Изготовление гибридных наноструктур на основе нанокластеров Fe3O4 в качестве тераностических агентов для магнитно-резонансной томографии и доставки лекарств

Аннотация

Сочетание противоопухолевых препаратов с неорганическими нанокристаллами для создания многофункциональных гибридных наноструктур стало мощным инструментом для лечения рака и подавления опухолей. Однако по-прежнему остро стоит задача синтезировать компактные, многофункциональные наноструктуры с улучшенными функциональными возможностями и воспроизводимостью. В этом исследовании мы сообщаем о создании гибридных наноструктур магнетита с использованием Fe ₃ О ₄ наночастицы (НЧ) для образования многофункциональных нанокластеров магнетита (НК) путем сочетания сборки микроэмульсии масло-в-воде и послойного (LBL) метода. Fe ₃ О ₄ Первоначально НК были приготовлены методом самосборки микроэмульсий. Затем слои полиэлектролита, состоящие из гидрохлорида аллиламина (ПАУ) и поли (4-стиролсульфоната натрия) (PSS) и гидрохлорида доксорубицина (DOX), были покрыты Fe ₃ О ₄ NC для построения Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX методом LBL. Свежеприготовленные гибридные наноструктуры, загруженные DOX, продемонстрировали pH-зависимое высвобождение лекарственного средства и более высокую цитотоксичность по отношению к клеткам рака легких (A549) человека in vitro и могут служить в качестве T ₂ контрастные вещества для магнитно-резонансной томографии (МРТ), которые могут значительно улучшить T ₂ расслабляет и приводит к лучшему контрастному эффекту клеточной МРТ. Загруженный DOX, излучающий красные сигналы при возбуждении с длиной волны 490 нм, подходит для приложений биовизуализации. Эта работа предлагает новую стратегию создания Fe ₃ О ₄ - многофункциональная тераностическая наноплатформа на основе T ₂ -взвешенная МРТ, флуоресцентная визуализация и доставка лекарств.

Введение

В последние годы были разработаны различные многофункциональные системы доставки лекарств для будущей диагностики и терапии в биомедицинских целях [1,2,3,4]. Многофункциональные гибридные наноструктуры с интегрированными благоприятными свойствами будут иметь важные приложения, такие как мультимодальная визуализация и одновременная диагностика и терапия [5,6,7,8,9,10,11]. Кроме того, эти наноструктуры представляют собой системы доставки лекарств, реагирующие на раздражители, для улучшения накопления лекарств, повышения терапевтической эффективности и / или уменьшения побочных эффектов. В частности, эти pH-чувствительные системы доставки лекарств привлекли широкий исследовательский интерес. Это связано с тем, что большинство опухолей человека имеют более кислое значение pH, что дает возможность разработать контролируемое высвобождение молекул лекарств [12,13,14,15,16].

За последние несколько десятилетий были разработаны различные гибридные наноструктуры путем комбинирования неорганических наноматериалов с органическим полимером [17,18,19,20], включая магнитные частицы [21,22,23], наночастицы с апконверсией (НЧ) [17, 24] , и мезопористые частицы кремнезема [25]. Среди них магнитные гибридные наноструктуры на основе оксидов железа с относительно большой намагниченностью при комнатной температуре широко используются в биомедицине [26,27,28,29]. Функционализация неорганических наноматериалов, покрытых слоями полиэлектролита, может обеспечить чувствительную к pH инкапсуляцию и высвобождение молекул лекарства [12, 17, 30]. Совсем недавно слои полиэлектролита, состоящие из полистиролсульфоната натрия (PSS) и поликатион-поли (аллиламингидрохлорида) (PAH), были широко изучены [31,32,33,34,35,36]. Недавно также сообщалось о слоях полиэлектролита в сочетании с магнитными и люминесцентными НЧ или молекулами лекарств для многофункциональных систем доставки лекарств [37,38,39]. Оксид железа (Fe ₃ О ₄ ) НЧ привлекают все больше внимания в области магнитно-резонансной томографии (МРТ) и доставки лекарств из-за их уникальных суперпарамагнитных свойств, биосовместимости, низкой цитотоксичности и гибкости [9, 11, 28, 29, 40,41,42 ]. В общем, есть два метода улучшения магнитной чувствительности Fe ₃. О ₄ НП. Первый - синтезировать частицы магнетита микрометрового размера. Однако из-за большого размера они имеют тенденцию к агрегированию в водном растворе, что неблагоприятно для биомедицинских применений. Другой подход - собрать Fe ₃ О ₄ НЧ в нанокластеры (НК). Эти Fe ₃ О ₄ NC значительно улучшили магнитную чувствительность по сравнению с индивидуальным Fe ₃ О ₄ НП [22, 43]. Следовательно, если самосборный Fe ₃ О ₄ НК используются в качестве основы для создания многофункциональных гибридных наноструктур, производительность МРТ будет улучшена за счет коллективного эффекта Fe ₃ О ₄ НП [43,44,45]. Насколько нам известно, самосборный Fe ₃ О ₄ НК, функционализированные многослойными PAH / PSS для высвобождения лекарственного средства в зависимости от pH, описаны редко.

