Дополнение ELISA и поверхность встречно-штыревого электрода в функционализации золотых наночастиц для эффективного обнаружения дефектов свертывания крови человека

Введение

Улучшение всех аспектов медицины является обязательным для поддержания здорового образа жизни человека и увеличения продолжительности жизни. Диагностика заболеваний - одна из основных областей медицины, которая требует дальнейшего совершенствования для облегчения выявления болезней и методов лечения. С другой стороны, эпидемические заболевания, такие как грипп и лихорадка денге, необходимо обнаруживать на начальных стадиях, чтобы избежать распространения [1,2,3]. Существуют различные диагностические средства, которые продемонстрировали свою способность к подлинному обнаружению с помощью широкого спектра биомаркеров [4, 5]. Среди ранее созданных систем диагностики иммуноферментный анализ (ИФА) широко считается «золотым стандартом» для выявления основных вирусных и бактериальных заболеваний и молекулярных видов [6, 7]. С помощью ELISA были разработаны различные стратегии с такими привлекательными характеристиками, как простота использования, точность и более низкий предел обнаружения. Кроме того, на практике обычным явлением является одновременное выявление различных заболеваний и использование для скрининга основных заболеваний [8,9,10]. ELISA - это иммуноанализ, используемый для обнаружения интересующей мишени с использованием соответствующего антитела на 96-луночных планшетах из полистирола (PS). Чувствительность и селективность целевых молекул сильно зависят от различных факторов в ELISA, таких как сродство связывания мишени и антитела, взаимодействие первичных и вторичных антител и эффективная иммобилизация мишени на поверхности ELISA. В частности, иммобилизация мишени на пластине PS играет решающую роль в ограничении обнаружения. Антитело или белок могут физически адсорбироваться на поверхности PS за счет взаимодействия гидрофобных групп с антителом [11]. Есть некоторые возможности, например, связанные со слабым связыванием антитела (или белка) или нестабильностью антитела на планшете PS и неравномерным распределением антитела (или белка), приводящим к дефектам в обнаружении. Было доказано, что правильная ориентация антитела на иммобилизованном планшете улучшает обнаружение более чем в 64 раза по сравнению с случайно иммобилизованными молекулами [12, 13]. Таким образом, поиск подходящей процедуры для эффективной иммобилизации белка или антитела на планшете PS с однородностью является критической необходимостью. Различные исследователи используют иммобилизацию белков на пластинах PS ELISA с помощью химических или физических процессов, таких как фотохимическая реакция с участием поливинилбензиллактоноиламида и иммобилизация белка в присутствии детергента [14,15,16]. Dixit et al. [8] иммобилизовали антитела на планшете с модифицированным амином PS, чтобы улучшить предел обнаружения, и они продемонстрировали, что предварительная смесь (3-аминопропил) триэтоксисилана (APTES) и антитела перед этапом иммобилизации улучшила чувствительность в 54 раза по сравнению с стандартным ИФА и достиг предела обнаружения 10 пМ [8, 17].

