Переносной плазмонно-термический прибор для точной квантификации боковых тесто-систем (LFA)

Аннотация

Точечная диагностика (POCT) широко используется для ранней диагностики и мониторинга заболеваний. Боковая тесто-система (LFA) — успешно коммерциализированный инструмент для POCT. Однако LFA часто страдает от отсутствия квантификации и аналитической чувствительности. Для решения этих недостатков мы ранее разработали термическую LFA с использованием плазмонных золотых наночастиц для термического контраста в переносном приборе. Хотя эта методология значительно улучшает аналитическую чувствительность по сравнению с обычным визуальным обнаружением, проблемы квантификации остаются. В данном исследовании мы оптимизировали рабочие условия прибора, используя проводимый и радиационный термические сенсорные режимы, позволяющие квантификацию LFA. Предел обнаружения полосок, содержащих только наночастицы, снизился в 5 раз (проводимый режим) и в 12 раз (радиационный режим) по сравнению с традиционным визуальным обнаружением. Влияние температуры окружающей среды изучалось для обоих методов обнаружения, показывая, что радиационный режим более подвержен влиянию температуры окружающей среды, чем проводимый режим. Для валидации термического сенсорного метода биомаркер хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) квантифицировался с нашими LFA полосками, получив предел обнаружения 2,8 мМЕ/мл при использовании радиационного метода обнаружения.

Введение

Раннее обнаружение и быстрая диагностика важны для скрининга и лечения заболеваний. Большинство медицинских тестов трудоемки и требуют сложной подготовки клинических образцов, крупных приборов и высококвалифицированных лабораторных специалистов [1]. Эти требования сильно препятствуют медицинскому лечению в ресурсно-ограниченных районах. Точечная диагностика (POCT) использует простое оборудование и минимизирует время, необходимое для получения клинически значимых результатов, позволяя врачам и пациентам быстро принимать решения. POCT имеет очевидные преимущества: короткое время обнаружения, быстрая обработка образцов, простое инструментирование и низкие требования к эксплуатации [2, 3]. Таким образом, появление POCT может помочь в ранней и быстрой диагностике заболеваний, особенно в ресурсно-ограниченных районах, тем самым улучшая медицинские условия. Однако низкая аналитическая чувствительность, сложные процедуры эксплуатации и высокая стоимость оборудования обычно препятствуют применению этой техники. Поэтому срочно необходима дальнейшая работа для поиска POCT применений с большинством идеальных характеристик, минимизируя недостатки.

Для решения некоторых из этих проблем боковая тесто-система (LFA) является очень хорошим кандидатом в качестве инструмента тестирования в POCT. LFA — бумажная, точечная полоска биосенсора для идентификации целевых аналитов в заданном образце [4, 5]. LFA выполняется в бумажной полоске (Схема 1b), которая состоит из пробоотбирающей подкладки, конъюгатной подкладки, абсорбирующей подкладки и нитроцеллюлозной мембраны, где происходит обнаружение. Среди преимуществ LFA стоит отметить её быстроту и односторонний ассей, стоимостную эффективность, легкую эксплуатацию, малый объем образца и длительный срок хранения в различных экологических условиях [6, 7]. Конвенциональная LFA дает результаты «да или нет» путем инспекции изменения цвета на тестовой линии невооруженным глазом — наиболее популярный метод обнаружения для таких ассеев. Таким образом, этот тип подхода склонен страдать от отсутствия точности и субъективного суждения [8]. Тем не менее, поскольку легко интегрировать LFA с электронными устройствами, реалистичным подходом обнаружения является разработка ридеров полосок для получения точных количественных результатов. Зарядово-связанные приборы (CCD) или дополнительные металл-оксид-полупроводниковые (CMOS) сенсоры обычно применяются для захвата изображений в ридерах полосок. Программное обеспечение для обработки изображений часто используется для достижения количественных результатов. В этих оптических ридерах оптическая информация, полученная от отражения, прохождения или рассеяния света от внешнего источника, записывается для квантификации [9–12]. В колориметрических ридерах интенсивность цвета, такая как серое значение или RGB координаты, собирается с тестовых и контрольных линий для анализа LFA полосок [13–17]. Один недостаток этого подхода — краситель может терять цвет со временем из-за фотоповреждения, механических средств или других процессов деградации, приводящих к плохой повторяемости и точности. В системах, прибегающих к флуоресцентным ридерам [18, 19], органические флуорофоры воздействуют специфической длиной волны возбуждения, индуцируя эмиссию флуорофора, присутствующего в полосках, на более длинной длине волны. Этот испускаемый свет затем собирается для количественного обнаружения. Проблема, которую нельзя игнорировать, в том, что органические флуорофоры, обычно используемые в этих применениях, страдают от фотоблеклинга и химической деградации, вызывающих затухание сигнала со временем, требующие специфической обработки и специального хранения [7].