В этой работе универсальная тераностическая наноплатформа на основе Fe ₃ О ₄ НП были созданы для МРТ и доставки лекарств. В нашем подходе Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX были получены путем комбинирования метода микроэмульсии масло-в-воде и метода электростатической адсорбции слоя за слоем (LBL). Ожидается, что упакованный Fe ₃ О ₄ Система ЧПУ может привести к увеличению T ₂ релаксация и контраст изображения, а также большая удельная поверхность Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS обеспечивают высокую загрузку противоопухолевых препаратов. Более того, эксперимент in vitro показывает, что клеточный контраст МРТ клеток рака легких человека (A549), инкубированных с Fe ₃ О ₄ NC / PAH / PSS / DOX были значительно улучшены.

Материалы и методы

Материалы

FeCl ₃ · 6H ₂ О (99,99%), FeCl ₂ · 4H ₂ O (99,99%), олеиновая кислота (OA, 90%) и 1-октадецен (ODE, 90%) были приобретены у Alfa Aeasar. Олеат натрия (NaOA), этанол, гексан, циклогексан, изопропанол, додецилбензолсульфонат натрия (SDBS), фторид аммония (NH ₄ F), гидроксид натрия (NaOH), диметилсульфоксид (ДМСО) и аммиак были приобретены у Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd (Китай). Поли (аллиламингидрохлорид) (PAH), поли (стиролсульфонат) (PSS) и 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолий бромид были приобретены у Sigma-Aldrich. Противоопухолевый препарат доксорубицина гидрохлорид (DOX,> 98%) был приобретен у Shanghai Sangon Biotech Company (Шанхай, Китай). Среда для выращивания APMI 1640 и фетальная бычья сыворотка (FBS) были приобретены у Hyclone. Все реагенты были использованы без дополнительной очистки.

Приготовление олеата железа

Синтез магнитных НЧ начался с синтеза олеата железа. FeCl ₃ · 6H ₂ O (2,59 г), NaOA (14,6 г), C ₂ H ₅ ОН (32 мл), H ₂ O (24 мл) и гексан (56 мл) смешивали вместе в трехгорлой колбе объемом 150 мл и нагревали до 70 ° C с обратным холодильником в течение 4 ч с образованием прозрачного раствора комплексов олеата железа (III). После этого жидкость отделили с помощью делительной воронки и сохранили верхний масляный слой. Гексан в жидкости упаривают при 70 ° C на роторном испарителе и сушат в течение 48 ч под вакуумом. Подготовленные образцы хранили в вакуумном перчаточном ящике для дальнейшего использования.

Синтез Fe ₃ О ₄ НП

Мы синтезировали Fe ₃. О ₄ НЧ следуют ранее описанным процедурам с небольшими изменениями [46]. Олеат железа (7,2 г), OA (1,28 мл) и ODE (50 мл) смешивали вместе в трехгорлой колбе объемом 100 мл и нагревали до 300 ° C в течение 40 минут под защитой аргона; После этого смесь охлаждали до комнатной температуры и окисляли на воздухе более 12 ч. Полученные нанокристаллы осаждали добавлением изопропанола, центрифугировали и дважды промывали смесью этанол-вода (1:1 v / v ). Блокированный олеиновой кислотой Fe ₃ О ₄ Наконец, НЧ диспергировали в 200 мл циклогексана, супернатант герметично закрывали и хранили для последующих экспериментов.

