Пегилированные липосомы, нагруженные буфалином:противоопухолевая эффективность, острая токсичность и тканевое распределение

Введение

Буфалин (BF; 3β, 14-дигидрокси-5β, 20 (22) -буфадиенолид, 5β, 20 (22) -буфадиенолид-3β, 14-диол), экстрагированный из Venenum Bufonis , обладает противовоспалительным, кардиотоническим, противовирусным, ацезодинным и противоопухолевым действием [1, 2]. Наша группа также обнаружила, что BF оказывает терапевтическое действие на гепатому, меланому, карциному толстой кишки, глиому и эпителиальную карциному яичников, что может быть связано с его ингибированием пролиферации клеток и индукцией апоптоза клеток [3,4,5,6,7] .

Lan et al. [8] ранее создали модель ксенотрансплантата глиомы у голых мышей, которым BF вводили ежедневно внутрибрюшинно (i.p . ) впрыск. В группе, получавшей BF, почти не наблюдались двухъядерные ядра и митоз; кроме того, ядрышки были меньше, а морфология клеток более правильная, чем в контрольной группе. Хотя BF обладает множеством потенциальных фармакологических эффектов и результаты, полученные к настоящему времени, являются многообещающими, BF как отдельный агент все еще далек от клинического применения. Кроме того, лечение BF связано с нежелательными побочными и побочными эффектами, такими как иммунореакция, повреждение нормальных тканей и высокая токсичность [9].

Несколько систем доставки лекарств, таких как липидные эмульсии, наночастицы и липосомы, были использованы для повышения растворимости, фармакологической активности и биодоступности BF [10, 11]. Более того, активные функциональные полимерные самосборки с индуцированной агрегацией эмиссией (AIE) показали большой потенциал для различных биомедицинских приложений, включая биологическую визуализацию и внутриклеточную доставку лекарств [12, 13]. Среди этих систем доставки лекарств липосомальные препараты имеют несколько преимуществ для использования в качестве систем для внутривенной (i.v.) доставки. Липосомальные препараты могут не только улучшать растворимость в воде и уменьшать побочные эффекты загруженных агентов [14], но также переносить агенты через гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) для более эффективного и действенного лечения опухоли головного мозга [15] . ГЭБ состоит из эндотелиальных клеток капилляров головного мозга и плотных контактов между ними, звездчатых клеток, глиальных клеток и базальной мембраны, которые позволяют только хорошо растворимым в жирах лекарствам проходить и рассеиваться в ткани мозга [16]. Тем не менее у липосомальных препаратов есть недостатки. Поглощение белками плазмы и распознавание мононуклеарной фагоцитарной системой вызывают быстрое выведение загруженного лекарства из крови. Однако модификация поверхности липосом с помощью ПЭГ может решить эти проблемы [17].

В предыдущем исследовании мы подготовили ПЭГилированные липосомы, содержащие буфалин (BF / PEG-LP), и охарактеризовали то же самое, включая их цитотоксичность и фармакокинетические профили, в попытке преодолеть вышеупомянутые проблемы, повысить эффективность доставки лекарств и снизить токсичность. Чтобы расширить это исследование, мы дополнительно оценили физические и химические свойства, противоопухолевую эффективность, острую токсичность и профили тканевого распределения BF / PEG-LP.