Концепция плазмонного термического сенсирования. a Модель переносного прибора и основные компоненты (сверху) с двумя разными сенсорными режимами (снизу). b LFA под термическим сенсорным настройкой

Недавно термическое сенсирование постепенно применяется к обнаружению LFA. Термическое сенсирование состоит в использовании термического преобразователя, в котором генерируемое тепло увеличивается в присутствии аналита, позволяя обнаруживать этот термический сигнал данным преобразователем. Поиск и соавт. [20] исследовали концепцию сенсирования, управляемого плазмонным нагревом, путем обнаружения онкомаркера карциноэмбрионального антигена (CEA) с использованием источника ближнего инфракрасного (NIR) света для индукции генерации тепла с использованием плазмонных свойств анизотропных золотых наночастиц. Цинь и соавт. [21] предложили метод использования термического контраста для квантификации LFA с использованием зеленого лазера как источника света, который показал 32-кратное улучшение аналитической чувствительности. В 2016 году похожий ридер термического контраста [22] был разработан Ван, который усилил аналитическую чувствительность в 8 раз в квантификации LFA. Источник света, используемый для индукции генерации тепла преобразователем, может быть настроен на специфические длины волн для предотвращения влияния других молекул, не поглощающих на этих длинах волн, обеспечивая специфичность обнаружения. Использование источников света в NIR области электромагнитного спектра позволяет предотвратить поглощение света большинством молекул биологического происхождения, особенно крови [23]. Эти преимущества показывают, что плазмонное термическое сенсирование с NIR источником света — перспективный метод обнаружения LFA. Однако в предыдущих исследованиях не был разработан POCT прибор, использующий LFA полоски вместе с NIR источником света.

Здесь мы разработали переносной прибор на основе плазмонного термического сенсирования (Схема 1a), улучшающий аналитическую чувствительность в LFA без дополнительной модификации полосок. Сигнал усиливался за счет полной реализации плазмонного резонанса при облучении NIR лазером. Длина волны лазера в прототипе лежит в пике локализованного поверхностного плазмонного резонанса (LSPR) наночастиц (которые действуют как свет-в-тепло преобразователи в нашей настройке), таким образом генерируя тепло в тестовой линии. Затем генерация тепла обнаруживается термическим сенсором, расположенным в приборе, который измеряет тепло, генерируемое либо инфракрасным излучением (радиация), либо теплопроводностью. Количество генерируемого тепла пропорционально количеству наночастиц в тестовой линии и мощности облучения [24]. Никаких дополнительных операций не требуется.

Теплопередача имеет три основные формы: проводимость, конвекция и радиация. Для изучения производительности обнаружения различных форм теплопередачи мы тестировали проводимый режим (контактный) и радиационный режим (бесконтактный) двумя видами сенсоров (Схема 1a и Дополнительный файл 1: Рисунок S1). Весь прототип компактен и использует встроенную системную технологию и поверхностно-монтируемые компоненты. Основные факторы, влияющие на способность обнаружения, исследовались для оптимизации рабочих условий. Для верификации способности обнаружения переносного прибора LFA полоски, напрямую загруженные наночастицы на мембране, квантифицировались и сравнивались с конвенциональным визуальным обнаружением. Поскольку наш метод обнаружения температурозависим, эффект температуры окружающей среды на термическое обнаружение сигнала также изучался и калибровочная кривая получалась для проводимого режима. Наконец, биомаркеры хорионического гонадотропина человека (ХГЧ) квантифицировались как модель для верификации способностей термического сенсирования.