Приготовление Fe ₃ О ₄ NC

Fe ₃ О ₄ НК были приготовлены с помощью простой и простой техники самосборки микроэмульсий, как описано ранее с модификацией [47]. Вкратце, 200 мкл раствора Fe ₃ О ₄ Нанокристаллы в циклогексане выливали в 4 мл водного раствора, содержащего 14 мг SDBS. Смешанный раствор подвергали ультразвуковой обработке в течение 5 мин 4 раза. Образовавшуюся эмульсию твердое вещество-масло-в-воде (S / O / W) перемешивали при комнатной температуре в течение 6 часов для испарения органического растворителя с последующей самосборкой Fe ₃ О ₄ НП для формирования трехмерных НК. Конечные продукты промывали деионизированной водой 3 раза, чтобы удалить избыток SDBS, невключенные нанокристаллы и некоторые возможные более крупные загрязнения.

Приготовление Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX

Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX были получены с помощью электростатических взаимодействий притяжения. Готовый Fe ₃ О ₄ НК заряжены отрицательно из-за инкапсуляции анионных поверхностно-активных веществ. Впервые они оказались положительно заряженными за счет адсорбции слоя положительно заряженного полиэлектролита, гидрохлорида поли (аллиламина) (ПАУ, молекулярная масса 15 000). В частности, 300 мкл Fe ₃ О ₄ Образец NC сначала разбавляли деионизированной водой в 10 раз до 3 мл. Fe ₃ О ₄ Затем смесь NC по каплям добавляли к водному раствору ПАУ (1 мл, 10 г / л, 4 мМ NaCl) при интенсивном перемешивании. После перемешивания раствора в течение 24 часов избыток ПАУ удаляли центрифугированием, и полученный Fe ₃, покрытый ПАУ, О ₄ NC (Fe ₃ О ₄ NC / PAH) повторно диспергировали в воде (3 мл).

Fe ₃ О ₄ Затем NC / PAH были превращены в отрицательно заряженные за счет адсорбции слоя отрицательно заряженного полиэлектролита, поли (4-стиролсульфоната натрия) (PSS, молекулярная масса 70 000). В частности, 3-мл Fe ₃ О ₄ Раствор образца NC / PAH добавляли по каплям к водному раствору PSS (1 мл, 10 г / л, 4 мМ NaCl) при интенсивном перемешивании. После перемешивания раствора в течение 24 часов избыток PSS удаляли центрифугированием, и полученный Fe ₃, покрытый PSS О ₄ NC / PAH (Fe ₃ О ₄ NC / PAH / PSS) повторно диспергировали в воде (3 мл).

Первоначально был приготовлен исходный водный раствор DOX [17]. Концентрация составляла 5,0 мг / мл. Раствор гибридной наноструктуры был получен путем смешивания Fe ₃ О ₄ Раствор NC / PAH / PSS (3 мл, 32 мг / мл) и исходный раствор DOX (60 мкл) в небольшой пластиковой пробирке при перемешивании в течение 24 часов в темной комнате. После центрифугирования Fe ₃ О ₄ Наконец, были получены гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX.

Измерения МРТ

Измерения МРТ проводили в системе микро-визуализации 11,7 Тл micro 2.5 (Bruker, Германия). Различное количество Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX диспергировали в 1,2 мл водного раствора агарозы, а затем загружали в микропробирки для измерений МРТ. Конечная концентрация ионов Fe составляла 0 мМ, 0,013 мМ, 0,026 мМ, 0,032 мМ, 0,041 мМ, 0,052 мМ и 0,065 мМ соответственно. Параметры измерения следующие:время повторения (TR) =300 мс, время эхо-сигнала (TE) =4,5 мс, матрица изображения =128 × 128, толщина среза =1,2 мм, поле зрения (FOV) =2,0 × 2,0 см, и количество средних значений (NA) =2.

Использование сотовой связи и МРТ

Чтобы продемонстрировать эффективное клеточное поглощение, клетки A549 высевали на покровное стекло конфокальной чашки и инкубировали в увлажненном 5% CO ₂ атмосфера в течение 4 ч при 37 ° C. Затем Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX добавляли в инкубационную среду в различной концентрации и инкубировали в течение 2 часов. Конечные концентрации ионов Fe составили 0, 2,2, 4,5, 9,0 и 13,5 мкМ соответственно. После удаления среды клетки дважды промывали PBS (pH =7,4, 20 мМ) и непосредственно использовали для МРТ.

Стандартная кривая DOX

Подходящее количество DOX растворяли в воде путем колебания. Затем готовили серию водных растворов DOX с различными концентрациями (0–0,03 мг / мл). Измеряли интенсивность флуоресценции различных концентраций раствора DOX ( λ _бывший =490 нм). Наконец, стандартная кривая DOX была определена путем аппроксимации кривой интенсивности флуоресценции vs концентрация DOX.

