяемым IR780-TiS ₂ при облучении БИК ослабляет нековалентные адсорбционные взаимодействия между RV и IR780-TiS ₂ поверхность [35]. Кроме того, в кислой среде H + может изменять поверхностный заряд TiS ₂ которые изменяют гидрофильный / гидрофобный баланс наночастиц [38, 39].

Локализация in vitro IR780-TiS ₂ / RV

Чтобы исследовать поглощение клетками и внутриклеточное распределение IR780-TiS2 / RV, IR780-TiS ₂ Наночастицы / RV были помечены FITC, и CLSM был использован для визуализации внутриклеточной флуоресценции. После 5-часовой инкубации TiS ₂ / RV и IR780-TiS ₂ / RV показал аналогичную интенсивность флуоресценции в цитоплазме (рис. 3a, b), что указывает на то, что оба нанокомпозитов могут проникать в клетки, вероятно, через эндоцитоз. Однако IR780-TiS ₂ Нанокомпозит / RV показал большую интенсивность желтой и зеленой флуоресценции, когда сигнал FITC был объединен с меткой MitoTracker (рис. 3a, c). Эти результаты показывают, что IR780-TiS ₂ / RV может с высокой эффективностью воздействовать на митохондрии. Дополнительно раздача IR780-TiS ₂ / RV в цитоплазме было дополнительно подтверждено с помощью ПЭМ, которая показала удерживаемые наночастицы в некоторых митохондриях (рис. 3d). Вместе эти результаты твердо подтверждают, что IR780-TiS ₂ / RV обеспечивает хорошее нацеливание на митохондрии, что дополнительно способствует накоплению митохондриальных лекарств, вызывая немедленную клеточную токсичность. Нацеливание на митохондрии, вероятно, было опосредовано как активным транспортом, опосредованным полипептидом, транспортирующим органические анионы, так и липофильным катионом, что заставляло наночастицы сильно накапливаться в митохондриях опухолевых клеток [30,31,32,33].

а Флуоресцентные изображения клеток CT26, инкубированных с FITC-меченным TiS ₂ / RV или IR780-TiS ₂ / РВ на 5 ч. Зеленая флуоресценция - это сигнал FITC, а красная флуоресценция - это сигнал MitoTracker. б Соответствующий анализ средней интенсивности флуоресценции (MFI) меченного FITC TiS ₂ / RV или IR780-TiS ₂ / RV в ячейках на рис. 3а. c Соответствующий коэффициент совместной локализации TiS ₂ с маркировкой FITC / RV или IR780-TiS ₂ / ПЖ и митохондрии в клетках на рис. 3а. М означает митохондрии . ** P <0,01 по сравнению с TiS ₂ / Группа RV в одиночку

Химиотерапия опухолей, вызванная БИК-излучением in vitro

Сначала фототермический эффект был оценен in vitro. После 5-часовой инкубации IR780-TiS ₂ / RV показал повышение температуры примерно на 17 ° C, тогда как TiS ₂ / RV показал повышение температуры примерно на 10 ° C (рис. 4a). Фототермический эффект был приписан IR780 и TiS ₂ . нанолисты. Демонстрация биосовместимости в качестве наноплатформы для загрузки лекарств, IR780-TiS ₂ не проявлял выраженной цитотоксичности ниже концентрации 300 мкг / мл (рис. 4б). Кроме того, RV с или без облучения NIR имел аналогичный зависящий от концентрации эффект уничтожения клеток (рис. 4c). При той же концентрации RV, RV достигал наилучшего эффекта уничтожения клеток при загрузке IR780-TiS ₂ и облучение NIR по сравнению со всеми другими условиями, то есть свободный RV, свободный IR780-TiS ₂ , и RV, загруженный TiS ₂ (Рис. 4d). Интересно, что незагруженный IR780-TiS ₂ платформа не проявила заметного противоракового эффекта при воздействии NIR-излучения по сравнению с таковой без NIR-излучения (рис. 4d), что указывает на то, что тепло, выделяемое IR780-TiS ₂ при облучении NIR стимул в основном использовался для запуска высвобождения лекарства, которое затем убивало клетки. Эти результаты показывают, что IR780-TiS ₂ / RV может высвобождать RV в митохондрии, когда запускается NIR-излучением, и, таким образом, значительно увеличивает локальную концентрацию RV в митохондриях и обеспечивает больший эффект ингибирования опухолей.