Материалы и методы

Материалы и реагенты

Фосфатно-буферный раствор (ФБР) приобретался у Lonza®. N-(3-Диметиламинпропил)-N-этилкарбодиимид гидрохлорид (EDC) и гетерофифункциональный полиэтиленгликол (HS-PEG-COOH, МВ = 5000 г/моль (5 кДа)) приобретались у SIGMA®. Твеен 20, Тритон X100, сывороточный альбумин говяжий (BSA), трегалоза, поливинилпирролидон (PVP), N-гидроксисульфосукцинимид (S-NHS), гидроксид натрия, хлорид натрия, хлорид золота(III) гидрат и гормон ХГЧ приобретались у Aladdin®. Сахароза, тетраборат натрия декагидрат, борная кислота, йодид калия и тиосульфат натрия пентагидрат приобретались у Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Боргидрид натрия приобретался у Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co., Ltd. Анти-αХГЧ, анти-βХГЧ и анти-мыши вторичные антитела, нитроцеллюлозная мембрана (NC-a110), пробоотбирающая подкладка (стекловолокно BX108), конъюгатная подкладка (стекловолокно BX101) и поверхности поливинилхлорида (PVC) приобретались у JieyYiBiotech™. 4-Морфолинэтансульфоновая кислота (MES) приобреталась у Shanghai Majorbio. Чистый этанол приобретался у Changshu Yangyuan Chemical Co., Ltd.

Синтез наночастиц (золотые нанопризмы, AuNPrs)

Наночастицы, использованные в данном исследовании, были получены с использованием вариации нашего ранее сообщенного протокола [25], который позже был улучшен [26]. Кратко, объем 220 мл 0,5 мМ Na₂S₂O₃ дополнялся 20 мкл 0,1 М KI. Затем 110 мл вышеуказанного раствора постепенно добавлялся к раствору, содержащему 2 мМ HAuCl₄, в течение 30 с и инкубировался при комнатной температуре до общего времени 4 мин, момент, в котором раствор дополнялся 110 мл оставшегося раствора Na₂S₂O₃+KI в течение 30 с и инкубировался еще 4 мин. Наконец, 100 мл Na₂S₂O₃ без KI добавлялся к получившемуся раствору и инкубировался 60 мин при комнатной температуре для получения финальных призматических наночастиц. Все описанные выше стадии инкубации выполнялись без встряхивания. После синтеза наночастицы стабилизировались с PEG (PEGилирование). Количество PEG, добавленного к наночастицам, готовилось в соотношении 1:2 (НП к PEG) от общей массы золота, использованной в синтезе. PEG разбавлялся в 1 мл Milli-Q воды, и определенный объем NaBH₄ затем добавлялся для достижения 1:1 мольного соотношения PEG к NaBH₄. Весь объем раствора PEG к NaBH₄ полностью добавлялся к AuNPrs и корректировался до pH 12 с 2 М NaOH под мягким перемешиванием. Наконец, раствор сонировался 60 мин при 60 °C, а затем центрифугировался 15 мин при 4400 G при комнатной температуре для разделения AuNPrs от избытка PEG и нереагировавших материалов. Пеллеты перевзвешивались в Milli-Q воде и центрифугировались трижды по 9 мин при 4400 G при комнатной температуре. Эти финальные образцы разбавлялись до четверти их исходного объема, чтобы позволить им оседать при комнатной температуре в течение нескольких недель. После этого времени верхний слой раствора (содержащий основную долю меньших, более легких нанометрических золотых побочных продуктов) мог быть удален от AuNPrs, которые оседают на дне. Концентрация наночастиц получалась путем измерения их абсорбции (OD) при 400 нм УФ-Vis спектроскопией и применением коэффициента конверсии (ε) 11,3 мл мг⁻¹ см⁻¹. Это значение было получено экспериментально путем корреляции концентрации золота, полученной ICP, с OD при 400 нм УФ-Vis финальных продуктов синтеза.

Конъюгация наночастиц с анти-ХГЧ антителом

Кратко, 3 мл раствора, содержащего 0,5 мг/мл PEGилированных наночастиц, промывался трижды 0,1 М MES буфером pH 5,5 центрифугированием 9 мин при 6000 об/мин в мини-центрифуге при комнатной температуре. Финальные промытые наночастицы перевзвешивались в 1 мл финального объема того же буфера (0,1 М MES буфер pH 5,5), и 4 мг EDC и S-NHS добавлялись к раствору. Образцы затем инкубировались 20 мин под мягким перемешиванием, центрифугировались 9 мин при 6000 об/мин и промывались MES буфером. Затем 20 мкл антителого стока (200 мкг) добавлялись к образцу и инкубировались 3 ч при 37 °C, за которым следовала вторая инкубация на ночь при 4 °C (без встряхивания). На следующий день конъюгированные наночастицы центрифугировались (9 мин при 6000 об/мин) и промывались дважды боратным буфером 5 мМ pH 9. Затем 25 мг BSA добавлялись к раствору. После 1 ч инкубации при комнатной температуре под мягким встряхиванием образец промывался (9 мин при 6000 об/мин) боратным буфером, дополненным Твеен 20 (5 мМ pH 9) и наконец хранился при 4 °C до дальнейшего использования не дольше 4–5 дней.