Стандартная кривая площади: Y =447,4423 + 69745.08457X.

Уровень точности стандартной кривой: R ² =0,9992.

Загрузка и выпуск DOX

Для измерения грузоподъемности Fe ₃ О ₄ Для гибридных наноструктур NC / PAH / PSS / DOX надосадочный раствор собирали после центрифугирования предварительно приготовленных гибридных наноструктур. Спектр флуоресценции молекул DOX в надосадочном растворе был исследован, и концентрация DOX в надосадочной жидкости была рассчитана путем сравнения стандартной кривой DOX. Процентное содержание DOX, остающегося в Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX рассчитывались по следующему уравнению:

$$ \ mathrm {Загрузка} \ \ mathrm {efficiency} \ left (\% \ right) =\ left ({\ mathrm {W}} _ 0 \ hbox {-} {\ mathrm {W}} _ {\ mathrm {s}} \ right) / {\ mathrm {W}} _ 0 \ times 100 \% $$

где W ₀ и W _s представляют собой начальную массу DOX и массу DOX в супернатантах, соответственно.

Для исследований кумулятивного высвобождения DOX в буферных растворах PBS (pH 5,0 и 7,4) с той же концентрацией NaCl 0,15 M, Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX диспергировали в 1,0 мл буферного раствора и затем переносили в диализный мешок. Затем его хранили в буферном растворе и осторожно встряхивали при 37 ° C в темной комнате. Через выбранные интервалы времени отбирали 100 мкл раствора и анализировали по спектру флуоресценции, а затем возвращали в исходный раствор.

Цитотоксичность Fe ₃ in vitro О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX

Цитотоксичность in vitro Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX оценивали в отношении клеток A549 на основе стандартного анализа метилтиазолилтетразолия (МТТ). Клетки A549 культивировали в среде роста APMI 1640 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), стрептомицина в концентрации 100 мкг / мл и пенициллина в концентрации 100 мкг / мл. Клетки поддерживали при 37 ° C во влажной атмосфере с 5% CO ₂. в воздухе. Анализ выполняли в трех повторностях таким же образом. Вкратце, клетки A549 высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 8 × 10 ³ . клеток на лунку в 100 мкл среды. После роста в течение ночи клетки затем инкубировали при различных концентрациях свободного DOX, Fe ₃ О ₄ NC / PAH / PSS и Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX (0,1, 0,2, 0,4, 0,8, 1,2, 1,6, 2,0 мкМ) в течение 24 ч. После инкубирования в течение 24 часов в каждую лунку добавляли 10 мкл раствора 3- (4, 5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромида (5 мг / мл), и клетки дополнительно инкубировали в течение 4 ч при 37 ° C. После удаления раствора 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолийбромида в каждую лунку добавляли 150 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) и планшет осторожно встряхивали в течение 10 мин для растворения. выпавшие кристаллы фиолетового цвета. Оптическую плотность (OD) измеряли при 490 нм с помощью устройства для считывания микропланшетов (Perkin Elmer, Victor X4). Жизнеспособность клеток оценивалась в процентах по сравнению с контрольными клетками.

Характеристика

Размеры и морфология Fe ₃ О ₄ НЧ и Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX исследовали с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ) FEI Tecnai G2-F20 при ускоряющем напряжении 200 кВ. Измерения динамического рассеяния света (DLS) выполняли на анализаторе размера частиц и дзета-потенциала от Malvern (Zetasizer Nano ZS90). Спектры поглощения в УФ-видимой области регистрировали на УФ-видимом спектрометре Perkin Elmer Lambda-25. Спектры флуоресценции регистрировали на флуоресцентном спектрофотометре Hitachi F-4600. Атомно-эмиссионная спектроскопия с индуктивно связанной плазмой (ICP-AES) (Agilent 5100) использовалась для анализа концентраций элемента Fe в Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX.