а Кривые изменения температуры PBS (контроль), TiS ₂ / RV или IR780-TiS ₂ / Клетки, обработанные ПЖ, при 3-минутном БИК-облучении (808 нм, 0,3 Вт / см ² ). б Цитотоксичность in vitro в отношении клеток CT26, обработанных различными концентрациями IR780-TiS ₂ . c Жизнеспособность клеток, обработанных RV с или без NIR-облучения (808 нм, 0,3 Вт / см ² ) в течение 3 мин. г Жизнеспособность клеток, обработанных IR780-TiS ₂ , RV, TiS ₂ / RV или IR780-TiS ₂ / RV с или без БИК-излучения (808 нм, 0,3 Вт / см ² ) в течение 3 мин. ** P <0,01 по сравнению с IR780-TiS ₂ / RV без группы NIR

Механизм смерти клетки

Чтобы проиллюстрировать основной механизм химиотерапии IR780-TiS ₂ , запускаемой NIR. / RV, мы проанализировали тип гибели клеток, потенциал митохондриальной мембраны (m) и уровни экспрессии ключевых белков, связанных с апоптозом. Во-первых, FCM использовали для определения типа гибели клеток с помощью окрашивания аннексином V-FITC / PI (рис. 5а). При той же концентрации ПЖ свободный ПЖ, TiS ₂ / RV, IR780-TiS ₂ / RV и IR780-TiS ₂ / RV + NIR может вызывать апоптоз, в основном из-за присутствия RV. Действительно, сообщалось, что RV обладает способностью вызывать апоптоз. Из этих обработок IR780-TiS ₂ / RV + NIR показал самый высокий уровень апоптоза - 90,8%. Затем были исследованы пути передачи сигналов апоптоза. Сообщается, что снижение m является ключевым событием митохондриального (внутреннего) пути апоптоза [40]. При той же концентрации RV IR780-TiS ₂ / RV + NIR снизил Ψm примерно на 85%, что было более значительным, чем уменьшение m, вызванное IR780-TiS ₂ , ТиС ₂ / RV с или без NIR, и свободный RV (рис. 5b). Этот эксперимент показывает, что IR780-TiS ₂ / RV + NIR вызывает гибель клеток, опосредованную митохондриальным (внутренним) путем апоптоза [41]. Затем с помощью Вестерн-блоттинга определяли экспрессию белков, критических для апоптоза, в частности цитохрома с (цито с), каспазы 9 и каспазы 3. Клетки, обработанные IR780-TiS ₂ / RV + NIR экспрессировал больше цитозольных цитоз, чем те, которые получали RV, IR780-TiS ₂ / RV или IR780-TiS ₂ / RV (рис. 5в). Транслокация цито-c является наиболее важным инициатором каспазного каскада [42,43,44]. Следовательно, экспрессия расщепленной каспазы 9 и расщепленной каспазы 3 была значительно повышена в IR780-TiS ₂ / RV + NIR-обработанные клетки. Вместе эти данные ясно указывают на то, что апоптоз опосредован митохондриальным (внутренним) путем.

а Апоптоз клеток CT26, обработанных PBS (контроль), RV, TiS ₂ / RV, IR780-TiS ₂ / RV и IR780-TiS ₂ / RV + NIR от FCM. б Изменение митохондриального мембранного потенциала клеток CT26, обработанных PBS (контроль), RV, TiS ₂ / RV, IR780-TiS ₂ / RV и IR780-TiS ₂ / RV с или без NIR-облучения FCM. c Экспрессия белков, связанных с апоптозом, в клетках CT26, обработанных PBS (контроль), RV, TiS ₂ / RV, IR780-TiS ₂ / RV и IR780-TiS ₂ / RV + NIR. Цитохром с, расщепленную каспазу-3 и расщепленную каспазу-9 тестировали с помощью вестерн-блоттинга. ** P <0,01 по сравнению с IR780-TiS ₂ / RV, TiS ₂ / RV + NIR и IR780-TiS ₂ группы