В настоящей работе мы представили новый метод иммобилизации белков на планшетах PS ELISA с помощью наночастиц золота (ЗНЧ). ВНП - один из самых мощных инструментов в области разработки сенсоров. Они обладают положительными свойствами, такими как легкость диспергирования в воде, биологическая инертность и хорошая совместимость с функционализацией поверхности, и их можно адаптировать для получения однородных наноразмеров [18,19,20,21,22,23]. Было доказано, что антитела, конъюгированные с ЗНЧ, улучшают предел обнаружения вирусом гриппа и FIX на датчике волноводного режима [21,22,23]. ЗНЧ используются во всех типах датчиков, включая датчик волноводного режима, поверхностный плазмонный резонанс и рамановскую спектроскопию для высокопроизводительного обнаружения. Более того, ЗНЧ также использовались в колориметрических анализах, в которых конъюгация аптамера или антитела на поверхности ЗНЧ отслеживалась для обнаружения аналита невооруженным глазом. Исследователи также сосредотачиваются на использовании ЗНЧ в методах ELISA для улучшения обнаружения [24]. Ранее GNP-конъюгированные антитела против мышиного IgG-HRP улучшали обнаружение Pb (II) и достигали предела обнаружения 9 пг / мл [25]. Лакшмиприя и др. обнаружили, что конъюгация первичных и вторичных антител на ЗНЧ улучшает обнаружение белка ESAT-6, который участвует в возникновении туберкулеза [9, 26]. Здесь мы использовали ЗНЧ для иммобилизации белка на поверхности PS ELISA с химической модификацией с помощью APTES. Этот подход включает в себя два этапа:функционализация поверхности PS аминогруппами с использованием APTES с последующей иммобилизацией белка, конъюгированного с GNP, на планшете с модифицированным амином PS. Аминные группы APTES могут связываться с группами COOH на поверхности PS ELISA. С другой стороны, ЗНЧ-конъюгированные белки, стабилизированные анионными ионами лимонной кислоты, могут связываться с катионными APTES за счет электростатического взаимодействия [11, 27, 28]. Аминоконцевые группы в APTES замещают цитратные группы на ЗНЧ и химически фиксируются на пластине PS [29]. Положительно заряженные аминогруппы в APTES также привлекают отрицательно заряженные ЗНЧ. Кроме того, обработка APTES изменяет субстрат PS, делая его более гидрофобным [30].

Химически модифицированный планшет ELISA и конъюгация GNP использовали для обнаружения фактора IX (FIX) из каскада свертывания крови человека. FIX является важным белком в системе свертывания крови, а более низкие концентрации FIX в кровотоке приводят к недостаточности свертывания крови. Усиленная иммобилизация FIX на планшете для ELISA посредством ЗНЧ открывает потенциальный путь для обнаружения более низких уровней FIX. Планшет для ELISA с модифицированным GNP показал резкое улучшение обнаружения FIX. Кроме того, мы также продемонстрировали обнаружение FIX в сыворотке крови человека, и текущая стратегия может быть использована с ELISA для обнаружения других биомаркеров. Чтобы дополнить указанное выше исследование с субстратом для ELISA, мы также применили указанную выше стратегию к другой широко используемой поверхности встречно-штыревого электрода (IDE) в электрохимическом диэлектрическом датчике для обнаружения чистых FIX и FIX в разбавленном образце сыворотки человека (рис. 1a, b). .

а Схематическое изображение ELISA с использованием GNP. ЗНЧ были предварительно смешаны с белком и иммобилизованы на поверхности ELISA, модифицированной APTES. Затем добавляли антитела. Наконец, для обнаружения мишени использовали субстрат для HRP. б Схематическое изображение IDE с поддержкой GNP

Материалы и методы

Реагенты и биомолекулы

(3-Аминопропил) триэтоксисилан (APTES) и человеческая сыворотка были приобретены у Sigma-Aldrich (США). Белок FIX и антитело против FIX были от Abcam (Малайзия). Пероксидаза хрена, конъюгированная с антителами к мышиному IgG (антитела против мышиного иммуноглобулина HRP), была приобретена в Thermo-Scientific (США). Планшет для ELISA был приобретен у Becton Dickinson (Франция). Буфер для покрытия ELISA 5 × был получен от BioLegend (Великобритания). Бычий сывороточный альбумин (БСА) и субстрат HRP были получены от Promega (США). Наночастицы золота (ЗНЧ) (10, 15 и 80 нм) были получены от Nanocs (США). Аналитический ридер ELISA был от Fisher Scientific (Малайзия).