Результаты и обсуждение

Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX получают путем самосборки первичного оксида железа (Fe ₃ О ₄ ) НЧ, образующие плотно упакованные сферические агрегаты посредством метода самосборки микроэмульсии, как описано ранее с модификацией [17, 47], с последующим методом электростатической адсорбции LBL. На рисунке 1 схематически показан синтез Fe ₃. О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX. Магнетит Fe ₃, покрытый гидрофобной олеиновой кислотой О ₄ Первоначально НЧ были получены методом термического разложения в органическом растворителе [46]. Fe ₃ О ₄ НЧ имеют сферическую форму и однородный размер со средним размером частиц около 15 нм (дополнительный файл 1:Рисунок S1). Для сборки магнитных НК используется Fe ₃ с ОА-покрытием. О ₄ НЧ диспергировали в циклогексане, а затем по каплям добавляли в водный раствор, содержащий SDBS. Комплексный раствор обрабатывали ультразвуком с образованием стабильной эмульсии масло-в-воде. После испарения органического растворителя в эмульсии Fe ₃ О ₄ НЧ самоорганизовывались в сферические нанокластеры за счет гидрофобного взаимодействия. Затем Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX были приготовлены методом LBL посредством электростатических взаимодействий притяжения, что схематично показано на рис. 1.

Схематическое изображение синтеза Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX в качестве тераностических агентов для МРТ и доставки лекарств

Морфология и размеры Fe ₃ О ₄ НК и Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS были исследованы с помощью ПЭМ и ДРС соответственно. Как показано на рис. 2а и б, Fe ₃ О ₄ НК демонстрируют квазисферические кластеры. Средний размер частиц, измеренный методом DLS, составляет около 57 нм (рис. 2e). В предыдущих отчетах ПАУ с положительным зарядом или ПСС с отрицательным зарядом поочередно откладывались на поверхности шаблона из-за их превосходных электростатических свойств [48,49,50,51]. Для изучения формирования каждого слоя полиэлектролита, нанесенного на Fe ₃ О ₄ NCs, эксперименты с дзета-потенциалом были выполнены. Изменение дзета-потенциала со слоем полиэлектролита для покрытий PSS / PAH и DOX показано в Дополнительном файле 1:Рисунок S2. Первозданный Fe ₃ О ₄ NC имеют отрицательный дзета-потенциал -19,7 мВ из-за наличия SDBS. Поглощение положительно заряженного одиночного слоя ПАУ на Fe ₃ О ₄ NC меняет поверхностный потенциал с -19,7 до +32 мВ. Впоследствии осаждение отрицательно заряженного слоя PSS вызывает еще одно изменение поверхностного потенциала с + 32 до -34 мВ. Это свидетельствует о ступенчатом росте слоев при изготовлении гибридных магнитных наноструктур НК. Эти результаты показывают, что слои PAH и PSS были успешно нанесены на Fe ₃ О ₄ NCs. Наконец, DOX был успешно адсорбирован на поверхности Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX, что было подтверждено положительным дзета-потенциалом (+ 1,91 мВ) (дополнительный файл 1:Рисунок S2). Изображения ПЭМ с разным увеличением Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS показаны на рис. 2c и d. Существенных структурных и морфологических различий после полиэлектролитных покрытий не наблюдается. По сравнению с рис. 2а и б, можно наблюдать яркий контраст и размер Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS немного увеличиваются за счет покрытия слоев PAH и PSS. Синтезированные магнитные гибридные наноструктуры показывают почти монодисперсную квазисферическую форму со средним размером около 84 нм согласно результатам измерения DLS (рис. 2f).

ПЭМ изображения Fe ₃ О ₄ NC ( a , b ) и Fe ₃ О ₄ NC / PAH / PSS ( c , d ) при меньшем и большом увеличении соответственно. Распределение Fe ₃ по размерам О ₄ NC ( e ) и Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS ( f )

Для оценки потенциального применения Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS в МРТ, скорости поперечной релаксации протонов (1 / T ₂ ) в зависимости от концентрации ионов Fe были определены с использованием спектрометра Bruker AVANCE 500WB при 11,7 Тл. Наблюдалась линейная зависимость между скоростями релаксации с концентрацией ионов Fe, как показано на рис. 3b. Кроме того, скорости поперечной релаксации (1 / T ₂ ) увеличивается с увеличением концентрации Fe ₃ О ₄ НК из-за высокой степени агрегации Fe ₃ О ₄ магнитного ядра НЧ, демонстрируя, что магнитные гибридные наноструктуры могут быть эффективными T ₂ контрастный агент для МРТ (рис. 3а). Основываясь на наклоне графика на рис. 3b, значение поперечной релаксации ( r ₂ ) было определено как 651,38 мМ ^-1 S ^-1 , что выше, чем в опубликованной работе [22]. По сравнению с коммерческим T ₂ Контрастные среды, нанокластеры могут значительно улучшить контрастную способность Fe после самоорганизации магнитных НЧ на основе коллективного эффекта, тем самым значительно улучшая ангиографический эффект. В предыдущей работе собранные нанокристаллы магнетита показали более высокий уровень намагниченности насыщения, чем отдельные нанокристаллы, из-за коллективного эффекта магнитных нанокристаллов [43, 52].

