Быстрое обнаружение ронгалита с помощью сэндвич-анализа с боковой полосой потока с использованием пары аптамеров

Фон

Ронгалит (гидроксиметилсульфинат натрия) - это промышленный реагент, обычно используемый для окрашивания в чанах [1] или для эмульсионной полимеризации [2] в качестве восстановителя. Ронгалит также можно найти в кондиционере для воды (например, для снижения содержания хлора и хлорамина) [3], в коммерческих косметических средствах для удаления краски с волос, несмотря на образование формальдегида (известный канцероген для человека), или даже в фармацевтических препаратах в качестве антиоксиданта [4]. . Это соединение также вызвало неблагоприятные эффекты в Китае после его включения в некоторые агропродовольственные товары [5]. Этот разработанный анализ обеспечивает надежную платформу для обнаружения ронгалита на месте и может способствовать решению проблем продовольственной безопасности.

Аптамеры, одноцепочечные олигонуклеотиды и олигопептиды рассматривались как прекрасные альтернативы антителам благодаря их высокой специфичности, легкости и воспроизводимости продукции, легкой модификации и меньшей иммуногенной реакции [6]. Недавние исследования показали большой потенциал аптамеров в качестве биозондов для нацеливания на лекарства, биочувствительности и разработки новых лекарств [7]. Электрохимический [8] и связанный с ферментом аптамер [9] анализ с участием пары аптамеров был разработан как многообещающий инструмент для обнаружения ронгалита. Однако эти методы обычно страдают от длительного анализа и сложных процедур, что затрудняет их применение [10].

Тест полоски бокового потока (LFSA, также называемый полосковым тестом) был впервые разработан в 1956 году как логическое продолжение технологии теста латексной агглютинации [11]. В качестве одноэтапного подхода LFSA привлекла значительное внимание к обнаружению нескольких аналитов на месте благодаря удобному для пользователя формату, низкой стоимости производства, экономии времени и долговременной стабильности в широком диапазоне условий [ 12]. Несмотря на эти положительные характеристики, практическое применение платформы с боковой полосой потока на основе аптамера еще не получило коммерциализации, и сообщалось только о нескольких анализах хроматографической полосы на основе аптамера для обнаружения ронгалита в образцах пищевых продуктов [13]. . Ввиду частого возникновения проблем с продовольственной безопасностью и повсеместного использования ронгалита в качестве нелегальной пищевой добавки, необходимо разработать LFSA на основе аптамера для быстрого обнаружения этого соединения в образцах пищевых продуктов на месте.>

Могут быть разработаны два типа полосовых аптамерных сенсоров с боковым потоком:конкурентные и сэндвич-типа [14]. Платформа сэндвич-типа очень подходит, когда пара аптамеров доступна для конкретной молекулы-мишени. В настоящей работе конкретные наночастицы золота (AuNP), которые, как известно, являются наиболее многообещающими наноматериалами для разработки сенсоров аптамеров (например, с физико-химическими свойствами), были использованы для разработки зонда для обнаружения аптамеров с сэндвич-полосой с боковым потоком. Между тем, процессы конъюгации аптамеров были ранее продемонстрированы на AuNP посредством хемосорбции или физической адсорбции, которая обеспечивает простую, но чувствительную платформу для сенсора аптамера, который позже был использован в качестве сигнального зонда в этом исследовании [15]. Благодаря преимуществам, полученным от использования AuNP и аптамеров, для анализа ронгалита в образцах пищевых продуктов был разработан видимый, быстрый, одноэтапный анализ бокового потока на месте. Чтобы получить этот аптамерный сенсор сэндвич-типа, использовали два аптамерных зонда (A09 / B09), служащие в качестве улавливающих и сигнальных зондов. Положительные результаты этого биосенсора были дополнительно подтверждены высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ).

Методы

Материалы и реагенты

Ронгалит был предоставлен Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. HAuCl ₄ (дегидрат тринатрийцитрата) был приобретен у Sigma Aldrich (США). NaCl, BSA, сахароза, формалин, PEG20000 и Tween20 были от Beijing Biotopped Science and Technology Co., Ltd.

Мембраны NC (т.е. pall 90, pall 170 и Millipore 135) поставляются отдельно от Pall Corporation и Millipore Corporation и приобретаются у Jiening Biotech Company.

Образцы продуктов питания, эрси (тонкие квадратные пряди рисового пирога в Китае), лапша, тофу и глюконо-δ-лактон-тофу, были куплены на близлежащих рынках.

