Быстрое на-месте обнаружение ронгалита в пищевых продуктах с использованием аptaмер-базированного сэндвич-латерального флоу-стрип теста

Аннотация

Мы представляем быстрый, удобный латеральный флоу-стрип ассэй (LFSA), использующий два высокоспецифических аptaмера — A09 и B09 — функционализированных золотыми наночастицами (AuNP) для детектирования ронгалита, опасного реактива, иногда используемого как пищевая добавка. Биотинированный аptaмер A09 иммобилизован на стрептавидин-покрытой нитроцеллюлозной мембране как захват-проба, в то время как AuNP-конъюгированный аptaмер B09 служит сигнальной пробой. Ассэй даёт чёткую красную линию в тестовой зоне при концентрации ронгалита всего 1 мкг/мл, видимую невооружённым глазом в течение 15 минут, что делает его идеальным для на-месте скрининга сельскохозяйственных и пищевых продуктов.

Введение

Ронгалит (гидроксиметилсульфинат натрия) широко используется в промышленном окрашивании и полимерной химии как восстановитель. Однако его непреднамеренное или намеренное добавление в пищевые продукты вызвало серьезные проблемы со здоровьем, включая выделение формальдегида и неблагоприятные эффекты, сообщенные в Китае. Надежные, быстрые методы детектирования поэтому необходимы для защиты пищевой безопасности и общественного здоровья.

Аptaмеры — односторонние ДНК или РНК молекулы — предлагают уникальные преимущества перед антителами: они химически синтезируются с высокой партионной согласованностью, проявляют низкую иммуногенность и могут быть легко модифицированы для различных сенсорных платформ. Хотя электрохимические и фермент-связанные аptaмер-ассэи для ронгалита существуют, они часто требуют сложной инструментарии и продолжительного времени анализа. В противовес, латеральные флоу-стрип ассэи (LFSA) предоставляют одношаговое, портативное и низкокостное решение, подходящее для точечного тестирования (POCT).

На данный момент лишь немногочисленные аptaмер-базированные хроматографические стрип-ассэи таргетировали ронгалит. Учитывая растущий регуляторный надзор и распространённость нелегальных добавок, мы разработали сэндвич-формат LFSA, использующий специфичность двух аptaмеров и оптическую ясность AuNP, позволяя быстрое на-месте детектирование ронгалита в различных пищевых матрицах.

Материалы и методы

Материалы и реактивы

Ронгалит получен от Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. Хлораурат золота(III) тригидрат (HAuCl₄) и тринатрий цитрат куплены у Sigma-Aldrich (USA). Вспомогательные реактивы (NaCl, BSA, сахароза, PEG₂₀₀₀₀, Твин-20) получены от Beijing Biotopped Science and Technology Co., Ltd. Нитроцеллюлозные (NC) мембраны (Pall 90, Pall 170, Millipore 135) поставлены Pall Corporation и Millipore Corporation через Jiening Biotech Company. Пищевые образцы — рисовые лепешки (эрси), лапша, тофу, тофу с глюконо-дельта-лактоном — собраны на местных рынках.

Подготовка аptaмеров через SELEX

Протокол систематической эволюции лигандов экспоненциальным обогащением (SELEX) был следован для изоляции аptaмеров с высокой аффинитетом к ронгалиту. Исходная 82-мерная ssDNA библиотека (5′-GACATATTCAGTCTGACAGCG-N₄₀-GATGGACGAATATCGTCTAGC-3′) инкубировали с ронгалитом, несвязанные последовательности отмыли, а связанные аptaмеры амплифицировали ПЦР. После 12 циклов обогащения — включая контр-селекцию против структурно родственных соединений — клональное секвенирование выявило два высокоаффинных аptaмера: A09 и B09. Их последовательности приведены ниже и синтезированы Tsingke Biological Technology.

• Первичный аptaмер A09 (биотинированный): 5′-Biotin-GACATATTCAGTCTGACAGCGGAAGCGGGTCAGTCCAACTCACGGTCTCGCATGCACGGGAGATGGACGAATATCGTCTAGC
• Вторичный аptaмер B09 (биотинированный): 5′-Biotin-GCTAGACGATATTCGTCCATCTCCCGTGCATGCGAGACCGTGAGTTGGACTGACCCGCTTCCGCTGTCAGACTGAATATGTC-HS-3′

Производство AuNP

Золотые наночастицы (~40 нм диаметр) синтезированы цитратным восстановлением HAuCl₄ по стандартному протоколу. Размер и монодисперсность подтверждены UV/Vis спектроскопией (λ_max ≈ 530 нм) и ПЭМ (Рис. 2). Вторичный аptaмер B09 конъюгирован к AuNP инкубацией 1 мл AuNP раствора с 4 мкл 100 мкМ B09, затем солевая осаждение, центрифугация и ресуспензия в 1 мл ФСБ (pH 7,4) с 5 % BSA, 5 % сахарозы, 1 % PEG₂₀₀₀₀ и 0,05 % Твин-20.