а Т ₂ -взвешенные изображения МРТ Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS при различных концентрациях в воде. б График скорости релаксации r ₂ против Концентрация Fe в Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS. Значение релаксации r ₂ был получен из наклона линейной аппроксимации экспериментальных данных

Чтобы оценить способность Fe ₃ загрузки лекарственного средства О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX в качестве носителей для доставки лекарств, водорастворимый противораковый препарат (DOX) был выбран в качестве модельного лекарственного средства. Сохранение DOX в гибридных наноструктурах с высокой эффективностью было впервые обнаружено по изменению цвета раствора. Цвет раствора Fe ₃ О ₄ NC / PAH / PSS и чистый раствор DOX были желтоватыми и красными соответственно (рис. 4a и b). После формирования Fe ₃ О ₄ Для гибридных наноструктур NC / PAH / PSS / DOX цвет раствора стал оранжевым (рис. 4в). Благодаря наличию Fe ₃ О ₄ НЧ, нагруженные DOX наноструктуры в суспензии, могут быть разделены внешним магнитом, что свидетельствует о большом потенциале полученных гибридных наноструктур для магнитно-направленной доставки лекарств (рис. 4d). Для определения эффективной накопительной способности DOX использовалась УФ-видимая абсорбционная спектроскопия. На рис. 4д показаны спектры поглощения водного раствора DOX в УФ-видимой области до и после взаимодействия с Fe ₃. О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS. По сравнению со свободным DOX, аналогичные характеристики пика поглощения наблюдались в Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX, являющиеся пиком рекомбинационного поглощения Fe ₃ О ₄ NC и DOX. Образец без DOX показывает только пик поглощения Fe ₃ О ₄ NCs. Эти данные показывают, что DOX как лекарственное средство может успешно абсорбироваться на поверхности гибридных наноструктур. Также установлено, что существует верхний предел адсорбционной концентрации DOX, загруженного на поверхность гибридных наноструктур. На рис. 4е показан спектр ФЛ Fe ₃. О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX после центрифугирования при добавлении различных концентраций DOX в Fe ₃ О ₄ Решение NC / PAH / PSS. Интенсивность люминесценции DOX увеличивается по мере увеличения количества добавленного DOX до достижения предельного значения (8 мг / мл) с концентрацией Fe ₃ О ₄ NC / PAH / PSS (1,30 × 10 ⁻² мг / мл) без изменений. После этого количество захваченного вещества уменьшается из-за избытка DOX, который не может адсорбироваться на поверхности Fe ₃. О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX. Самая высокая интенсивность флуоресценции DOX соответствует концентрации 8 мг / мл, и соответствующий образец будет использоваться для дальнейшего исследования для проведения биомедицинского эксперимента. Гарантированная эффективность загрузки лекарственного средства гибридных наноструктур имеет решающее значение для клинического применения. Эффективность загрузки рассчитывалась по интегралу площадей от интенсивности флуоресценции DOX с использованием метода стандартной кривой DOX [53, 54]. Эффективность загрузки рассчитана до 24,39% для Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX. Поэтому была создана тераностическая платформа на основе Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX за счет эффективного поглощения противоопухолевого препарата DOX.

Фотографии ( а - г ) различных стадий поглощения DOX на Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS. Спектры поглощения УФ – видимой области ( e ) DOX, Fe ₃ О ₄ NC / PAH / PSS и Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX. Спектры люминесценции ( f ) Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX при добавлении различных концентраций DOX в Fe ₃ О ₄ Решение гибридной наноструктуры NC / PAH / PSS