Материалы и методы

Химические вещества и реагенты

BF и цинобуфагин (CBG) были приобретены у BaoJi Chenguang Technology Development Co., Ltd. (BaoJi, Китай; чистота 98%, определена с помощью ВЭЖХ) и растворены в ДМСО для хранения при -20 ° C в виде исходных растворов. CBG использовался в качестве внутреннего стандарта (IS). Доксорубицин (DOX) был приобретен у Beijing Solarbio Science &Technology Co., Ltd. (Пекин, Китай; чистота 98%, определена с помощью ВЭЖХ) и растворен в ДМСО для хранения при -20 ° C в виде исходных растворов. BF / PEG-LP были приготовлены в нашей лаборатории (размер частиц 155,0 ± 8,46 нм; дзета-потенциал - 18,5 ± 4,49 мВ; эффективность улавливания 76,31% ± 4,23%, обнаруженная методом ВЭЖХ) [6]. Муравьиная кислота для ВЭЖХ была приобретена у Tedia Company Inc. (Фэрфилд, Огайо, США). Набор для подсчета клеток-8 (CCK-8) был приобретен в Dojindo Laboratories (Кумамото, Япония). Этилацетат для ВЭЖХ был приобретен в Центре разработки химических реагентов Tianjin Kermel (Тяньцзинь, Китай). Ацетонитрил для ВЭЖХ был приобретен в Merck (Дармштадт, Германия). Все остальные реагенты были аналитической чистоты.

Животные

Самцы крыс Sprague-Dawley массой примерно 230–250 г; Мыши Kunming, массой 18–22 г; и 6-недельных голых мышей Balb / c были предоставлены Центром исследований экспериментальных животных Четвертого военного медицинского университета (Сиань, Китай). Животных содержали отдельно в системе индивидуально вентилируемых клеток (ИВК) и кормили стандартным лабораторным кормом и водой ad libitum в течение 5 дней. Все животные не голодали (кроме воды) в течение ночи перед экспериментами. Экспериментальные процедуры с участием животных были рассмотрены и одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Четвертого военного медицинского университета (утверждение 2017-0603-R).

Подготовка стандартных образцов

Калибровочные кривые получали путем добавления в 100 мкл гомогената ткани 20 мкл каждого из рабочих растворов для получения образцов, содержащих 20, 50, 200, 500 и 2000 нг / мл BF. Стандартные образцы гомогената с добавлением добавок были приготовлены заранее и проанализированы с каждой аналитической партией неизвестных образцов.

Безопасность липосом

Тест на гемолиз эритроцитов

У крыс собирали восемь миллилитров крови, затем гепаринизировали и разбавляли 10 мл 0,9% физиологического раствора. Затем образцы цельной крови смешивали со 100 мкл раствора BF или 1 мл суспензии BF / PEG-LP. После 40 мин погружения в водяную баню, поддерживаемую при 37 ° C, образцы центрифугировали при 750 g . в течение 5 мин для удаления эритроцитов и их фрагментов. Супернатант осаждали 2 мл раствора этанол / соляная кислота (39:1; 99% этанол ( об. / Об. ):37% соляная кислота ( масс. / Об. )). Супернатант центрифугировали при 750 g . в течение 5 мин, после чего оптическую плотность измеряли при 398 нм с помощью УФ-спектрофотометра. Положительный контроль, состоящий из дистиллированной воды, и отрицательный контроль, состоящий из 0,9% физиологического раствора, были приготовлены и измерены таким же образом.

Скорость гемолиза (HR%) суспензии наночастиц рассчитывалась следующим образом:

где A _{образец} абсорбция образца, A _{отрицательный} - абсорбция отрицательного контроля, а A _{положительный} абсорбция положительного контроля.

Цитотоксичность пустых липосом

CCK-8 использовали для обнаружения цитотоксичности холостых липосом в клетках гепатоцеллюлярной карциномы человека HepG2 и клетках HCT116 рака толстой кишки человека. Взвешенные клетки HepG2 и клетки HCT116 (1 × 10 ⁴ клеток / лунку) инокулировали в 96-луночный планшет и культивировали в культуральной среде RPMI-1640 до логарифмической фазы. В культуральную среду добавляли разные концентрации холостых липосом. Для каждой концентрации готовили шесть реплик лунок. После инкубации в течение 24 ч среду удаляли и добавляли 100 мкл рабочего раствора CCK-8 (культуральная среда CCK-8:RPMI-1640, 10:100). Через 2 часа инкубации оптическую плотность определяли и количественно оценивали при 450 нм с помощью ридера для микропланшетов (Bio-Rad 680, Геркулес, Калифорния, США).