Получение аптамера путем систематической эволюции лигандов путем экспоненциального обогащения (SELEX)

Процесс SELEX включает следующие этапы (рис. 1):(i) инкубация мишени со случайной библиотекой ДНК, (ii) выделение ДНК, связанной с мишенью, (iii) амплификация ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). , (iv) подготовка одноцепочечных ДНК для библиотеки следующего цикла, (v) повторение этапов i – iv в течение 5–15 циклов, включая скрининг с интервальным счетчиком с нецелевыми веществами для удаления неспецифических оцДНК, и (vi) окончательное клонирование и секвенирование обогащенной библиотеки [16].

Типичный процесс выбора аптамера (SELEX)

Аптамеры были подвергнуты скринингу, следуя шагам, описанным ранее. Вкратце, была синтезирована исходная библиотека аптамеров оцДНК, состоящая из 82-мерных нуклеотидов с центральной длинной рандомизированной последовательностью на основе 40 каждого аптамера (Tsingke Biological Technology). Рандомизированная последовательность пула аптамеров оцДНК представляет собой 5'-GACATATTCAGTCTGACAGCG-N40-GATGGACGAATATCGTCTAGC-3 ', где N означает рандомизированный нуклеотид из A, G, C или T.

В этом исследовании для амплификации библиотеки использовали праймер 1 (5'-GACATATTCAGTCTGACAGC-3 ') и праймер 2 (5'-GCTAGACGATATTCGTCCATC-3').

Для скрининга аптамеров, специфически связывающихся с ронгалитом, синтезированная случайная библиотека оцДНК была добавлена ​​в планшет с ронгалитом. Затем несвязавшуюся оцДНК удаляли промыванием; связанную оцДНК выделяли и амплифицировали с помощью ПЦР. Сродство связывания аптамеров постепенно увеличивалось по мере увеличения цикла отбора.

Специфика и К _d ценность отдельных аптамеров определялась аналогично методам Танга [17].

Последовательности аптамеров, использованные в этой работе, были следующими:

• Первичный аптамер A09,

  5'-Биотин-GACATATTCAGTCTGACAGCGGAAGCGGGTCAGTCCAACTCACGGTCTCGCATGCACGGGAGATGGACGAATATCGTCTAGC

• Вторичный аптамер B09,

  5'-Биотин-GCTAGACGATATTCGTCCATCTCCCGTGCATGCGAGACCGTGAGTTGGACTGACCCGCTTCCGCTGTCAGACTGAATATGTC-HS-3 '

Эти последовательности аптамеров (A09 и B09) были синтезированы и приобретены у Tsingke Biological Technology.

Производство AuNP

AuNP были синтезированы путем цитратного восстановления HAuCl ₄ протокол [18]. Монодисперсное образование AuNP адекватного размера было подтверждено спектрофотометрией в УФ / видимом диапазоне (Thermo Scientific ™ Evolution 60S). Были синтезированы AuNP сферической формы (диаметром около 40 нм) и темно-красного цвета. Размер этих немодифицированных AuNP был оценен с помощью закона Бера – Ламберта при 530 ± 2 нм и просвечивающей электронной микроскопии (рис. 2) (JEOL Ltd. JEM-1011).

Вторичный аптамер B09, конъюгированный с AuNP, был получен в соответствии со следующими протоколами [18]. Вкратце, 1 мл свежеприготовленных AuNP инкубировали с 4 мкл раствора вторичного аптамера B09 (100 мкМ), и смесь хранили в выдвижном ящике при комнатной температуре не менее 16 часов. Затем при осторожном встряхивании рукой по каплям добавляли во флакон один молярный раствор NaCl до достижения конечной концентрации в смеси 0,1 М. Флаконы хранились в выдвижном ящике не менее 1 дня перед использованием. Неконъюгированные тиолированные аптамеры удаляли центрифугированием при 12000 g . в течение 20 мин при 4 ° C. Пробирки вынули из центрифуги и получили прозрачный супернатант с наночастицами на дне пробирок. Смесь центрифугировали еще 5 мин в случае надосадочной жидкости красного цвета. Надосадочную жидкость осторожно отбирали пипеткой, и наночастицы, наконец, диспергировали в 1 мл 0,01 M PBS (фосфатно-солевой раствор) буфера (pH =7,4), содержащего 5% BSA, 5% сахарозы, 1% PEG20000 и 0,05% Tween20. / P>

