Буфалин-загруженные PEGилированные липосомы: усиленная антиопухолевая эффективность, сниженная токсичность и оптимизированная доставка в мозг

Аннотация

Буфалин, кардиальный гликозид, извлекаемый из Venenum Bufonis, демонстрирует сильную антиопухолевую активность, но ограничен низкой биодоступностью и значительной системной токсичностью при введении как свободного препарата. В этом исследовании мы оценили буфалин-загруженные PEGилированные липосомы (BF/PEG‑LP) по физико-химическим характеристикам, безопасности, in vitro цитотоксичности, in vivo антиопухолевой активности, острой токсичности и тканевой дистрибуции. Тесты на гемолиз эритроцитов показали, что BF/PEG‑LP вызывают заметно меньший гемолиз, чем свободный буфалин. Пустые липосомы были не токсичны для клеток HepG2 и HCT116. BF/PEG‑LP индуцировали доза-зависимую а폽тоз в клетках HepG2, HCT116, A549 и U251 с IC₅₀ значениями 21,40 ± 2,39, 21,00 ± 3,34, 43,39 ± 6,43 и 31,14 ± 2,58 нг/мл соответственно. В ксеногрефтах U251 BF/PEG‑LP значительно подавили рост опухоли, достигая 38,7 % ингибирования при 2 мг/кг против 27,6 % для свободного буфалина. Фармакологическая оценка выявила транзиторные поведенческие изменения при максимальной дозе, в то время как медианная летальная концентрация (LD₅₀) увеличилась с 0,156 мг/кг (свободный буфалин) до 3,03 мг/кг (BF/PEG‑LP). Исследования тканевой дистрибуции продемонстрировали на 20 % более высокую концентрацию в мозге и на 30 % более низкую в сердце для BF/PEG‑LP по сравнению со свободным буфалином. Эти находки подтверждают, что PEGилирование улучшает фармакокинетику буфалина, снижает системную токсичность и улучшает воздействие на мозг, поддерживая его дальнейшую разработку как терапевтического средства для глиомы.

Введение

Буфалин (BF) — тритерпеноидный лактон, проявляющий противовоспалительный, кардиотонический, антивирусный и антиопухолевой эффекты. Преклинические работы показали эффективность BF против гепатоцеллюлярного карциномы, меланомы, колоректального карциномы, глиомы и овариального карциномы, в основном через ингибирование пролиферации клеток и индукцию а폽тоза. Однако клиническая трансляция затруднена низкой водорастворимостью BF, ограниченной оральной биодоступностью и доза-зависимой токсичностью к нормальным тканям. Липосомная инкапсуляция предлагает проверенную стратегию для повышения растворимости препарата, защиты активного агента от преждевременной деградации и облегчения таргетной доставки через гематоэнцефалический барьер (БББ). PEGилирование поверхности липосом дополнительно удлиняет время циркуляции и снижает захват мононуклеарной фагоцитарной системой. В более ранней работе мы приготовили BF/PEG‑LP и охарактеризовали их размер, дзета-потенциал и эффективность инкапсуляции. Текущее исследование расширяет ту работу, исследуя профиль безопасности BF/PEG‑LP, антиопухолевую мощность, острую токсичность и биодистрибуцию в преклинических моделях.

Материалы и методы

Реактивы

BF ицинобуфагин (CBG) приобрели у BaoJi Chenguang Technology Development Co., Ltd. (98 % чистоты). Доксорубицин (DOX) служил положительным контролем. BF/PEG‑LP готовили в собственные лаборатории, получая средний диаметр 155 ± 8 нм, дзета-потенциал –18,5 ± 4,5 мВ и эффективность инкапсуляции 76,3 ± 4,2 %. Все остальные химикаты были аналитического чистоты.

Животные

Самцы крыс Sprague‑Dawley, мыши Kunming и 6-недельные голые мыши Balb/c использовали. Животные акклиматизировали, держали на голодовке на ночь, и все протоколы одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (Approval 2017‑0603‑R).

Гемолиз тест

Эритроциты крыс инкубировали с BF или BF/PEG‑LP, и гемолиз квантовали спектрофотометрически при 398 нм. Скорость гемолиза рассчитывали относительно положительного (вода) и отрицательного (физраствор) контролей.

Цитотоксичность пустых липосом

Пустые липосомы тестировали на клетках HepG2 и HCT116 с помощью анализа CCK‑8. Жизнеспособность клеток оставалась >95 % при концентрациях до 200 мкг/мл, подтверждая их не токсичную природу.

In vitro антиопухолевая активность

Клетки HepG2, HCT116, A549 и U251 воздействовали серийными разбавлениями BF/PEG‑LP в течение 24 ч. Жизнеспособность оценивали CCK‑8, а IC₅₀ выводили из доза‑зависимых кривых.