После приготовления наночастиц осуществлялась сборка тест-полосок (описана в ESI).

Нанесение наночастиц на мембрану полосок

Для нанесения наночастиц на мембрану полосок концентрация исходного стока PEGилированных наночастиц (без антитела) определялась и серия разбавлений проводилась в Milli-Q воде, в результате чего получался диапазон концентраций от 0 (чистая Milli-Q вода без наночастиц) до 10 OD/мл для максимальной концентрации, что соответствует 0,9 мг/мл согласно коэффициенту конверсии, ранее охарактеризованному ICP-AES. Для простоты и экстраполяции значения OD предпочитались весовой концентрации. Таким образом, 2 мкл каждого из вышеупомянутых разбавлений добавлялись микропипеткой непосредственно на нитроцеллюлозную мембрану полосок и оставляли высыхать при комнатной температуре в течение ~ 2 ч. Высушенные полоски хранились при комнатной температуре перед тестами облучения.

Для обнаружения антигена ХГЧ в полосках проводилась серия разбавлений аналита (ХГЧ) в ФБР. Каждая полоска запускалась загрузкой 5 мкл AuNPr, конъюгированных с анти-ХГЧ антителом, в конъюгатную подкладку, и 50 мкл требуемого разбавления, содержащего ХГЧ. Полоски высыхали аналогичным образом, как и для предыдущего теста.

Разработка переносного прибора

Переносной прибор (рис. 1a и Дополнительный файл 1: Рисунок S1) собирался с использованием встроенной системной технологии и поверхностно-монтируемых компонентов, так как они малы по размеру и стоимостно эффективны. Состав прототипа показан на рис. 1b. Материнская плата (Дополнительный файл 1: Рисунок S1) — основной модуль прибора, функция которого — обработка данных и управление остальными компонентами. Этот модуль в основном состоит из MCU STM32F407, который обладает большой памятью и низким энергопотреблением. На материнской плате спроектирована схема преобразования напряжения для обеспечения правильного питания каждого модуля в приборе.

Детали переносного прибора. a Переносной прибор на основе плазмонного термического сенсирования. b Аппаратная схема композиции ① материнская плата, ② лазерный и сенсорный модуль, и ③ пользовательский интерфейс. c Картридж для полосок

Пять интерфейсов применялись на материнской плате для соединения с другими модулями. Температурный сенсор соединялся с материнской платой через IIC интерфейс для приема температурных сигналов, передаваемых сенсором. Для точного измерения температуры мы выбирали температурные сенсоры с цифровым выходом. Сенсор для проводимого режима был полупроводниковым сенсором (ADT7420, Analog Devices) с 16-битным разрешением температуры (0,0078 °C) и низким энергопотреблением (700 мкВт). В радиационном режиме мы использовали инфракрасный термометр (MLX90614, Melexis) с 17-битным разрешением температуры и потреблением 3,9 мВт. Интерфейс между модулем управления лазером и материнской платой состоял из релейной схемы управления для обеспечения точного управления лазерным диодом при защите материнской платы от высокого тока. Лазерный модуль состоял из трех компонентов: (1) компонента управления лазером (Дополнительный файл 1: Рисунок S1), (2) лазерного диода (Thorlabs, M9-A64-0200), обеспечивающего источник света с длиной волны 1064 нм и максимальной оптической выходной мощностью 200 мВт, и (3) асферической линзы (Thorlabs, 354330-C), смонтированной в лазерном модуле для сфокусировки света, испускаемого лазерным диодом, в область 1 мм × 2,5 мм. Эти компоненты позволяли точно освещать тестовую линию на полоске. LCD сенсорный экран (TaoJinChi Corporation TJC4827K043_01RN, 480 × 272 пикселя) использовался для предоставления графического пользовательского интерфейса. Интерфейс 4 платы оставлялся для загрузки программы и отладки. USB интерфейс собирался в приборе, который служил портом зарядки батареи и коммуникационным портом между прибором и опциональным внешним компьютером. Прототип питал 10 000 мАч литий-ионной батареей. Программы в MCU компилировались ПО IAR (версия 7.50.2.10505). Графический пользовательский интерфейс проектировался с использованием ПО USART HMI.