Влияние pH окружающей среды на стабильность липосом

BF / PEG-LP получали путем гидратации фосфатно-солевым буфером (PBS) при pH 7,4 и pH 5,0 соответственно. Липосомы хранили при 4 ° C в темноте. Поглощение образцов при 296 нм измеряли через 0, 5, 15, 30, 60 и 120 минут.

Эксперимент In Vitro

Пролиферацию клеток оценивали с помощью анализа пролиферации CCK-8. Клетки HepG2, HCT116, A549 и U251 высевали по отдельности при плотности 1 × 10 ⁴ . клеток / лунку в 96-луночных планшетах при 37 ° C с 5% ( об. / об. ) CO ₂ . Через 24 ч в лунки добавляли различные концентрации BF / PEG-LP. Еще через 24 ч инкубации клеточную среду отбрасывали и добавляли 100 мкл рабочего раствора CCK-8. После 2 ч инкубации оптическую плотность определяли и количественно определяли при 450 нм с помощью ридера для микропланшетов (Bio-Rad 680). Процент жизнеспособных клеток и IC ₅₀ значения были оценены по кривой доза-ответ. Значения для каждого образца и контроля были определены по среднему значению для шести повторяющихся лунок.

Эксперимент с ксенотрансплантатом опухоли

Ячейки U251 (1 × 10 ⁷ ) в 0,15 мл PBS подкожно инокулировали голым мышам и позволяли расти в течение 7 дней до достижения размера опухоли более 50 мм ³ . Затем мышей случайным образом разделили на две группы по шесть мышей в каждой. В группе лечения 0,5, 1,0 или 2,0 мг / кг / день BF или BF / PEG-LP были внутрибрюшинно. вводили в течение 21 дня подряд. PBS, содержащий 0,1% ДМСО, вводили в контрольной группе носителя, тогда как в группе положительного контроля вводили 2 мг / кг цисплатина (DPP).

Вес тела мышей измеряли каждые 2 дня. За всеми мышами, получавшими BF и BF / PEG-LP, тщательно наблюдали за состоянием их кожи и волос, объемом потребляемой пищи и воды, фекальными характеристиками и поведенческими изменениями. В конце экспериментов мышей умерщвляли, ксенотрансплантаты опухоли удаляли и взвешивали. Затем трансплантированные опухоли фиксировали в 4% растворе параформальдегида и заливали парафином. Были приготовлены срезы толщиной пять микрон и окрашены гематоксилином и эозином (H&E). Под световой микроскопией наблюдали рост и некроз опухолевых клеток, а также инфильтрацию окружающих тканей.

Фармакологическая оценка

Общее поведение и независимая деятельность

Пятьдесят мышей Kunming были случайным образом разделены на пять групп ( n =10 на группу), которые были i.p. вводили следующее в разовой дозе:физиологический раствор в объеме, введенном в контрольную группу, 20 мг / кг пентобарбитала натрия в качестве положительной контрольной группы и 1,0, 1,5 и 2,0 мг / кг в качестве низкой, средней и высокой -дозовые группы BF / PEG-LP. Затем наблюдали за общим поведением, осанкой, походкой, слюноотделением, миофибрилляцией, нистагмом и выделениями мышей. Через 1 ч введения мышей помещали в бокс открытого поля. Количество мышей, перемещающихся в ящике, подсчитывали в течение 10 минут после того, как мышам давали возможность адаптироваться в течение 1 минуты.

Скоординированные тесты с упражнениями

Мышей случайным образом разделили на пять групп ( n =10 на группу, половина мужчин и половина женщин), которые были i.p. вводили следующее:физиологический раствор в объеме, введенном в контрольную группу, 2,5 мг / кг хлорпромазина гидрохлорида в качестве группы положительного контроля; и 1,0, 1,5 и 2,0 мг / кг BF / PEG-LP для групп с низкой, средней и высокой дозой BF / PEG-LP, соответственно.