Оптимизация с помощью силанового реагента и ВНЧ

Чтобы оптимизировать подходящие концентрации APTES и GNPs, мы провели процесс иммобилизации с различными комбинациями APTES и GNPs на планшете для ELISA. Первоначально планшет для ELISA гидроксилировали 1% КОН в течение 1 ч. Затем 1,25, 2,5 и 5% APTES связывали в отдельные лунки планшета для ELISA при комнатной температуре (RT) в течение 5 часов. После этого разбавленные ЗНЧ (в дистиллированной воде) с концентрацией 25, 50 и 100% были иммобилизованы на APTES-модифицированных поверхностях. Затем FIX в концентрации 200 нМ позволяли связываться с поверхностями GNP. Затем оставшиеся сайты связывания блокировали с использованием 2% BSA, затем вводили разведение 1:1000 антитела FIX с последующим добавлением разведения 1:1000 антимышиного IgG-HRP. Наконец, был добавлен субстрат для обнаружения взаимодействия FIX. Лунки промывали 5 раз между каждым этапом, используя промывочный буфер (буфер PBS, содержащий 0,05% Tween 20, pH 7,4). Наконец, оптическую плотность (OD) измеряли с помощью ридера ELISA при 405 нм. В этом эксперименте использовались ЗНЧ размером 15 нм.

Определение необходимого размера ВНП

После определения подходящей концентрации APTES и разведения GNP в оптимальных условиях, 10, 15 и 80 нм GNP были опробованы для иммобилизации FIX для определения наиболее подходящего размера. Были использованы такие же экспериментальные условия, как указано выше. Для иммобилизации FIX использовали APTES в концентрации 2,5% и разведение GNP 50%.

Специальное и выборочное обнаружение ИСПРАВЛЕНИЯ

Мы также подтвердили специфическое связывание белка и антитела на планшете для ELISA. Для этого мы использовали три различных типа контрольных экспериментов. Мы иммобилизовали следующий порядок биомолекул на планшете для ELISA, чтобы служить в качестве контроля и в конкретных условиях:контроль 1 (C1), FIX-BSA-антимышиный IgG-субстрат; контроль 2 (C2), антитело-субстрат FIX-BSA-FIX; контроль 3 (C3), антитело BSA-FIX к субстрату против мышиного IgG, специфическое (S), антитело FIX-BSA-FIX к субстрату против мышиного IgG.

Обнаружение GNP-конъюгированного FIX на планшете для ELISA по сравнению с обычным ELISA

FIX был обнаружен с использованием планшета ELISA, модифицированного GNP, двумя разными методами, такими как APTES-GNP-FIX и предварительно смешанный FIX APTES-GNP, и эти методы сравнивали с обычным ELISA. Следующие шаги составляют процедуры. Стандартный ELISA:(i) белок FIX разводили в 1 × буфере для покрытия с концентрациями от 0 до 200 нМ, (ii) блокировали 2% BSA, (iii) добавляли разведение 1:1000 антитела FIX, (iv) 1:Добавляли 1000 разведение антимышиных IgG-HRP, (v) добавляли субстрат для HRP и измеряли при 405 нм.

APTES-GNP-FIX (метод 1):(i) планшет PS активировали 1% КОН, (ii) 2,5% APTES добавляли в планшет для ELISA при комнатной температуре в течение 5 часов, (iii) 25% полученных 15 нм Добавляли GNP и выдерживали при 4 ° C в течение ночи, (iv) FIX с концентрациями от 0 до 200 нМ позволяли связываться независимо с поверхностью GNP, (v) оставшаяся поверхность блокировалась 2% BSA, (vi) 1:Добавляли 1000 разведение антитела FIX, (vii) добавляли разведение 1:1000 антимышиного IgG-HRP, (vii) добавляли субстрат для HRP и измеряли при 405 нм.

Предварительно смешанный FIX APTES-GNP (метод 2):(i) планшет PS активировали 1% KOH, (ii) 2,5% APTES добавляли при комнатной температуре в течение 5 часов, (iii) премикс 25% 15-нм растворов GNP с различными концентрациями FIX (инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин; от 0 до 200 нМ) были иммобилизованы на APTES-модифицированной поверхности, (iv) оставшаяся поверхность была заблокирована 2% BSA, (v) было добавлено разведение 1:1000 антитела FIX, (vi) добавляли разведение 1:1000 антимышиного IgG-HRP, (vii) добавляли субстрат для HRP и измеряли при 405 нм.