Ксеногрефтная модель U251

Клетки U251 (1 × 10⁷) подкольно инъецировали в голых мышей. Как только опухоли достигали ~50 мм³, мыши получали внутрибрюшинные инъекции BF или BF/PEG‑LP при 0,5, 1,0 или 2,0 мг/кг ежедневно в течение 21 дня. Объем опухоли, масса тела и поведенческие наблюдения записывали. Опухоли собирали, взвешивали и гистологически изучали H&E окраской.

Острая токсичность

Мыши Kunming получали одиночную в/в дозу BF или BF/PEG‑LP (1,0, 0,37, 0,14, 0,05 или 0,02 мг/кг для BF; 4,0, 2,83, 2,0, 1,41 или 1,0 мг/кг для BF/PEG‑LP). Выживаемость мониторили 14 дней, и LD₅₀ рассчитывали методом Reed–Muench.

Тканевая дистрибуция (HPLC)

Крысы Sprague‑Dawley получали в/б 0,5 мг/кг BF или BF/PEG‑LP. Ткани сердца, печени, селезенки, легких, почек и мозга собирали в 5, 15, 45 и 90 мин. Образцы гомогенизировали, экстрагировали этилацетатом и анализировали HPLC (Waters 2995/2996) с подвижной фазой ацетонитрил:0,1 % муравьиная кислота/вода (65:35, v/v). Калибровочные кривые (20–2000 нг/мл) показывали R² > 0,9977.

Результаты и обсуждение

Физико-химические свойства и безопасность

ТЭМ изображения подтвердили равномерную сферическую морфологию. FT‑IR спектры показали характерные пики BF, подтверждая успешную инкапсуляцию. Скорость гемолиза BF/PEG‑LP была <0,5 % при концентрациях до 200 мкг/мл, что на 95 % ниже по сравнению со свободным BF (p < 0,01). Пустые липосомы не показывали цитотоксичности в HepG2 и HCT116.

Стабильность по pH

BF/PEG‑LP сохраняли целостность в ФСБ при pH 7,4, тогда как буфер pH 5,0 индуцировал значительный рост абсорбции, указывая на сниженную стабильность в кислых условиях.

In vitro цитотоксичность

BF/PEG‑LP ингибировали жизнеспособность клеток доза-зависимо во всех тестированных линиях. IC₅₀ составляли 21,4 ± 2,4, 21,0 ± 3,3, 43,4 ± 6,4 и 31,1 ± 2,6 нг/мл для HepG2, HCT116, A549 и U251 соответственно. Активность превосходила DOX (50 мкг/мл) при концентрациях >40 нг/мл. Чувствительность: HCT116 > HepG2 > U251 > A549.

In vivo антиопухолевая эффективность

BF/PEG‑LP значительно снизили объем и массу опухоли по сравнению с свободным BF и контролем. При 2 мг/кг BF/PEG‑LP достигли 38,7 % ингибирования против 27,6 % для свободного BF. H&E окраска выявила обширный некроз в опухолях, обработанных BF/PEG‑LP, пропорционально дозе.

Поведенческие и фармакологические эффекты

Высокая доза BF/PEG‑LP индуцировала легкий тремор и слюнотечение; локомоторная активность умеренно снижалась относительно контролов (p < 0,05). Тесты на лазание по стержню показывали улучшенную координацию после недели лечения (p < 0,01).

Острая токсичность

LD₅₀ увеличились с 0,156 мг/кг (свободный BF) до 3,03 мг/кг (BF/PEG‑LP), отражая ~19-кратное снижение острой токсичности. Гистопатология выявила нарушение кардиомиоцитов и печеночный некроз в группе свободного BF, но минимальные изменения в группах BF/PEG‑LP.

Тканевая дистрибуция

BF/PEG‑LP дали более высокие концентрации в мозге (333 ± 92,5 нг/г при 5 мин) и более низкие в сердце (95,0 ± 18,5 нг/г при 5 мин) по сравнению с свободным BF. Накопление в печени умеренно увеличилось (187 ± 31,0 нг/г против 163 ± 35,0 нг/г). Уровни в мозге оставались детектируемыми до 90 мин, указывая на продолжительное пребывание.

Заключение

PEGилированная липосомная инкапсуляция буфалина заметно улучшает его фармакокинетический профиль, снижает системную и сердечную токсичность и улучшает доставку в мозг. BF/PEG‑LP демонстрирует мощную антиопухолевую активность in vitro и in vivo, особенно против глиомы, и представляет перспективную платформу для клинической трансляции. Будущие исследования должны изучить феномен ускоренного очищения крови и оптимизировать схемы дозирования для максимальной терапевтической выгоды.

Доступность данных и материалов

Все данные, полученные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в статью и её дополнительные информационные файлы.