Дизайн латерального флоу-стрипа

Сборка LFSA (Рис. 3) включала пробоотборную подложку, золото-конъюгатную подложку, NC мембрану (Pall 90) и абсорбирующую подложку на картонной базе. Пробоотборная подложка предварительно обработана ФСБ + 3 % BSA + 0,05 % Твин-20 и высушена при 37 °C за 2 часа. Золото-конъюгатная подложка получила B09-AuNP. Тест-линия на NC мембране создана нанесением 1 мкл биотин-A09 (10 мкМ) смешанного с 10 мкл стрептавидина (1 мг/мл) на 1 час при 4 °C, в то время как контрольная линия состояла из стрептавидина в одиночестве. После высыхания стрип разрезали на 40-мм секции и хранили ночью при 37 °C.

Тест специфичности

Тест-стрипы подвергали 80 мкл 10 мкг/мл ронгалита, формалина или деионизированной воды. Появление чёткой красной тест-линии подтвердило специфичность, тогда как контрольная линия оставалась видимой при всех условиях.

Дозазависимый тест

Концентрации ронгалита (0, 0,8, 1, 5, 10 мкг/мл) готовили в ФСБ и 80 мкл наносили на пробоотборную подложку. Видимая красная линия в течение 15 минут определяла предел детектирования, наблюдавшийся при 1 мкг/мл.

Тест пищевых образцов

Пять пищевых образцов, подозреваемых на содержание ронгалита, экстрагировали (1 г + 10 мл воды). После фильтрации 80 мкл каждого экстракта тестировали на LFSA. Результаты кросс-валидировали высокопроизводительной жидкостной хроматографией (HPLC).

Результаты и обсуждение

Аффинность и специфичность аptaмеров

Нелинейная регрессия насыщения кривых (Рис. 4а) дала диссоциационные константы 61,1 ± 16,4 нМ для A09 и 39,8 ± 12,7 нМ для B09, подтверждая сильное, специфическое связывание с ронгалитом (Рис. 4б).

a — кривые связывания для A09 и B09 (определение Kd). b — высокоаффинное взаимодействие между аptaмерами и ронгалитом.

Производительность ассэя

Сэндвич LFSA производит красную тест-линию, когда AuNP-B09 связывает ронгалит и захватывается иммобилизованным A09. Контрольная линия, формируемая связыванием стрептавидина избыточным AuNP-B09, подтверждает целостность ассэя (Рис. 5). Тест специфичности против формалина и деионизированной воды не дал ложноположительных результатов, и предел детектирования установлен на 1 мкг/мл — значительно ниже уровней, сообщаемых в загрязненных пищевых образцах.

Специфичность (a) и чувствительность (b) LFSA. a — 80 мкл 10 мкг/мл ронгалита; b — стандартные растворы (0–10 мкг/мл) протестированы.

Анализ пищевых образцов подтвердил наличие ронгалита в нескольких продуктах, подтверждённый HPLC (Таблица 1). Робастность ассэя атрибутирована оптимизированному буферу (ФСБ pH 7,4 + 5 % BSA + 5 % сахароза + 1 % PEG₂₀₀₀₀ + 0,05 % Твин-20) и выбору Pall 90 NC мембраны, обеспечивавшей оптимальный флоу и минимальное неспецифическое связывание.

По сравнению с хроматографическими методами (ГХ, HPLC), LFSA предлагает сравнимую чувствительность, устраняя необходимость в сложной инструментарии и длительных времени обработки. Её низкая стоимость, одношаговая операция и визуальный ридаут делают её идеальной для на-месте инспекций пищевой безопасности и регуляторного соответствия.

Заключение

Мы разработали надежный, стоимостно-эффективный сэндвич-формат LFSA, детектирующий ронгалит в пищевых матрицах с пределом 1 мкг/мл. Ассэй использует специфичность дуальных аptaмеров и оптическую ясность AuNP, позволяя немедленное на-месте скрининг. Эта платформа может сыграть ключевую роль в смягчении пищевого ронгалита загрязнения и защите общественного здоровья.

Аббревиатуры

AuNP

Золотые наночастицы

HPLC

Высокопроизводительная жидкостная хроматография

LFIA

Латеральный флоу иммуноассэй

LFSA

Латеральный флоу стрип ассэй

NC мембрана

Нитроцеллюлозная мембрана

POCT

Точечное тестирование (point-of-care testing)

SELEX

Систематическая эволюция лигандов экспоненциальным обогащением

ПЭМ

Проницающая электронная микроскопия