Обнаружение FIX в сыворотке крови человека и после введения FIX

Чтобы обнаружить FIX в сыворотке крови человека, мы здесь предварительно смешали сыворотку с ЗНЧ вместо FIX. Разведения сыворотки от 20 до 1280 титровали и смешивали с ЗНЧ для оценки обнаружения FIX. Были использованы другие экспериментальные условия и концентрации, как и в предыдущих экспериментах.

Эксперименты с добавками проводили путем добавления различных концентраций FIX (от 0 до 8 нМ) в оптимизированное разведение сыворотки человека и предварительного смешивания с ЗНЧ перед иммобилизацией на планшете для ELISA. Были использованы другие экспериментальные условия и концентрации, как и в предыдущих экспериментах.

Изготовление поверхности встречно-штыревого электрода

Процесс изготовления поверхности встречно-штыревого электрода (IDE) включает очистку пластины, рост оксидного слоя, нанесение отрицательного фоторезиста центрифугированием, формирование рисунка из фоторезиста, осаждение металлического алюминия, удаление фоторезиста и нарезку пластины. Процесс был инициирован на пластине, очищенной буферным оксидным травителем, с последующим окислением на кремниевых пластинах (310 нм) при высокой температуре (1000 ° C), затем процесс травления был выполнен с использованием алюминия. Отрицательный фоторезист наносили центрифугированием со скоростью вращения 2000 об / мин. Резист проявлен РД-6 после воздействия УФ-излучения (240 с). Затем с помощью термического испарителя (Edwards Auto 306) наносили алюминий с длиной волны 240 нм при 3,0–5 Торр. Фоторезист удаляли ацетоном до появления твердого IDE, затем нарезали кубиками для создания одного IDE. Наконец, сверху был наложен слой оксида цинка для максимальной биомолекулярной иммобилизации [31]. Прежде чем приступить к установке оксида цинка, чувствительную поверхность сначала промыли 1 М гидроксидом калия (pH 9,0).

Обнаружение FIX на поверхности, модифицированной GNP

После оптимизации и подтверждения эффективности обнаружения FIX с помощью модифицированного GNP субстрата ELISA, такая же модификация поверхности была выполнена на поверхности IDE, чтобы дополнить вышеуказанное обнаружение. Первоначально поверхность оксида цинка IDE была модифицирована амином путем добавления 2,5% APTES, разведенного в этаноле, в течение 3 часов при комнатной температуре. После этого поверхность пять раз промывали этанолом и добавляли премикс ЗНЧ (25%) и FIX. Затем оставшиеся поверхности блокировали этаноламином, а затем добавляли антитело FIX для обнаружения FIX. Сопутствующих изменений в текущем сигнале замечено не было. Для проверки предела обнаружения различные концентрации FIX были независимо смешаны с ЗНЧ, иммобилизованы на модифицированной амином поверхности IDE, а затем обнаружены антителами; предел обнаружения определялся расчетом 3σ. Изобилие FIX в разбавленной сыворотке человека, смешанной с ЗНЧ, иммобилизовали на модифицированной амином поверхности IDE, а затем выявляли его антителом. Изготовление вышеуказанной поверхности производилось, как указано ранее [31].

Результаты и обсуждение

Предварительная обработка на поверхности PS ELISA

Эффективная иммобилизация белка или антитела на поверхности полистирола (PS) ELISA, по-видимому, улучшает предел обнаружения взаимодействия мишень-зонд. Для прикрепления белка или антитела к планшету для ELISA использовали различные методы иммобилизации. В этой работе мы ввели химически модифицированную поверхность ELISA с ЗНЧ для иммобилизации белков или антител. Мы хотели использовать один из важных факторов свертывания крови, такой как фактор IX (FIX), который, как широко сообщалось, является важным [32,33,34,35,36]. На рисунке 1 показано схематическое изображение иммобилизации белка на поверхности полистирола для ELISA. Сначала поверхность ELISA активировали 1% КОН. В отсутствие предварительной обработки КОН количество молекул APTES, которые должны быть связаны на поверхности PS, минимально. Это связано с отсутствием полярных групп и групп, акцептирующих водородные связи, которые облегчают начальную адсорбцию APTES на полимерах [11]. После обработки КОН поверхность была модифицирована амином соответствующей концентрации APTES для захвата ЗНЧ.