Проектирование корпуса прототипа и картриджа тест-полосок

Для обеспечения удобства пользователя и переносимости прибора проектировались 3D-печатный корпус и картридж, улучшающие способность к противостоянию помехам и стабильность прибора. Белая смола использовалась как материал для корпуса и картриджа. Программное обеспечение Solidworks 2018 использовалось для проектирования.

Прямоугольный параллелепипедный корпус (Дополнительный файл 1: Рисунок S2a) и прямоугольная нижняя пластина (Дополнительный файл 1: Рисунок S2b) проектировались для прибора согласно форме внутренних компонентов. Прямоугольный корпус обеспечивал фиксированную позицию монтажа для LCD экрана и модуля управления лазерным диодом. Прямоугольный слот на стороне корпуса использовался для вставки картриджа тест-полосок. Нижняя пластина обеспечивалась батареей и базой монтажа материнской платы, позволяя компонентам быть закрепленными на нижней пластине без движения. Все детекционные части фиксировались в нижней пластине. Рама поддержки для сенсора и картриджа полосок устанавливалась в нижней пластине, сближая их в тесный контакт. Тонкая настройка движущегося трека обеспечивалась для лазерного диода и линзы, позволяя фиксировать и регулировать расстояние. Размер всего корпуса составлял 133 мм × 108 мм × 73 мм.

Специальный картридж (рис. 1c, 15 мм × 4 мм × 70 мм) проектировался для защиты тест-полосок. Картридж имел три окна: одно для загрузки образца и два для визуализации тестовой линии и контрольной линии соответственно. Окно тестовой линии проектировалось слегка уже ширины тест-полоски для обеспечения того, что лазер не может проходить сквозь тест-полоску и влиять на обнаружение сенсора. На задней стороне картриджа делалась выемка, позволяющая проводимое сенсору полностью касаться задней стороны полосок в позиции тестовой линии, обеспечивая при этом, что радиационный сенсор мог правильно обнаруживать температуру.

Алгоритм термического сенсирования и расчет параметров

Поскольку лазер освещал наночастицы, тепло генерировалось в тестовой линии, вызывая детектируемые изменения температуры. Эта генерация тепла (Q, Вт/м³) зависит от концентрации наночастиц (C, OD/мл), области освещения (A, м²) и интенсивности лазера (I, Вт/м²) [22], согласно следующей формуле:

$$ Q= CIA $$ (1)

Термический сигнал (температура) собирался, когда лазер освещал полоски. Поскольку область освещения и интенсивность лазера держались постоянными, термический сигнал менялся с количеством наночастиц, связанных на тестовой линии. Для квантификации генерации тепла сравнивались два метода. Первый использовал изменения температуры (Дополнительный файл 1: Рисунок S3) для квантификации термического сигнала. Вариация температуры (∆T) рассчитывалась для определения:

$$ \Delta T={T}_{\mathrm{end}}-{T}_0 $$ (2)

где T_end — конечная (максимальная) температура, достигнутая в конце облучения, и T₀ — начальная температура окружающей среды, зарегистрированная сенсором до начала облучения. Другой метод использовал количественный расчет площади под кривой (AUC, Дополнительный файл 1: Рисунок S3). Этот метод делил кривую на трапеции согласно частоте дискретизации 10 Гц с последующим вычислением суммы всех трапеций. Термический сигнал достигался делением площади на время обнаружения (t_det):

$$ \mathrm{AUC}=\sum \limits_{i=1}^n\left(\Delta {T}_i+\Delta {T}_{i-1}\right)\times 0.1\div 2 $$ (3) $$ {T}_{\mathrm{auc}}= AUC\div {t}_{\mathrm{det}} $$ (4)

При применении обоих методов в обнаружении анализ AUC давал лучшую повторяемость квантификации (Дополнительный файл 1: Рисунок S4). Поэтому анализ AUC выбирался для использования в финальной квантификации тепла.