Гладкий металлический стержень (диаметр 1,27 см, длина 80 см) был помещен перпендикулярно земле и закреплен снизу в вертикальном положении. После 1 недели лечения тест лазания продолжался 30, 60 и 120 минут соответственно. Мышей поместили на верхушку металлического стержня и разрешили естественным образом ползти вниз. Наблюдали и оценивали координацию мышей, когда они спускались по металлическому стержню. Критерии выставления баллов:0 баллов, пошаговый спуск; 1 балл, скользящий спуск; 2 балла, невозможность спуска; и 3 балла, рефлекса нет.

Острая токсичность

Средняя летальная концентрация (LD ₅₀ ) BF и BF / PEG-LP рассчитывали для оценки острой токсичности. Всего 110 мышей Kunming (половина самцов и половина самок) были случайным образом разделены на 11 групп ( n =10). Пять групп получили один в / в. доза BF в 1,0, 0,37, 0,14, 0,05 или 0,02 мг / кг, и пять групп получили один в / в . доза BF / PEG-LP составляет 4,0, 2,83, 2,0, 1,41 или 1,0 мг / кг. Объем инъекции составлял 0,2 мл. BF сначала растворяли в физиологическом растворе с 1% ДМСО; Затем BF и BF / PEG-LP разбавляли физиологическим раствором для получения желаемой концентрации. Контрольной группе вводили физиологический раствор, содержащий 1% ДМСО. После лечения общее поведение мышей наблюдали в течение 14 дней и регистрировали уровень смертности. Патологические изменения у мышей после в / в . за введением наблюдали с помощью оптической микроскопии (NIKON Eclipse ci, Токио, Япония).

Исследование распределения тканей с помощью ВЭЖХ

Крыс Sprague-Dawley случайным образом разделили на две секции (по четыре группы в каждой секции, n =6 на группу). Эти два раздела были i.p . вводили 0,5 мг / кг BF и BF / PEG-LP соответственно. Образцы основных тканей, включая сердце, печень, селезенку, легкие, почки и мозг, собирали через 5, 15, 45 и 90 минут после введения. Образцы тканей быстро промывали физиологическим раствором (0,9%), удаляя при необходимости кровь и содержимое. После очистки использовали фильтровальную бумагу для промокания образцов. Образцы взвешивали и затем гомогенизировали в 0,9% физиологическом растворе (образец ткани к физиологическому раствору, 1:2, вес / вес ). Полученные гомогенаты хранили при -80 ° C до анализа.

Целевые соединения были экстрагированы, и вмешательство эндогенного белка было устранено методом приготовления жидкость-жидкость [18]. Мы обнаружили, что этилацетат улучшает извлечение экстракции и сводит к минимуму эндогенное вмешательство, что приводит к повышенной чувствительности и селективности обнаружения BF. Следовательно, этилацетат был использован в качестве оптимального растворителя для пробоподготовки. Двадцать микролитров рабочего раствора IS добавляли к 100 мкл гомогената ткани. Затем образцы перемешивали на вортексе в течение 30 с и экстрагировали 2,5 мл этилацетата в течение 2 мин. После центрифугирования при 3500 g в течение 10 мин верхний органический слой переносили в другую пробирку и упаривали при 45 ° C в слабом потоке азота. Остаток восстанавливали в 100 мкл подвижной фазы (ацетонитрил:0,1% раствор муравьиной кислоты / вода, 65:35, об. / Об. ) путем перемешивания на вортексе в течение 5 мин и центрифугирования при 12000 g в течение 10 мин. Затем аликвоту надосадочной жидкости объемом 10 мкл вводили в систему ВЭЖХ (Waters 2995/2996, Waters Corporation, Милфорд, Массачусетс, США). Оптимизированные условия хроматографа для обнаружения BF и IS были представлены ранее [6].

Статистический анализ

Все результаты были выражены как среднее ± стандартное отклонение ( n =3), и различия между составами сравнивали с помощью одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 5. P <0,05 означает значимость во всех случаях.