Характеристика ВНП

Прежде чем продолжить, мы охарактеризовали полученные ЗНЧ (15 нм) с помощью оптических, морфологических измерений и измерений распределения по размерам. На рис. 2а показан спектрофотометрический анализ ЗНЧ в УФ-видимой области, который, по-видимому, показал максимумы пиков при 550 нм. Наблюдения с помощью просвечивающего электронного микроскопа показывают, что размер ЗНЧ составляет ~ 15 нм, а форма хорошая (рис. 2b и вставка). Анализ инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье проводился для волнового числа от 500 до 4000 см ^-1 (Рис. 2в). Видимый одиночный пик на 1650 см ⁻¹ было замечено для золота вместе с другим второстепенным пиком, тогда как присутствие пиков для аминогрупп, представляющих присоединение APTES. Дополнительную поддержку оказали анализы распределения объемов и дзета-потенциала. На основе этого анализа объемное распределение указывает на то, что существует небольшое изменение в распределении по размерам (рис. 2d) и что дзета-потенциал составлял -6,9, что свидетельствует о стабильности ЗНЧ, используемых в этом исследовании (рис. 2e).

Характеристика наночастиц золота. Выполняется с оптимальным размером 15 нм. а Спектрофотометрический анализ в УФ-видимой области. Отчетливый одиночный пик был обнаружен при 550 нм. б Наблюдение на просвечивающем электронном микроскопе. На вставке к рисунку показано увеличенное изображение. Показана шкала масштаба. c Анализ инфракрасной спектроскопии с преобразованием Фурье. Видимые позиции пиков для золота и NH ₂ указаны. г Анализ объемного распределения ВНП. Показано полученное распределение. е Анализ дзета-потенциала. Значение оказалось - 6,9

Подготовка и оптимизация поверхности амина для захвата ВНЧ

Количество APTES сильно влияет на иммобилизацию ЗНЧ или антител на поверхности PS. Как правило, очень загруженные молекулы APTES могут давать ложноположительные результаты. Поскольку APTES использовали от 1 до 2% для иммобилизации антитела на нескольких сенсорных поверхностях, здесь мы титровали от 1,25 до 5% APTES, приготовленных в абсолютном этаноле. Затем наша цель состояла в том, чтобы иммобилизовать ЗНЧ на модифицированных APTES поверхностях. Существует вероятность того, что большее количество ВНЧ приведет к эффекту краудинга, поэтому ВНЧ с 25, 50 или 100% от 15 нм были протестированы на поверхности, модифицированной APTES, для оптимизации подходящего разведения. На этих модифицированных поверхностях с помощью антитела FIX было обнаружено 250 нМ FIX. Как показано на рис. 2a и b, 1,25% APTES показывает меньшее оптическое поглощение (OD) при всех разведениях ЗНЧ (25, 50 и 100%), тогда как 2,5 и 5% APTES показали более высокое поглощение как при 50, так и 100%. ВНП. В то же время отношение сигнал / шум улучшалось с увеличением концентрации APTES и ЗНЧ (рис. 3a, b). 5% APTES с 50 и 100% GNP показали неспецифическое связывание, а 50 и 100% GNP с 2,5% APTES показали аналогичную абсорбцию. Основываясь на этих полученных значениях, мы выбрали 2,5% APTES и 25% разведение ЗНЧ для дальнейших экспериментов.