Для оценки производительности различных методов обнаружения мы оценивали LOD квантификации. В каждом эксперименте мы измеряли одну концентрацию для четырех образцов (четыре полоски, n = 4). Учитывая стандартное отклонение (σ₀) пустой группы и чувствительность (S), которая является наклоном калибровочной кривой в линейном диапазоне, мы оценивали LOD как ниже:

$$ \mathrm{LOD}=\frac{3{\sigma}_0}{s} $$ (5)

Процедура ассея

Вся процедура ассея состояла из трех основных шагов: (1) сбор данных, (2) обнаружение и получение результата, и (3) отображение и хранение результата. Сначала тест-полоска загружалась в картридж и вставлялась в прибор. Измерение проводилось просто нажатием кнопки обнаружения и вводом информации о пациенте (опционально, может быть введен анонимный код). Информация передавалась в микроконтроллер (MCU) и хранилась. Затем MCU активировал температурный сенсор и лазерный диод для начала теста. Одновременно температурные данные, полученные MCU, отправлялись на LCD для отображения в реальном времени и построения графика. После обнаружения MCU рассчитывал значение AUC и представлял результат на экране.

Результаты и обсуждение

Характеризация наночастиц

УФ-Vis спектры конъюгированных нанопризмов показаны на рис. 2a, указывая, что максимальный пик находится при 1130 нм. Абсорбция AuNPr при длине волны лазера (1064 нм) составляет 92% от максимальной абсорбции при 1130 нм. SEM и TEM изображения (рис. 2b, c) собирались для визуализации морфологии наночастиц, подтверждая большинство треугольных форм.

Характеризация золотых нанопризмов. a УФ-Vis спектры наночастиц. Репрезентативные изображения неконъюгированных наночастиц, визуализированных b SEM и c TEM

Оптимизация условий измерения в приборе

В термическом сенсировании время обнаружения и расстояние от лазерного диода до тестовой линии — основные факторы, влияющие на сигнальный отклик [27, 28]. Два фактора изучались для оптимизации условий измерения. Для оптимизации времени облучения мы облучали полоски 10 мин и записывали изменения температуры обоими сенсорами соответственно. Как видно на рис. 3a, температура продолжала повышаться в течение 10 мин, но повышение температуры начало достигать плато после 120 с. Этот результат совпадает с предыдущими исследованиями, в которых наблюдалась похожая тенденция изменений термического сигнала во времени [28]. Учитывая требования POCT и энергопотребление, время обнаружения прибора устанавливалось на 120 с.

Оптимизация термического сенсирования. a Изменения температуры при 10 мин облучения. b Термический сигнал при разных расстояниях облучения

Оптимизация расстояния затем выполнялась. Рис. 3b показывал, что термический сигнал уменьшался с увеличением расстояния между лазерным диодом и тестовой линией. Причина может быть в том, что лазерная мощность, достигающая тестовой линии, аттенуировалась по мере увеличения расстояния эффективной облученной области. Для получения максимального сигнального отклика расстояние устанавливалось на 7 мм.

Влияние температуры окружающей среды на термическое сенсирование

Поскольку термическое сенсирование тесно связано с температурой, необходимо было исследовать, как температура окружающей среды влияет на термическое сенсирование. Температура окружающей среды варьировалась от 27,5 до 40 °C с использованием инкубатора. Всего 4 образца измерялись в каждой точке температуры с интервалом 2,5 °C. Кривые термического сигнала versus температуры окружающей среды измерялись для пустого и 1 OD/мл полосок соответственно обоими термическими сенсорными методами. Параметры подгоняющей кривой температуры окружающей среды показаны в таблице 1. Рис. 4a показывает, что в проводимом режиме наклоны кривых были в целом согласованы для разных концентраций, указывая на то, что изменения температуры окружающей среды имели одинаковый эффект на разные концентрации. В результате кривая эффекта окружающей среды может использоваться для калибровки количественных результатов. В радиационном режиме наклоны кривых (рис. 4b), соответствующие двум концентрациям, были согласованы друг с другом, но обе кривые показывали нисходящую тенденцию. Результаты указывают на то, что проводимый режим более надежен при измерении образцов в условиях с высокой вариабельностью температуры.