Профили высвобождения лекарств in vitro Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX при различных значениях pH окружающей среды показаны на рис. 5. Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX подвергали диализу через диализную мембрану в фосфатных буферах при 37 ° C. Высвобожденный DOX из гибридных наноструктур собирали, а затем рассчитывали количество высвобожденного DOX по интенсивности флуоресценции супернатанта. При физиологическом pH 7,4 наблюдаемое высвобождение лекарственного средства представляет собой процесс медленного высвобождения. Около 20 мас.% DOX высвободилось в первые 5 ч, а затем перешло в стабильную стадию медленного высвобождения. При pH 5,0 около 80 мас.% DOX высвобождалось из гибридных наноструктур в первые 15 ч до достижения плато высвобождения. Процент плато высвобождения DOX, наблюдаемый в течение 30 часов, составлял 80 ± 3 мас.% И 20 ± 3 мас.% При pH 5,0 и 7,4 соответственно. Видно, что Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX показали профиль замедленного высвобождения и более высокую скорость высвобождения DOX при pH 5,0, чем при pH 7,4. Низкий pH окружающей среды ускоряет высвобождение DOX из Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX. Это связано с протонированием –NH ₂ группа DOX в кислых условиях, что снижает электростатическое взаимодействие между полимерами DOX и PSS при низких значениях pH [55]. Исследования высвобождения лекарственного средства показывают хорошую стабильность электростатически связанных молекул лекарственного средства при физиологическом pH и инициированное высвобождение в кислых условиях, как и в опубликованных работах [56,57,58]. Следовательно, полученное Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX представляют собой pH-чувствительные системы для доставки лекарств DOX и подходят для специфического лечения солидных опухолей [59].

Сюжет выхода DOX из Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX в буфере PBS при pH 7,4 и 5,0 соответственно

Поглощение клетками и цитотоксичность являются ключевыми факторами для оценки потенциала новой системы доставки лекарств. Поглощение клетками и цитотоксичность Fe ₃ О ₄ Исследованы гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX на клеточных линиях A549. Межклеточное поглощение Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX исследовались с помощью оптической и флуоресцентной микроскопии, которая в основном реализовывалась путем мониторинга флуоресценции от DOX. Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX доказали свою эффективность в доставке DOX в раковые клетки. Как показано на рис. 6, сильная красная флуоресценция DOX наблюдалась в раковых клетках после инкубации в течение 24 часов. Гибридные наноструктуры были интернализованы в основном за счет эндоцитоза [60]. После поглощения клетками гибридные наноструктуры высвобождают DOX в кислой среде вокруг эндосом / лизосом, в которой достаточно низкий pH (4,3) может вызвать эффективное высвобождение DOX (pH 5,0, рис. 5). Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX демонстрируют зависящее от времени поглощение в раковых клетках A549, как показано на фиг. 6. Через 0,5 часа после инкубации вокруг клеток была видна красная флуоресценция. Результаты показывают, что гибридные наноструктуры, содержащие DOX, в основном оставались вокруг клеток A549. Однако, когда время инкубации увеличилось до 24 часов, сигнал межклеточной флуоресценции от клеток A549 увеличился. Очевидно, что многие гибридные наноструктуры со временем могут проникать в раковые клетки. Эти результаты подтверждают, что Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX могут эффективно переносить DOX в клетки A549. DOX, высвобождаемый гибридными наноструктурами в цитоплазме, проходит через ядерную мембрану и в конечном итоге накапливается в ядре, убивая клетки, вызывая изменения в конформации ДНК [61].

Конфокальные флуоресцентные микроскопические изображения клеток A549, инкубированных с Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX при 37 ° C для a 0,5 ч и b 24 ч. Масштабная линейка, 20 мкм

Для оценки фармакологической активности Fe ₃ О ₄ Гибридные наноструктуры NC / PAH / PSS / DOX, цитотоксичность по отношению к клеткам A549 in vitro определяли методом МТТ. На рисунке 7 показана клеточная активность свободного DOX, Fe ₃. О ₄ NC / PAH / PSS и Fe ₃ О ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures with different concentrations after incubation with A549 cells for 24 h. The material amounts were calculated according to the concentration of DOX. The free DOX concentration was the same as the DOX concentration in Fe₃ О ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures, and the concentration of Fe₃ О ₄ NC/PAH/PSS hybrid nanostructure was the same as the Fe₃ О ₄ NC/PAH/PSS concentration in the Fe₃ О ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures. Each sample was cultured with A549 cells for 24 h. The concentration of Fe₃ О ₄ NC/PAH/PSS ranged from 0.1 to 2.0 μΜ, and the cell survival rate exceeded 85%. This indicated that Fe₃ О ₄ NC/PAH/PSS hybrid nanostructures had no obvious cytotoxicity to cancer cells and had good biocompatibility. After incubating with cancer cells for 24 h, however, the free DOX and Fe₃ О ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures showed obvious cytotoxicity. The cellular viability progressively decreased with increasing effective DOX concentration. As shown in Fig. 7, when the effective DOX concentration was increased from 0.1 up to 2.0 μM, the relative cell viability decreased from about 92% to about 50% for free DOX, and from about 89% to about 40 % for Fe₃ О ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures, respectively.