Результаты и обсуждение

Физические и химические свойства BF / PEG-LP

Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) показала, что BF / PEG-LP имел однородную сферическую форму, как показано в Дополнительном файле 1:Рисунок S1A. Структура BF / PEG-LP была идентифицирована с помощью FT-IR. Как показано в Дополнительном файле 1:Рисунок S1B, характеристики максимальны при 3495 см ⁻¹ . и 3436 см ⁻¹ представляет собой валентное колебание N – H амидной связи, а пик при 1079 см ⁻¹ представляет собой валентное колебание C – O – C эфирной связи в BF / PEG-LP. Чтобы оценить безопасность составов in vitro, скорость гемолиза холостых липосом, BF и BF / PEG-LP определяли с помощью теста на гемолиз эритроцитов, а жизнеспособность клеток HepG2 и HCT116, обработанных холостыми липосомами, измеряли с помощью CCK. -8 проба. Группа BF показала очевидный гемолиз; однако скорость гемолиза в группе BF / PEG-LP была значительно ниже при той же концентрации ( P <0,01). Когда концентрация BF / PEG-LP была увеличена до 200 мкг / мл, скорость гемолиза была явно выше, чем у холостых липосом ( P <0,01, рис. 1а). Результаты анализа CCK-8 показали, что холостые липосомы нетоксичны для клеток HepG2 и HCT116 (рис. 1b).

Физико-химические свойства BF / PEG-LP. а Скорость гемолиза эритроцитов холостых липосом, BF и BF / PEG-LP. Данные представлены как \ (\ overline {x} \) ± s ( n =3). ** P <0,01 против . Группа BF / PEG-LP в той же концентрации. б Цитотоксичность холостых липосом в клетках HepG2 и HCT116. Данные представлены как \ (\ overline {x} \) ± s ( n =6). c Стабильность BF / PEG-LP в условиях различных pH. Данные представлены как \ (\ overline {x} \) ± s ( n =6). ** P <0,01 против . Группа pH 7,4 в тот же момент времени. Сокращения:БФ, буфалин; BF / PEG-LP, буфалиновые ПЭГилированные липосомы

Влияние pH окружающей среды на стабильность BF / PEG-LP оценивали с помощью УФ-спектрофотометрии. На рисунке 1c показано, что поглощение образца из группы с pH 5,0 увеличивалось со временем хранения, указывая на то, что BF / PEG-LP был более стабильным в PBS при pH 7,4 ( P <0,01).

Апоптоз опухолевых клеток in vitro

Апоптоз в клетках HepG2, HCT116, A549 и U251, индуцированный BF / PEG-LP, определяли с помощью анализа CCK-8. IC ₅₀ значения BF / PEG-LP для всех протестированных клеток представлены в таблице 1. BF / PEG-LP значительно снижал жизнеспособность всех типов клеток дозозависимым образом (рис. 2). Ингибирующий эффект BF / PEG-LP был аналогичен эффекту DOX (положительный контроль, 50 мкг / мл) при концентрациях, превышающих 40 нг / мл. Причем на базе ИС ₅₀ значений чувствительность клеток к BF / PEG-LP оценивалась следующим образом:HCT116> HepG2> U251> A549.

Цитотоксичность BF / PEG-LP в HepG2 ( a ), HCT116 ( b ), A549 ( c ) и U251 ( d ) клетки. Данные представлены как \ (\ overline {x} \) ± s ( n =6). * P <0,05, ** P <0,01 против . контрольная группа для каждой клеточной линии. Сокращения:BF / PEG-LP, буфалиновые ПЭГилированные липосомы; DOX, доксорубицин