Влияние температуры окружающей среды. a Изменения термического сигнала с температурой окружающей среды в проводимом режиме. b Изменения термического сигнала с температурой окружающей среды в радиационном режиме

Квантификация наночастиц

Термическое сенсорное обнаружение

Для получения стандартных квантификационных кривых два термических сенсорных метода (Дополнительный файл 1: Рисунок S5) использовались соответственно для обнаружения тест-полосок, содержащих наночастицы в диапазоне от 0 до 10 OD/мл. Те полоски (Дополнительный файл 1: Рисунок S6a), содержащие разные концентрации наночастиц, обнаруживались переносным прибором (см. раздел «Материалы и методы»). Настройка обоих сенсоров в приборе представлена в Дополнительном файле 1: Рисунки S5a и S5b. Четыре образца тестировались для каждой концентрации при температуре окружающей среды 27,5 °C. Прибор применял метод AUC для расчета термического сигнала в тестовой линии. Следовательно, квантификация термического сигнала была пропорциональна количеству наночастиц на тестовой линии. Квантификационные кривые (рис. 5a) генерировались линейной регрессией данных, полученных от термического сигнала против концентрации наночастиц, и представлены формулами в таблице 2.

Квантификация наночастиц. a Стандартные квантификационные кривые тремя методами. b Количественные результаты при низкой концентрации с линейными кривыми

Таблица 2 показывает, что чувствительность радиационного режима была в 15 раз выше, чем проводимого режима. LOD проводимого и радиационного режимов составляли 0,053 OD/мл и 0,023 OD/мл соответственно. В термическом сенсировании радиационный режим улучшил предел обнаружения (LOD) в 2 раза по сравнению с проводимым режимом. Стабильность LFA полосок также тестировалась, как изображено в Дополнительном файле 1: Рисунок S7. Проводимый термический сенсорный режим требует передачи тепла между двумя твердыми телами. Когда температура тестовой линии быстро повышалась, требовалось время (время релаксации) для сенсора, чтобы достичь той же температуры, что и тестовая линия. В результате температура сенсора была ниже фактической температуры в тестовой линии в конце обнаружения. С другой стороны, радиационный режим не требовал передачи тепла к сенсору, так как сенсор непосредственно обнаруживал ИК волну, излучаемую тестовой линией, для получения её текущей температуры. В проводимом режиме обнаружения часть тепла диссипировалась из-за наличия хороших термических проводников, работавших как радиатор, в то время как в радиационном обнаружении только воздух и сама полоска участвовали в диссипации тепла. Эти причины могут объяснить, что чувствительность проводимого метода ниже радиационного.

При тестировании полосок с концентрацией 10 OD/мл мы обнаружили, что был след от горения при использовании радиационного (бесконтактного) сенсорного режима. Одна из возможных причин этого явления в том, что в бесконтактном измерении низкая теплопроводность воздуха позволяет теплу удерживаться в тестовой строке и менее эффективно диссипировать, увеличивая эффективную локальную температуру и в конечном счете вызывая горение мембраны.

В контактном режиме обнаружения, однако, сенсор с большой теплопроводностью действовал как среда и радиатор. Таким образом, тепло проводилось к сенсору, так что горение не происходило в тестовой строке.