Дизайн полосы бокового потока

LFSA был разработан, как показано на рис. 3. Вкратце, полоска содержала несколько перекрывающихся подушечек на образце задней карты (GF-08, 20 × 300 мм), золотой конъюгат, нитроцеллюлозную (NC) мембрану (Pall 90, 60 × 300. мм) и амортизирующие (H-5076, 20 × 300 мм) подушки. Длина нахлеста 2 мм. Прокладку для образца погружали в 0,01 M буфер PBS (pH =7,4), содержащий 3% BSA и 0,05% Tween20, а затем сушили при 37 ° C в течение 2 часов. Подушку золотого конъюгата обрабатывали 0,01 M буфером PBS (pH =7,4), содержащим 5% BSA, 5% сахарозы, 1% PEG20000 и 0,05% Tween20. Затем функциональные AuNP распыляли из распылителя (XYZ3010-1429) на обработанную подушечку конъюгата золота. Один микролитр аптамера биотин-A09 (10 мкМ) инкубировали с 10 мкл стрептавидина (1 мг / мл) в течение 1 ч при 4 ° C. Затем конъюгированный с аптамером стрептавидин наносили на дозатор (XYZ3010-1429) на NC-мембрану для формирования тестовой линии, в то время как стрептавидин (1 мг / мл) наносили на прибор для формирования контрольной линии. После этого обработанную НК-мембрану сушили при 37 ° C в течение 2 ч для иммобилизации. Наконец, полоски были собраны, и LFSA был разрезан на полоски шириной 40 мм и хранился при 37 ° C в течение ночи до использования.

ПЭМ-изображения AuNP (40 нм)

Типичная конфигурация тест-полоски с боковым потоком (формат «сэндвич»)

Тест на специфичность

Восемьдесят микролитров раствора ронгалита (10 мкг / мл) добавляли в подушечку для образцов собранных полосок. Этот шаг был повторен для других встречных целей, включая формалин и деионизированную воду, для тестов на специфичность. Деионизированная вода использовалась в качестве контроля. Красная линия должна появиться в ожидаемой области с линиями. Каждый контроль повторялся дважды.

Дозозависимый тест

Как и в конкретном тесте, были приготовлены растворы ронгалита с различными концентрациями (0,8, 1, 5 и 10 мкг / мл). Восемьдесят микролитров раствора ронгалита добавляли к подушке для образца собранных полосок. Наблюдение красного цвета в течение 15 минут на тестовой линии считалось критерием определения предела обнаружения.

Тест на образец еды

Чтобы оценить практичность и точность этого нового LFSA, пять образцов продуктов питания, возможно, содержащих добавленный ронгалит, были собраны с рынка вокруг института. Один грамм образца экстрагировали 10 мл воды. Затем 80 мкл раствора экстракта каждого образца наносили на полосу бокового потока на основе аптамера для обнаружения ронгалита. Эти результаты были подтверждены методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).

Результаты и обсуждение

Константы специфичности и диссоциации ( K _d ) выбранных аптамеров

Различные концентрации аптамеров A09 и B09 инкубировали с фиксированным количеством ронгалита. Кривые насыщения, отображающие измеренное поглощение при 450 нм в зависимости от соответствующей концентрации аптамера на входе, показаны на рис. 4а. Для K использовался нелинейный регрессионный анализ. _d расчет стоимости. K _d значение A09 составляет 61,12 ± 16,36 нМ, а B09 - 39,81 ± 12,73 нМ. Как показано на рис. 4b, сродство связывания между A09 / B09 и ронгалитом высокое.

а Измерение K _d значение A09 и B09. GraphPad Prism использовался для выполнения нелинейного анализа подгонки отверждения для K _d расчет. б Аффинность специфического связывания между A09 / B09 и ронгалитом

Специфичность и чувствительность

Аптамер A09, меченный биотином (захватывающий аптамер), был связан со стрептавидином, первоначально выстланным на мембране. Эта линия была выбрана в качестве тестовой. Тем временем стрептавидин был выровнен по контрольной зоне.

Как показано на фиг. 5а, как только вторичный аптамер AuNP (в качестве сигнального зонда) связывается с ронгалитом, первичный аптамер, выстилаемый в тестовой зоне, связывается с другим сайтом этого соединения. В случае положительного анализа на тестовой зоне должна появиться красная линия, генерируемая AuNP. Что касается контрольного эксперимента, стрептавидин в контрольной зоне захватывает оставшийся AuNP-меченный аптамер B09, модифицированный биотином, тем самым обеспечивая постоянный контрольный сигнал.

Специфика ( а ) и чувствительность ( b ) LFSA для ронгалита. а 80 мкл раствора ронгалита (10 мкг / мл) добавляли в подушечку для образца собранных полосок. Этот шаг был повторен для других контр-мишеней, включая формалин для тестов на специфичность. Деионизированная вода использовалась в качестве контроля. б Были приготовлены стандартные растворы ронгалита с различной концентрацией (0, 0,8, 1, 5 и 10 мкг / мл). 80 мкл стандартных растворов было перенесено на подушку для образца, и наблюдение красного цвета в течение 15 минут на тестовой линии считалось критерием для определения предела обнаружения

Как показано на рис. 5b, результат показывает, что ронгалит легко обнаруживается невооруженным глазом при концентрациях всего лишь 1 мкг / мл.

Эти образцы пищевых продуктов были проанализированы с помощью разработанного здесь LFSA, и результаты показаны в таблице 1.