In Vivo Химиотерапия опухолей, инициированная БИК

Для оценки эффективности химиотерапии in vivo, запускаемой NIR, мышей с опухолью CT26 лечили физиологическим раствором, физиологическим раствором + NIR, RV, IR780-TiS ₂ / RV, TiS ₂ / RV + NIR и IR780-TiS ₂ / RV + NIR. Размер опухоли в IR780-TiS ₂ Группа / RV + NIR значительно уменьшилась, и опухоль почти исчезла после 30 дней лечения, в то время как в остальных группах объем опухоли показал тенденцию к увеличению (фиг. 6a). Во время лечения не было значительной разницы в массе тела между группами (рис. 6b). Наконец, визуализация H&E не выявила заметной тканевой токсичности или аномалий во всех тестируемых группах (рис. 6c). Эти результаты показывают, что IR780-TiS ₂ Нанокомпозит / RV обладает выдающейся противоопухолевой эффективностью, запускаемой в ближнем инфракрасном диапазоне, и низкой системной токсичностью. Кроме того, биораспределение IR780-TiS ₂ / RV оценивали in vivo. Как показано в Дополнительном файле 1:Рисунок S4, наночастицы в основном попали в систему печени и, возможно, метаболизировались этой системой [45].

а Профиль роста опухолей с ксенотрансплантатом CT26 после внутривенной инъекции физиологического раствора (контроль), ПЖ, TiS ₂ / RV и IR780-TiS ₂ / RV с или без 3-минутного БИК-излучения (808 нм, 0,3 Вт / см ² ). б Масса тела мышей с опухолями после различных курсов лечения. c H&E изображения основных органов всех обработанных мышей после 30 дней лечения. ** P <0,01, по сравнению с физиологическим раствором, физиологическим раствором + NIR, RV, TiS ₂ / RV + NIR и IR780-TiS ₂ / Группы RV

Заключение

Таким образом, мы разработали нацеленную на митохондрии и загруженную RV наноплатформу на основе TiS ₂ nanosheets for a NIR-triggered drug release and enhanced tumor chemotherapy. The as-prepared IR780-TiS₂ /RV with flake-like morphology showed good stability and biocompatibility. Owing to the mitochondria-targeted ability of IR780, IR780-TiS₂ /RV could selectively accumulate in tumor cell mitochondria and where it could release RV when triggered by the NIR irradiation. The released RV facilitated the mitochondrial membrane potential decrease, cyto c release, and, subsequently, initiated a cascade of caspase reactions to promote tumor cell apoptosis through the mitochondrial signaling pathway. In vitro and in vivo results demonstrated that IR780-TiS₂ /RV exhibited an efficacious NIR-triggered tumor chemotherapy without a significant tissue toxicity. These results suggest that IR780-TiS₂ /RV could be a promising chemotherapeutic agent in clinical practice.

Доступность данных и материалов

The conclusions made in this manuscript are based on the data which are all presented and shown in this paper.

Сокращения

IR780:

IR-780 iodide

СТАВКА:

Брунауэр-Эмметт-Теллер

BSA:

Бычий сывороточный альбумин

BSA:

Бычий сывороточный альбумин

CCK-8:

Cell Counting Kit-8

CLSM:

Confocal laser scanning microscopy

cyto c:

Cytochrome c

DMEM:

Dulbecco’s modified Eagle’s medium

DMSO:

Dimethylsulfoxide

FBS:

Фетальная бычья сыворотка

FCM:

Flow cytometry

FITC:

Fluorescein isothiocyanate

FTIR:

Fourier Transform Infrared Spectroscopy

NIR:

Ближний инфракрасный порт

PBS:

Физиологический раствор с фосфатным буфером

RV:

Resveratrol

ЧАЙ:

Триэтиламин

TiS₂ :

Titanium disulfide