Сравнение между термическим сенсированием и визуальным обнаружением

Благодаря своей популярности для переносных устройств и широкому использованию, мы сравнили термическое сенсирование с визуальным обнаружением по способности обнаружения. Для визуального обнаружения изображения полоски делались обычной цифровой камерой микроскопа. Тест-полоски монтировались в картридж для обеспечения позиционной согласованности анализа изображений аналогичным образом, как и с термическим сенсированием. Программное обеспечение Image J использовалось для анализа серого значения в тестовой линии для разных концентраций наночастиц. Стандартная кривая (рис. 5a) визуального метода обнаружения строилась на основе результатов этого анализа. Линейный диапазон между серым значением и концентрацией наночастиц составлял 0,2–10 OD/мл (R² был 0,770 для диапазона 0–0,2 OD/мл, поэтому они отбрасывались из дальнейшего анализа). Предел обнаружения составлял 0,268 OD/мл. Результаты указывали, что термическое сенсирование могло снизить LOD в 5–12 раз по сравнению с визуальным обнаружением. В исследовании Цинь они обнаружили, что LOD для визуального анализа был в 100 раз выше термического контраста [21]. Поскольку они использовали высокую лазерную мощность и инфракрасную камеру, они получили большую разницу в LOD. Одно разумное объяснение улучшения LOD в том, что термическое сенсирование способно измерять наночастицы сверху и под поверхностью мембраны. Еще одно преимущество термического сенсирования — более высокая стабильность, чем визуальное обнаружение. Термическое сенсирование генерирует тепло наночастицами на всей тестовой линии. Визуальное обнаружение полагается только на цветовую реакцию наночастиц на поверхности тестовой линии. Даже если концентрации аналита двух тест-полосок одинаковы, распределение наночастиц на Т-линии в касательной плоскости различается; таким образом, визуальная инспекция приведет к разнице в результатах обнаружения, в то время как термическое сенсирование более стабильно и воспроизводимо. Наоборот, чувствительность визуального обнаружения была в 2 раза выше термического сенсирования. Визуальное обнаружение — прямой метод квантификации наночастиц, в то время как термическое сенсирование — косвенное измерение концентрации наночастиц путем измерения изменений температуры, что может частично объяснять отсутствие чувствительности. Рис. 5b демонстрирует, что линейный диапазон обнаружения для термического сенсирования может быть до 0 OD/мл, с R² 0,972 (проводимый) и 0,987 (радиационный), указывая на то, что термическое сенсирование имеет лучший потенциал для своих применений в раннем обнаружении в POCT, чем колориметрическая квантификация, поскольку целевые аналиты находятся в более низких концентрациях.

Количественное обнаружение ХГЧ

Наконец, биомаркер ХГЧ квантифицировался нашей системой для валидации термического сенсирования. Оба проводимый и радиационный режимы применялись для квантификации ХГЧ. Оптическая мощность снижалась до 150 мВт, предотвращая горение полосок. Полоски (Дополнительный файл 1: Рисунок S6b) с четырьмя разными концентрациями тестировались. Рис. 6a и b показывают, что термические сигналы были линейны к концентрации ХГЧ от 35 до 700 мМЕ/мл. Когда концентрация расширялась до диапазона 35–7000 мМЕ/мл, линейность была между логарифмом концентрации и термическим сигналом, как на рис. 6c, d. В проводимом режиме LOD составлял 64,2 мМЕ/мл, что в аналогичном диапазоне с визуальным обнаружением. Однако идеальный LOD радиационного режима составлял 2,8 мМЕ/мл. Данные совпадали с квантификацией наночастиц. По сравнению с другими приборами, применявшими фоттермический эффект (LOD = 5,5 мМЕ/мл) [27], наш прибор в радиационном режиме снизил LOD почти в 2 раза. Эти результаты доказали, что термическое сенсирование — эффективный способ в обнаружении и квантификации LFA.

Стандартные кривые ХГЧ. a Линейная кривая между логарифмом концентрации ХГЧ и термическим сигналом в радиационном режиме. b Линейная кривая между логарифмом концентрации ХГЧ и термическим сигналом в проводимом режиме. c Результаты квантификации ХГЧ в радиационном режиме. d Результаты квантификации ХГЧ в проводимом режиме

Заключение

Метод плазмонного термического сенсирования для обнаружения LFA был установлен. Переносной прибор на основе этого метода был разработан путем применения разных температурных сенсоров (проводимый и радиационный режимы). Изучение влияния температуры окружающей среды продемонстрировало, что она негативно влияет на термическое сенсирование, и проводимый режим менее подвержен влиянию, чем радиационный. В радиационном режиме влияние было более значительным при высоких концентрациях. Оба режима также тестировались для сравнения способности квантификации. При сравнении с традиционным визуальным обнаружением термические сенсорные методы показали 5- до 12-кратное улучшение LOD для квантификации наночастиц. Радиационный режим показал лучшую производительность, чем проводимый режим, как в чувствительности, так и в LOD. В валидации термического сенсирования LFA полоски для обнаружения ХГЧ тестировались, и результаты продемонстрировали, что радиационный режим был намного более чувствительным, чем проводимый режим. Таким образом, мы доказали, что термическое сенсирование — реалистичный и эффективный способ для раннего обнаружения на платформах LFA.

В заключение, плазмонное термическое сенсирование действительно может улучшить аналитическую чувствительность и показывает перспективное будущее в обнаружении LFA для ранних диагностических применений. Описанный здесь переносной прибор предоставил два сенсорных подхода для удовлетворения разных требований.