Смартфонный плазмонный ЭЛИСА для ультра-чувствительного определения миоглобина в точке ухода

Аннотация

Сывороточный миоглобин повышается через 1–2 ч после острого инфаркта миокарда (ОИМ), делая его критическим ранним биомаркером. Мы представляем плазмонический иммуноассэй, использующий фермент-мединированные изменения локализованного поверхностного плазмонного резонанса (LSPR) золотых наностержней (AuNR) для квантификации миоглобина с линейным диапазоном 0,1–1000 нг/мл и пределом детекции (LOD) 0,057 нг/мл. Новый ридер, построенный на датчике окружающего света (ALS) смартфона и 3D-печатанном аксессуаре, преобразует LSPR сдвиги в простой, дешевый вывод (~$2) для ресурсо-ограниченных условий. Концентрации миоглобина, измеренные этим методом, сильно коррелировали с результатами конвенционального ЭЛИСА, подчеркивая клиническую значимость для быстрой триажи ОИМ.

Введение

ОИМ остается ведущей причиной смертности во всем мире: 1,5 млн случаев в США и 500 тыс. в Китае ежегодно. Раннее обнаружение опирается на биомаркеры, быстро растущие после инфаркта; сывороточный миоглобин пикует через 6–9 ч и детектируется уже через 1–2 ч. Конвенциональный ЭЛИСА, хоть и надежен, требует лабораторной инфраструктуры и квалифицированного персонала, ограничивая полезность в точках ухода (POC).

Плазмонические иммуноассэи сочетают специфичность ЭЛИСА с оптическим усилением металлических наноструктур, позволяя глазное определение и высокую чувствительность. Золотые наностержни с настраиваемым LSPR особенно привлекательны для сигнальной трандукции в биосенсорах. Однако количественная интерпретация традиционно требует спектрометров или пластинчатых ридеров, ограничивая полевое развертывание. Здесь мы разрабатываем AuNR-базированный плазмонический ЭЛИСА для миоглобина, сопряженный со смартфон-драйвериным ридером, использующим ALS телефона для захвата интенсивности прошедшего света, предлагая переносимый, недорогой диагностический инструмент.

Материалы и методы

Материалы

Человеческий миоглобин (Abcam, UK), моноclonalные анти-миоглобин антитела (mAb1, mAb2, in-house производство), золотые наностержни (AuNR), глюкозооксидаза (GOx), переоксидаза конюковой корнеплода (HRP) и другие реактивы — от стандартных поставщиков. Сывороточные образцы — из Госпиталя зарубежных китайцев Гуанчжоу.

Аппаратура

LSPR спектры записывали на Synergy H1 пластинчатом ридере; ЭЛИСА абсорбция измерялась при 450 нм на MK3 ридере. AuNR характеризовали PHILIPS TECNAI-10 ТЭМ. Смартфон-ридер собирали на 3D-печатанном шасси (часть 1: 100×40×40 мм, часть 2: 76×13×12 мм), питание от двух 1,5 В батарей. 850 нм LED, выровненный с ALS, позволял измерять прошедший свет через приложение Light Meter (Android; совместим с iOS).

Синтез AuNR

Посев-мединированный рост дал AuNR с аспектным отношением, настраиваемым концентрациями AgNO₃ и CTAB. Финальные стержни инкубировали 12 ч под перемешиванием перед использованием.

Протокол плазмонического иммуноассэя

96-колончатые пластины накрывали mAb1 на ночь, блокировали БСА, хранили при –20 °C. GOx-маркированный mAb2 (GOx-Ab2) добавляли в колодки с варирующими концентрациями миоглобина, затем глюкозу и AuNR в присутствии HRP и CTAB. Хищение AuNR H₂O₂ генерировало синий сдвиг LSPR пика и снижение абсорбции при 850 нм, пропорциональное количеству миоглобина. Интенсивность прошедшего света записывала смартфон-ридер, генерируя калибровочную кривую. Сывороточные образцы разбавляли 10-кратно и обрабатывали идентично.

Анализ данных

Линейная регрессия в Origin 9.0; все ассэи в трипликате для воспроизводимости.

Результаты и обсуждение

Принцип ассэя

GOx на mAb2 конвертирует глюкозу в глюконовую кислоту и H₂O₂. H₂O₂ в присутствии HRP и Br⁻ хищает AuNR, сдвигая LSPR пик к более коротким волнам и снижая абсорбцию 850 нм. Величина сдвига или потери интенсивности прямо отражает концентрацию миоглобина.

Оптимизация

Оптимальные HRP (1,5 мкМ) и CTAB (6,25 мкМ) максимизировали LSPR сдвиг. 30-минутное хищение с 100 мкМ H₂O₂ дало стабильные сигналы. Более высокие H₂O₂ вызывали выраженный синий сдвиг и морфологическое изменение от прямоугольных к эллиптическим стержням, подтверждая механизм хищения.

Производительность смартфон-ридера

ALS-базированный ридер измерял интенсивность прошедшего света при 850 нм с <1% вариацией относительно коммерческого пластинчатого ридера, достигая 99,1% корреляции (R²=0,991). Весь аксессуар стоит примерно $2.

Аналитическая чувствительность

Используя LSPR сдвиг, ассэй квантифицировал миоглобин 0,1–1000 нг/мл с LOD 57,8 пг/мл. При чтении смартфоном линейный диапазон остался идентичным, LOD 64,1 пг/мл. Клинические сывороточные измерения показали сильное согласие с ЭЛИСА (R²=0,98), валидируя диагностический потенциал метода.

Сравнение с ЭЛИСА

Традиционный ЭЛИСА давал линейный диапазон 25–1000 нг/мл и LOD 22,7 нг/мл. Плазмонический ассэй поэтому предлагает ~400-кратно более низкий LOD и более широкий динамический диапазон, делая его превосходным для раннего обнаружения ОИМ.

Заключение

Мы продемонстрировали золотой-наностержневый плазмонический ЭЛИСА, детектирующий сывороточный миоглобин с беспрецедентной чувствительностью (LOD=0,057 нг/мл) и простым смартфон-ридером. Платформа обходит сложную инструментацию, предлагая жизнеспособное, дешевое решение для POC диагностики ОИМ в ресурсо-ограниченных средах.

Аббревиатуры

• Ab1: Анти-миоглобин антитело
• Ab2: Анти-миоглобин антитело 2
• ALS: Датчик окружающего света
• AMI: Острый инфаркт миокарда
• AuNRs: Золотые наностержни
• ELISA: Фермент-связанный иммуносорбентный ассэй
• GOx: Глюкозооксидаза
• HRP: Переоксидаза конюковой корнеплода
• H₂O₂: Перекись водорода
• LSPR: Локализованный поверхностный плазмонный резонанс
• Myo: Сывороточный миоглобин
• POCT: Точечное тестирование