Общая фармакологическая оценка

После введения BF / PEG-LP общее поведение мышей отличалось от такового в пустой группе. В частности, у мышей в группе высоких доз BF / PEG-LP наблюдались тремор и слюноотделение. После введения мыши оставались в боксе открытого поля в течение 10 мин и регистрировали количество активных сеток. В группе положительного контроля (пентобарбитал) количество активных сеток было всего 342 ± 35, что было значительно меньше, чем в контрольной группе (725 ± 127, P <0,05). Как показано на рис. 3а, количество активных решеток в группе со средней и высокой дозой BF / PEG-LP значительно отличалось от контрольной группы. Тест с подъемом стержней показал, что BF / PEG-LP оказывает определенный стимулирующий эффект на скоординированное движение мышей после недели приема по сравнению с контрольной группой ( P <0,01), тогда как хлорпромазин оказал значительное стимулирующее действие на группу положительного контроля ( P <0,05), как показано на рис. 3b.

Фармакологическое действие BF / PEG-LP на двигательную активность ( a ) и согласованные упражнения ( b ) у мышей. Данные представлены как \ (\ overline {x} \) ± s ( n =10). * P <0,05, * ^* P <0,01 против . контрольная группа в каждый момент времени; ^# P <0,05 по сравнению с группой низких доз BF / PEG-LP. Сокращения:BF / PEG-LP, буфалиновые ПЭГилированные липосомы

Эксперимент с ксенотрансплантатом опухоли

При длительном введении у мышей в группах положительного контроля, BF и BF / PEG-LP наблюдалась умственная отсталость, сниженное потребление пищи, медленная реакция и тусклый мех. Смерть мышей наступила как в группах BF, так и в группах BF / PEG-LP. Показатель противоопухолевой активности в группе положительного контроля составил 36,5%; в группе высоких доз BF - 27,6%; а в группах низких, средних и высоких доз BF / PEG-LP - 11,4%, 28,9% и 38,7% соответственно. За исключением группы с низкими дозами BF, наблюдалась значительная разница между показателями противоопухолевого воздействия в группах, получавших лекарственное средство, и в группе отрицательного контроля ( P <0,05), как показано на рис. 4а. По сравнению с группой низких доз BF, уровень ингибирования опухоли в группе высоких доз BF / PEG-LP был значительно выше ( P <0,01), как показано на рис. 4b.

Ингибирующее действие BF и BF / PEG-LP на рост ксенотрансплантатов глиомы у мышей nude. Сравнение веса опухоли ( a ) и степень подавления опухоли ( b ) в каждой группе. Данные представлены как \ (\ overline {x} \) ± s ( n =10). * P <0,05, ** P <0,01 vs. контрольная группа; ^# P <0,05, ^## P <0,01 против . группа высоких доз BF / PEG-LP. c Окрашивание H&E опухолевых тканей мышей-опухоленосителей. Сокращения:БФ, буфалин; BF / PEG-LP, буфалиновые ПЭГилированные липосомы; ДПП, цисплатин; H&E, гематоксилин и эозин

Ксенотрансплантаты у мышей с опухолью имели узловую форму. Окрашивание H&E показало, что в контрольной группе ядра опухолевых клеток были большими, цитоплазма была маленькой, а рост клеток был интенсивным; в группе высоких доз BF / PEG-LP наблюдалась большая площадь некротизированной опухолевой ткани, и степень некроза была дозозависимой, как показано на рис. 4c.

Острая токсичность

Острая токсичность однократного в / в . определяли дозу препаратов у мышей Kunming. LD ₅₀ значения BF и BF / PEG-LP составляли 0,156 и 3,03 мг / кг соответственно. По сравнению с BF, острая токсичность BF / PEG-LP была значительно ниже ( P <0,01); этот эффект был приписан липосомальному составу, который контролировал высвобождение BF в кровь.

Патологические изменения у мышей после в / в . за введением наблюдали с помощью оптической микроскопии (рис. 5). Патологические изменения наблюдались в нескольких органах, таких как сердце, печень и почки. Были очевидны разрушение волокна миокарда сердца и перелом с кровотечением. Некроз наблюдался в гепатоцитах и ​​легочных эндотелиоцитах.