Relative viability of A549 cells incubated with free DOX, Fe₃ О ₄ NC/PAH/PSS, and Fe₃ О ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures at different concentrations for 24 h. Error bars were based on triplicate samples

These results indicate that both free DOX and Fe₃ О ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures have dose-dependent cytotoxicity to cancer cells. The cytotoxicity originates from the loaded DOX rather than Fe₃ О ₄ NC/PAH/PSS hybrid nanostructures. Cell uptake of free DOX is faster than that of DOX-loaded hybrid nanostructures. This reason is that small DOX molecules can quickly spread into cells, while Fe₃ О ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures must be endocytosis in order to enter cancer cells. Because of the hypoxia-induced coordinated upregulation of glycolysis, the acidic extracellular environment of solid tumors is stronger than that of normal tissues [62]. At the cellular level, the internalization of most of the hybrid nanostructures will take place through endocytosis. With the increase of DOX concentration, more and more hybrid nanostructures loaded with DOX are endocytosed into cancer cells. After cellular endocytosis, the DOX-loaded hybrid nanostructures usually enter the early endosomes, then enter the late endosomes/lysosomes, and finally fused with lysosomes. Furthermore, both endosomes (pH 5.0–6.0) and lysosomes (pH 4.5–5.0) have an acidic microenvironment. In our study, the pH-responsive Fe₃ О ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures were more likely to decompose and release drugs in acidic environments, thus effectively reducing side effects, prolonging half-life of drugs, and providing more effective and lasting treatment. Due to the main target of DOX being cell nucleus, DOX can bind to double-stranded DNA to form DNA adducts, inhibit the activity of topoisomerase and induce cell death (apoptosis) [63]. As a result, the released DOX molecules were located in the cell nucleus. Therefore, the obtained Fe₃ О ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures may have good potential for cancer chemotherapy.

As discussed above, the Fe₃ О ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures exhibit high relaxivity in aqueous solution and can be uptaken efficiently by A549 cells. The intracellular MRI of the Fe₃ О ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures were then investigated by incubation of A549 cells with the hybrid nanostructures with different Fe₃ О ₄ концентрации. Figure 8 presents the T ₂ -weighted MRI of A549 cells. With the increase of Fe₃ О ₄ concentration in Fe₃ О ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures, the cellular MRI signal increased gradually (Fig. 8). Currently, cell labeling is mainly accomplished by the endocytosis of Fe₃ О ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures as T ₂ -negative contrast agents. These results demonstrate that the Fe₃ О ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures can be internalized into cells and exhibit good T ₂ -weighted MRI contrast for cellular imaging. Our current research is limited to the cellular level. Future in vivo studies would be necessary for the practical application of the Fe₃ О ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures. To specially target a specific site in animal studies, small ligands such as lactic acid and folic acid (both containing carboxyl groups) would require to be used to conjugate amino-terminated Fe₃ О ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures.

Т ₂ -weighted cellular MR images of A549 cells incubated with the Fe₃ О ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures at a Fe concentration of 2.2, 4.5, 9.0, and 13.5 μM, respectively

Заключение

The multifunctional Fe₃ О ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures were developed as the pH-triggered drug delivery system for effective cancer chemotherapy and MRI. The quasi-spherical Fe₃ О ₄ NCs can significantly improve the contrast ability of MRI compared with Fe₃ О ₄ НП. Fe ₃ О ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures can act as contrast agents to enhance MRI and as a fluorescence probe for cell imaging. The DOX can be released from the Fe₃ О ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures at acidic environment and exhibit an excellent cellular cytotoxic effect on A549 cells. Fe ₃ О ₄ NC/PAH/PSS/DOX hybrid nanostructures as multifunctional theranostic platform have great potential for biomedical application, including MRI, fluorescence imaging, and stimuli-responsive drug delivery nanocarriers.

Доступность данных и материалов

Data sharing is not applicable to this article as no datasets were generated or analyzed during the current study. Please contact the author for data requests.