Определение количества АПТЕСОВ и ВНП. Были использованы три различных концентрации (1,25, 2,5 и 5%) APTES с тремя разведениями GNP (25, 50 и 100%). а Визуальное обнаружение FIX после добавления субстрата. Были включены контрольные полосы без FIX. б Графическое представление оптимального уровня APTES. 2,5% APTES и 25% ВНП были признаны оптимальными

Определение потенциального размера ВНП

После оптимизации разведения APTES и GNP, мы затем оценили подходящий размер GNP. Поскольку площадь поверхности играет решающую роль в иммобилизации белка, здесь мы попытались иммобилизовать три разных размера ЗНЧ, включая 10, 15 и 80 нм. ЗНЧ разного размера имеют разные площади поверхности и разные заряды для привлечения белка, а также различаются связывающие способности на поверхности, модифицированной APTES. Как показано на рис. 4а, 250 нМ FIX было обнаружено с помощью ELISA поверхности, модифицированной ЗНЧ 10, 15 и 80 нм. Было обнаружено, что ЗНЧ 15 и 80 нм показывают почти одинаковую оптическую плотность 0,4 (ОП) для обнаружения 250 нМ FIX, но ЗНЧ размером 10 нм показывают оптическую плотность только 0,34. В этом эксперименте мы подтвердили, что 15 или 80 нм ЗНЧ подходят для дальнейших экспериментов, и мы продолжили с 15 нм ЗНЧ.

а Определение идеального размера ВНП. Среди 10, 15 и 80 нм, 15 и 80 нм показали аналогичные результаты. Пятнадцать нанометров были использованы для определения предела обнаружения с помощью FIX. б Контрольный эксперимент по обнаружению FIX. Было проведено три различных контрольных эксперимента (C1 - без антитела FIX; C2 - без антител против мышиного IgG; C3 - без FIX). Ни в одном из контрольных экспериментов не было обнаружено значимого сигнала. На вставках к рисункам отображаются визуальные результаты

Экспериментальные стратегии для подтверждения отсутствия обрастания и высокой производительности

Перед обнаружением FIX на поверхности ELISA, модифицированной GNP, мы провели три различных контрольных эксперимента, как описано в разделе «Материалы и методы». Как показано на рис. 4b, мы не смогли наблюдать значительного поглощения в лунках для контрольных экспериментов 1, 2 и 3 (C1, C2 и C3). В конкретном эксперименте (S) более высокий уровень поглощения явно связан с видимыми изменениями цвета. В случае C1 мы не добавляли антитело FIX, что подтверждает, что антитело FIX специфически взаимодействует с FIX (в S). Никакого наблюдаемого сигнала не было обнаружено в отсутствие антимышиного IgG в C2, что дает дополнительную фиксацию для правильного взаимодействия FIX и антитела, за которым следует антимышиный IgG. В C3 в отсутствие FIX мы не могли измерить значительную абсорбцию. На основании этих результатов было подтверждено правильное взаимодействие FIX с его антителом на поверхности ELISA без неспецифического связывания.