Патологические изменения наблюдались у мертвых мышей после внутривенного введения 1,0 мг / кг BF и 4,0 мг / кг BF / PEG-LP. Срезы тканей окрашивали H&E и наблюдали с помощью оптической микроскопии. Примечания:Оптический микроскоп:NIKON Eclipse ci; Система визуализации:NIKON Digital Sight DS-FI2 (Токио, Япония); Увеличение:× 200. Сокращения:БФ, буфалин; BF / PEG-LP, буфалиновые ПЭГилированные липосомы; H&E, гематоксилин и эозин

Исследование распределения тканей

Сравнение хроматограмм чистого гомогената ткани и гомогената с добавками, которое показало, что не было значительного влияния на время удерживания BF и CBG (IS), было использовано для анализа селективности метода, как показано в дополнительном файле 1:Рисунок S2. Калибровочные кривые были построены на основе отношения площадей пика BF к IS (Y) в зависимости от концентраций гомогената ткани в диапазоне от 20 до 2000 нг / мл с коэффициентом корреляции R ² > 0,9977 (таблица 2). Эксперименты по прецизионности, точности и извлечению BF в биологических образцах были показаны в Дополнительном файле 1:Таблица S1, а результаты экспериментов по стабильности показаны в Дополнительном файле 1:Таблица S2.

Необработанные данные экспериментов по распределению тканей показаны в Дополнительном файле 1:Таблица S3. После i.v . инъекции BF / PEG-LP, его тканевое распределение зависит от нескольких переменных, таких как состав, размер частиц и дзета-потенциал [19]. Концентрация BF в различных тканях, включая сердце, печень, селезенку, легкие, почки и мозг, определялась количественно через 5, 15, 45 и 90 минут, как показано на рис. 6. Через 45 минут после iv . После введения, концентрация BF в обеих группах была очень низкой в ​​некоторых тканях, таких как сердце, печень, селезенка, легкие и почки, что указывает на то, что распределение и выведение BF происходили быстро. Концентрация BF в головном мозге, но не в других тканях, все еще может быть обнаружена через 90 минут после в / в . в обеих группах, что указывает на то, что распределение и выведение BF в головном мозге происходило относительно медленнее, чем в других тканях.

Тканевое распределение BF в органах крыс. А Молекулярные формулы буфалина ( а ) и кинобуфагин ( b , ЯВЛЯЕТСЯ). Б Профили тканевого распределения BF у крыс после однократного внутривенного введения BF / PEG-LP или BF в дозе 0,5 мг / кг. Данные представлены как \ (\ overline {x} \) ± s ( n =6). Сокращения:БФ, буфалин; BF / PEG-LP, буфалиновые ПЭГилированные липосомы; IS, внутренний стандарт

Между тем, в тканях мозга группы BF / PEG-LP было обнаружено в 1,20 раза более высокое значение BF (333 ± 92,5 нг / г через 5 мин) по сравнению с таковым в группе BF. Кроме того, более высокая концентрация BF была обнаружена в тканях печени, селезенки и мозга в группе BF / PEG-LP. Значительное накопление BF было обнаружено в печени с концентрациями 187 ± 31,0 нг / г в группе BF / PEG-LP и 163 ± 35,0 нг / г в группе BF ( P <0,01). Подобное явление, которое в основном вызвано резким увеличением BF в крови до метаболизма и выведения, наблюдалось в предыдущих исследованиях [20, 21].

Согласно результатам экспериментов по распределению тканей, BF сам может проходить через ГЭБ, возможно, из-за его высокой растворимости в липидах, низкой молекулярной массы (386,52 г / моль) и химической структуры, аналогичной структуре холестерина, с которой он имеет ту же материнскую ядерную структуру. Однако клиническое применение BF ограничено из-за его высокой растворимости в липидах и плохой растворимости в воде. Биодоступность BF низкая, если его не вводить в альтернативной форме. В предыдущем исследовании [6] мы показали, что состав BF / PEG-LP может улучшить растворимость в воде, увеличить продолжительность циркуляции крови, продлить период полувыведения и расширить область применения BF, в том числе для внутривенных инъекций. химиотерапия. В текущем исследовании введение BF / PEG-LP приводило к увеличению концентрации BF в головном мозге, которая сохранялась в течение более длительного времени (90 мин). Более того, наблюдалась значительная разница в концентрации BF между группами BF и BF / PEG-LP через 45 минут (167,59 ± 54,52 vs. 71,52 ± 48,35 нг / г, P <0,01).