Интересно, что контрольная линия не сохранялась после каждой LFSA. Высокие концентрации ронгалита или ионов соли могут привести к слабому сигналу в контрольной зоне. Следовательно, состав буфера для ресуспендирования критически влияет на характеристики теста на полоске. Согласно полученным результатам, в качестве буфера для повторного суспендирования был выбран 0,01 M буфер PBS (pH =7,4), содержащий 5% BSA, 5% сахарозы, 1% PEG20000 и 0,05% Tween20.

Состав различных подушечек оказывает сильное влияние на эффективность анализа полосок. Среди различных альтернатив NC-мембрана оказалась наиболее подходящей твердой подложкой для адсорбции и гибридизации нуклеиновых кислот. NC широко использовался в качестве сигнальной площадки в полосе бокового потока, поскольку он обеспечивает достаточную скорость потока [19]. Для этих анализов подходят мембраны NC различного размера с соответствующими скоростями потока. В этой работе были протестированы три обычно используемые мембраны NC (например, pall 90, pall 170 и Millipore 135), приобретенные у Jiening Biotech Company. Pall 90 был выбран здесь как наиболее подходящая NC-мембрана для LFSA.

Для обнаружения ронгалита было разработано множество технологий. Однако немногие из них широко применялись при обнаружении на месте, в первую очередь из-за связанных с этим высоких затрат и сложных протоколов, таких как ГХ и ВЭЖХ, которые являются громоздкими для повседневного оператора. LFSA, основанный на пошаговом подходе, стал идеальной платформой благодаря удобному формату, низкой стоимости производства и удобству. Несмотря на более низкую чувствительность, чем у полосок хроматографа, LFSA может быть многообещающим методом для тестирования на месте.

LFSA по-прежнему имеет более низкую чувствительность, чем полоски хроматографа. Кроме того, технологии LFSA с использованием аптамеров демонстрируют некоторые неотъемлемые преимущества по сравнению с иммуноанализом с латеральным потоком (LFIA, метод на основе антител), и это независимо от последних достижений в этой области. Хотя аналогичные анализы также могут быть разработаны с использованием антител, датчики аптамеров обеспечивают стабильность и преимущества низкой стоимости. Кроме того, аптамеры более гибки для разработки различных форматов, поскольку они состоят из нуклеиновых кислот, обладающих внутри- и межмолекулярной гибридизацией, ферментативной репликацией и характеристиками простого определения последовательности. Благодаря этим положительным свойствам для мультиплексных анализов были разработаны многочисленные сенсоры аптамеров.

Кроме того, LFSA может использовать различные метки, включая недавно разработанные квантовые точки [20] и люминофоры с повышающим преобразованием [21]. Однако среди всех зарегистрированных этикеток AuNP наиболее широко используются для LFSA. Самым замечательным свойством метки Au является ее способность окрашивать NC-мембрану, что позволяет наблюдать невооруженным глазом. Эта характеристика отличает LFSA от современных дорогих лабораторных методов, что делает эту технологию удобным аналитическим инструментом.

Тестирование в месте оказания медицинской помощи (POCT) было предложено как идеальный инструмент для снижения стоимости этих анализов. Платформа биосенсора LFSA, наиболее широко известный анализ, в настоящее время используется для POCT [22]. Платформа биосенсора LFIA в основном включает сэндвич-формат и форматы конкуренции (или ингибирования). Как правило, анализы сэндвич-формата разработаны в случае молекул-мишеней, имеющих по крайней мере два эпитопа. В данном документе был разработан двойной аптамер, связанный с ронгалитом в двух разных сайтах связывания, содержащий захватывающие и сигнальные зонды, собранные в формате сэндвич-типа.

Выводы

Простой и недорогой LFSA в формате «сэндвич» был успешно разработан для быстрого обнаружения ронгалита на месте. В анализе участвовали пара аптамеров, конъюгированных с AuNP. После оптимизации некоторых ключевых параметров разработанный анализ обеспечил высокую чувствительность со значениями пределов обнаружения всего 1 мкг / мл. Эта технология может быть легко использована для изучения загрязнения образцов пищевых продуктов ронгалитом. Этот анализ обеспечивает надежную платформу для обнаружения ронгалита на месте и может способствовать решению проблем продовольственной безопасности.

Сокращения

AuNP:

Наночастицы золота

ВЭЖХ:

Высокоэффективная жидкостная хроматография

LFIA:

Иммуноферментный анализ бокового потока

LFSA:

Тест полоски бокового потока

ЧПУ-мембрана:

Нитроцеллюлозная мембрана

POCT:

Тестирование на месте

SELEX:

Систематическая эволюция лигандов путем экспоненциального обогащения

ТЕМ:

Просвечивающая электронная микроскопия