ИФА с использованием GNP против обычного ИФА:определение чувствительности

После проведения контрольных экспериментов мы обнаружили FIX на поверхностях, модифицированных GNP, и сравнили результаты с обычным методом ELISA. Мы провели три разных эксперимента по обнаружению FIX. Сначала ЗНЧ иммобилизовали на модифицированных APTES поверхностях, а затем FIX прикрепляли к поверхности ЗНЧ за счет электростатического взаимодействия. Благодаря электростатическому взаимодействию большинство белков имеют возможность связываться с поверхностью ЗНЧ; таким образом, мы могли иммобилизовать FIX на поверхности ELISA PS. Иммобилизация белка также зависит от зарядов, возникающих от аминокислот и ЗНЧ. Gopinath et al. [37] доказали сильное связывание FIX с поверхностью ЗНЧ, а также обнаружили, что он стабилен в условиях высокого содержания соли. Во втором методе ЗНЧ и белок сначала предварительно смешивали перед иммобилизацией на аминированной поверхности PS ELISA. Ожидалось, что таким образом может связываться больше белков, потому что существует более высокая вероятность того, что молекулы белка смогут связываться с поверхностью ЗНЧ в состоянии раствора. Затем раствор-премикс иммобилизовали на поверхности амина, модифицированного APTES. Эти методы сравнивали с обычным методом ELISA. Как показано на фиг. 5a, когда мы титровали концентрацию FIX от 0 до 200 нМ, обычный ELISA (метод 1) показал предел обнаружения 6 нМ. Метод APTES-GNP-FIX (метод 2) отображает предел обнаружения 200 пМ, что более чем в 30 раз превышает чувствительность по сравнению с обычным ИФА. Повышение чувствительности достигается за счет правильной ориентации большого количества антигенов, иммобилизованных на планшете ELISA PS, и в конечном итоге будет взаимодействовать большее количество антител. В этом исследовании наночастицы золота использовались для иммобилизации большего количества антигенов посредством аминовой модификации планшета для ELISA. В обычном ИФА антигены иммобилизуются непосредственно на планшете ИФА, что приводит к меньшему количеству молекул, связывающихся на поверхности, и вызывает снижение чувствительности по сравнению с нынешней стратегией, опосредованной наночастицами золота. Кроме того, локализованный поверхностный плазмонный резонанс дает дополнительное улучшение чувствительности, как показали исследования с ЗНЧ. Когда мы предварительно смешали ЗНЧ с FIX, как и ожидалось, предел обнаружения был значительно улучшен и достиг уровня 100 пМ, что в 60 раз выше чувствительности, чем у обычного ELISA. Как показано на рис. 5а, можно ясно видеть, что, когда мы используем ЗНЧ для иммобилизации белков, максимальное поглощение достигало ~ 0,6 как для предварительно смешанных, так и для непосредственно иммобилизованных белков на поверхности ЗНЧ, но поглощение, обнаруженное с помощью обычного ELISA, составляло ~ 0,4 с использованием аналогичная концентрация (200 нМ) FIX. Даже при других концентрациях метод 3 показал более высокую разницу в оптической плотности по сравнению с обычным ELISA, и это также было разумно выше, чем метод 2. В случае обычного ELISA обнаружение видимого света было обнаружено от 25 нМ и от 3 нМ. в методе 2. В методе 3 мы могли заметно видеть изменение цвета от 200 пМ FIX из-за более высокого поглощения (рис. 5a). Поглощение было насыщенным при 25 нМ в методе 3. Поскольку мы могли визуализировать изменения цвета от 200 пМ FIX, мы оценили предел обнаружения и титровали, используя более низкие концентрации FIX. Было очевидно, что предел обнаружения достиг 100 пМ, когда мы предварительно смешали ВНП и FIX (рис. 5b).

а Сравнение чувствительности FIX в GNP-модифицированном ELISA с обычным ELISA. FIX титровали от 0,2 до 200 нМ. Обычный ELISA показывает предел обнаружения 6 нМ. В ИФА с модифицированным GNP сигнал наблюдали до 200 пМ. На вставке к рисунку показаны визуальные результаты. б Предел обнаружения FIX на планшете ELISA с модифицированным GNP. FIX титровали от 25 до 100 пМ. Предел обнаружения составил 100 пМ. На вставках к рисункам отображаются визуальные результаты

Обнаружение FIX в сыворотке крови человека и улучшение путем добавления FIX

Поскольку было обнаружено, что FIX играет важную роль в каскаде свертывания крови [38, 39], после проверки предела обнаружения мы также обнаружили FIX в сыворотке крови человека. Для этого анализа мы титровали человеческую сыворотку в диапазоне разведений от 1:1280 до 1:20. Разбавленная сыворотка была предварительно смешана с ЗНЧ и иммобилизована на поверхности ELISA, модифицированной APTES, как указано выше. Было очевидно, что FIX был обнаружен при разведении сыворотки 1:640, что эквивалентно 125 пМ FIX (фиг. 6a). Сыворотка здорового человека обычно содержит приблизительно 87 нМ FIX, наряду с другими основными белками, такими как альбумин и глобулин. С нашей стратегией мы достигли специфического предела обнаружения 125 пМ в сыворотке крови человека, что полезно для выявления дефекта свертывания крови. С другой стороны, когда мы добавили FIX от 1 до 8 нМ в разведение 1:640 сыворотки крови человека, он показал прирост поглощения, который одновременно увеличивался с концентрацией FIX (рис. 6b).