В предыдущем исследовании было продемонстрировано, что BF оказывает на сердце дигиталисоподобный эффект, увеличивая частоту сердечных сокращений и сократительную способность миокарда у крыс [22]. Следовательно, кардиотоксичность BF в больших дозах может быть вызвана его накоплением в сердце. Эксперимент по биораспределению в этом исследовании показал, что накопление BF в сердце было ниже в группе BF / PEG-LP, чем в группе BF (95,0 ± 18,5 vs . 134 ± 17.8 ng/g at 5 min, P  < 0.01; 15.32 ± 5.56 vs. 63.79 ± 28.21 ng/g at 15 min, P <0,01). Whether cardiac toxicity can be attenuated with a lower dose of BF requires further verification. Nevertheless, the antitumor effect of BF was sufficiently strong in this study (the IC₅₀ values for glioma cells were nanomolar). For in vivo application, it is critical to decrease the toxicity (especially heart toxicity) and increase the water solubility of BF, which was our focus in this study.

In general, PEGylated liposomes are considered to have no or low immunogenicity. However, according to recent studies, when PEGylated liposomes were repeatedly injected into the same animal, an immune response was triggered [23]. In fact, a second injection of PEGylated liposomes resulted in reduced blood circulation time and increased hepatic and splenic accumulation, which is known as the accelerated blood clearance (ABC) phenomenon. Such immunogenicity of PEGylated liposomes presents major challenges in the research of liposomal formulations and their clinical application. However, liposomal formulations that do not display the ABC phenomenon have been reported, such as a long-circulating DOX-loaded liposomal formulation (Doxil, Sequus pharmaceuticals, Inc., San Francisco, CA, USA), which has been commercialized. DOX was released from the liposomes and entered the spleen, damaging spleen cells and thereby reducing the production of anti-PEG IgM, which could selectively bind with PEG on the surface of the liposomes administered at the second injection. Whether BF/PEG-LP exhibits the ABC phenomenon remains unknown and requires further study. If so, mitigating the ABC phenomenon will require in-depth investigation.

Conclusion

In the present study, we evaluated hemolysis induced by BF/PEG-LP and the cytotoxicity of blank liposomes to verify the safety thereof. Moreover, the effect of environmental pH on the release of BF from liposomes was investigated to assess the stability of BF/PEG-LP. BF encapsulation in a liposomal suspension might affect its antitumor activity in vitro and in vivo and general behavior, acute toxicity, and tissue distribution in vivo. Nonetheless, we believe that the development of the liposomal formulation described in this study has laid a foundation for the future clinical application of BF. Intensive investigation of the relevance of the ABC phenomenon to BF/PEG-LP is warranted in the future.

Доступность данных и материалов

Все данные, полученные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в эту опубликованную статью и файлы с дополнительной информацией к ней.

Сокращения

ABC:

Accelerated blood clearance

AIE:

The aggregation-induced emission

BBB:

Blood-brain barrier

BF:

Bufalin

BF/PEG-LP:

Bufalin-loaded PEGylated liposomes

CBG:

Cinobufagin

CCK-8:

Набор для подсчета клеток-8

IC₅₀ :

Half-maximal inhibitory concentration

i.p.:

Intraperitoneally

IS:

Internal standard

i.v. :

Intravenously

LD₅₀ :

Median lethal concentration

PBS:

Физиологический раствор с фосфатным буфером

RBC:

Red blood cell