а Обнаружение FIX в сыворотке крови человека. Сыворотку человека разводили от 1:20 до 1:1280. FIX был обнаружен в сыворотке крови человека, разведенной 1:640 (цифра внутри указывает на схематическое изображение). б Добавление FIX (от 0,125 до 8 нМ) в разведение 1:640 сыворотки крови человека. С увеличением концентрации FIX оптическая плотность увеличивалась. На вставках к рисункам отображаются визуальные результаты

Обнаружение GNP-FIX на поверхности IDE:анализ дополнения

Поскольку было обнаружено, что GNP-конъюгированный FIX улучшает предел обнаружения, мы применили аналогичную стратегию, используя электрохимический датчик с поверхностью IDE, чтобы дополнить эти результаты. Мы титровали FIX от 25 до 200 пМ (в смеси с ЗНЧ), иммобилизовали его на модифицированной амином поверхности IDE, а затем детектировали с помощью антитела FIX. Как показано на рис. 7a, с увеличением концентрации FIX текущий уровень также одновременно увеличивался по сравнению с исходным уровнем. Уровень FIX был насыщен от 200 пМ, и было установлено, что предел обнаружения составляет 25 пМ. Это обнаружение усиливается в четыре раза по сравнению с ELISA (100 пМ). Кроме того, обнаружение FIX было подтверждено в разбавленной сыворотке крови человека (рис. 7b). Для этого эксперимента человеческую сыворотку разводили от 1:80 до 1:1280. Как показано на рисунке, разведение 1:1280 (красная кривая) показывает очевидное отличие от исходного уровня (черная кривая) с оценкой 3σ, что указывает на то, что очевидное обнаружение FIX в сыворотке крови человека при разведении 1:1280 соответствует с результатами ELISA (обнаружено при 1:640). Обнаружение из IDE с меньшим разбавлением показывает прирост чувствительности.

а Limit of detection of FIX-conjugated GNP on IDE sensing surface. FIX was titrated from 25 to 400 pM. The limit of detection was found to be 25 pM. б Detection of FIX in human serum on the IDE sensing surface. Human serum was diluted from 1:80 to 1:1280. FIX was detected in human serum diluted 1:1280

Заключение

Efficient immobilization of protein or antibody on the PS ELISA surface is a crucial step to improve the limit of detection. Here, we introduced a new and easy protein immobilization strategy on the PS ELISA surface assisted by GNPs. Two different methods were used:one is the direct immobilization of FIX on the GNP-modified surface, and another one is premixing of FIX with GNPs before attachment. It was found with the former method that improvement of the limit detection is 30-fold higher compared with the conventional ELISA. The latter method showed a 60-fold improved limit of detection compared to the conventional ELISA. We also demonstrated the detection of FIX in 1:650 diluted human serum, which is equivalent to 125 pM. Obviously, these strategies proved that the higher binding of proteins on the ELISA surface was able to improve the sensitivity and to be useful for detecting a wide range of biomarkers on the ELISA surface.

Доступность данных и материалов

All of the data are fully available without restriction.

Сокращения

APTES:

(3-Aminopropyl)triethoxysilane

BSA:

Бычий сывороточный альбумин

COOH:

Carboxyl

ELISA:

Иммуноферментный анализ

Fc:

Fragment crystallizable

GNP:

Gold nanoparticle

HRP:

Пероксидаза хрена

IDE:

Interdigitated electrode

IgG:

Immunoglobulin

OD:

Оптическая плотность

PEG:

Полиэтиленгликоль

PS:

Полистирол

PVLA:

Polyvinyl benzyl lactonoylamide

TMB:

3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine