Настройка морфомеханических возмущений клетки через наночастицы оксида металла

Фон

Широкое использование созданных наночастиц (ENP) в коммерческих продуктах повышает осведомленность об их потенциальной токсичности для человека и окружающей среды [1]. До настоящего времени было проведено множество исследований in vitro и in vivo с целью пролить свет на молекулярные механизмы токсичности [2, 3]. Однако понимание взаимодействия между наночастицами (НЧ) и живыми организмами довольно сложно из-за отсутствия стандартизированных рабочих процедур, что привело к появлению противоречивых литературных данных [4, 5]. Установлено, что побочные эффекты НЧ строго зависят от их физико-химических свойств и от конкретной тестируемой клетки или организма [6]. По этой причине характеристика НЧ имеет фундаментальное значение для получения надежных данных [7]. НЧ оксидов металлов широко распространены в товарных продуктах [8]. Среди них аморфный SiO ₂ НЧ и кристаллический TiO ₂ НЧ используются в широком спектре промышленных областей в качестве добавок к лекарствам и косметике, а также в продуктах здравоохранения, тонерах для принтеров, красках, упаковке пищевых продуктов и пищевых добавках [9, 10]. Следовательно, вероятно, что эти НЧ могут получать доступ к живым организмам разными путями (проглатывание, вдыхание и проникновение через кожу) [11]. Примеры включают, но не ограничиваются, пищевые продукты на основе TiO ₂ НЧ (обозначенные E171 на коммерческой этикетке) и SiO ₂ НЧ (E551, E554, E556 на коммерческой этикетке), которые имеют огромный рост [12,13,14]. Текущие исследования SiO ₂ НЧ и TiO ₂ NP предполагают, что они активно вмешиваются в важнейшие клеточные механизмы. Например, было доказано, что они стимулируют высвобождение цитокинов (тем самым способствуя воспалению) [15,16,17], повреждают микроворсинки кишечника [18, 19], индуцируют продукцию ROS [20], ингибируют синтез АТФ [21] и индуцируют генотоксичность [22,23,24,25,26]. Тем не менее, очень мало исследований изучали, взаимодействуют ли эти НЧ с клеточной механикой [27], и эта тема требует дальнейших исследований. Клеточные адгезии и перестройки цитоскелета действительно важны для поддержания клеточного гомеостаза [28]. Любые изменения в архитектуре цитоскелета могут нарушать клеточную механику и влиять на эластичность клеток и динамику миграции [29]. В этом исследовании мы тщательно оценили биомеханические эффекты 20 нм SiO ₂ НЧ и TiO ₂ НЧ на клетках Caco-2 и A549, которые являются лучшими моделями, напоминающими ткани, подвергшиеся воздействию НЧ. Мы предварительно исследовали механизмы их проникновения, а также оценили жизнеспособность клеток, повреждение мембран и продукцию ROS вместе с активацией супероксиддисмутазы (SOD) и малонового диальдегида (MDA). Затем мы сосредоточились на характеристике изменений эластичности клеток (модуля Юнга) при инкубации НЧ с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ). Наши результаты показывают, что НЧ могут вызывать значительную реорганизацию кортикального актина, что подтверждается изменениями модуля Юнга. В частности, основная биосовместимость SiO ₂ НЧ против хронической токсичности TiO ₂ НЧ не наблюдалось. Наш подход к объединению исследований цитотоксичности с биомеханическими характеристиками представляет собой новый потенциальный метод стандартизации протоколов оценки NP-токсичности.

Методы

Синтез аморфного SiO ₂ НП

Трехкомпонентная микроэмульсия W / O была приготовлена ​​при комнатной температуре путем смешивания воды, органического растворителя (Cyclohexane, J.T. Baker), поверхностно-активного вещества (Triton X-100, Sigma-Aldrich) по методикам Malvindi et al. [25]. Вкратце, смешивали 880 мкл Triton X-100, 3,75 мл циклогексана, 170 мл воды и 50 мкл TEOS (98%, Sigma-Aldrich) и перемешивали в течение 30 мин. Позже 30 мкл NH ₄ К микроэмульсии добавляли ОН (28,0–30,0%, Sigma-Aldrich). Через 24 ч суспензию отделяли центрифугированием (4500 об / мин) с последующими пятью промывками этанолом (98%, Sigma-Aldrich) и водой milliQ. Затем наночастицы диспергировали в воде.

Синтез TiO ₂ НП

TiO ₂ НЧ были получены в соответствии с золь-гель методом, описанным Leena et al. [30] с некоторыми изменениями. Вкратце, изопропоксид титана (IV) (TTIP; 99,9% Sigma-Aldrich) добавляли по каплям в раствор этанола и воды milliQ (5:1:1) при перемешивании в кислых условиях (pH 3). НЧ инкубировали в течение 5 часов сначала при 30 ° C, а затем при 430 ° C в течение 3 часов, чтобы получить белый нанопорошок.

Характеристика ТЕА

Характеристики просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) проводили с помощью микроскопа JEOL Jem 1011, работающего при ускоряющем напряжении 100 кВ (JEOL USA, Inc.). Образцы ПЭМ были приготовлены путем капания разбавленного раствора НЧ в воде на покрытые углеродом медные сетки (Formvar / Carbon 300 Mesh Cu).

Измерения DLS и ζ-потенциала

Средний гидродинамический размер и дзета-потенциал SiO ₂ НЧ и TiO ₂ НЧ определяли с помощью измерений динамического рассеяния света (DLS) и ζ-потенциала на приборе Zetasizer Nano-ZS, оборудованном гелий-неоновым лазером мощностью 4,0 мВт, работающим на длине волны 633 нм, и лавинным фотодиодным детектором (модель ZEN3600, Malvern Instruments Ltd., Malvern, США). СОЕДИНЕННОЕ КОРОЛЕВСТВО). Измерения проводили при 25 ° C в водных растворах и в среде для культивирования клеток (DMEM, с высоким содержанием глюкозы, Sigma-Aldrich) с добавлением FBS (Sigma-Aldrich) при 10% и 20% pH 7). Каждый образец анализировался трижды с использованием двух независимых технических повторов для получения средних значений измерений DLS и ζ-потенциала.

XRD-характеристика

Порошковая дифракция рентгеновских лучей (XRD) для анализа кристаллической фазы TiO ₂ НЧ выполняли на дифрактометре Rigaku в геометрии отражения Брэгга-Брентано с использованием фильтрованного излучения Cu-Ka. Картины XRD были записаны в диапазоне 2Q ¼ 20–80 при пошаговом сканировании с шагом 2Q 0,02 и фиксированным временем счета 2 с / шаг.

Культура клеток

Caco-2 (ATCC® HTB-37 ™) и A549 (ATCC® CCL-185 ™) поддерживали в DMEM с 50 мкМ глутамина с добавлением 100 Ед / мл пенициллина и 100 мг / мл стрептомицина. Процент FBS составлял 10% для клеток A549 и 20% для клеток Caco-2. Клетки инкубировали в контролируемой увлажненной атмосфере с соотношением воздух / CO от 95 до 5% ₂ . , при 37 ° С.

Определение внутриклеточного поглощения SiO ₂ NPS и TiO ₂ НП

10 ⁵ Клетки Caco-2 и A549 высевали в 1 мл среды в шестилуночный планшет. Через 24 часа инкубации при 37 ° C среду заменяли свежей средой, содержащей SiO ₂ НЧ и TiO ₂ НЧ в концентрациях 15 мкг / мл и 45 мкг / мл. После 48 ч, 72 ч и 96 ч инкубации при 37 ° C DMEM удаляли, а клетки промывали четыре раза PBS (pH 7,4) для удаления НЧ, которые могли связываться с клеточной мембраной. Клетки обрабатывали трипсином и подсчитывали с использованием автоматической камеры для подсчета клеток. Триста шестьдесят тысяч клеток суспендировали в 200 мкл milliQ и обрабатывали HCl / HNO ₃ . 3:1 ( v / v ) и разбавили до 5 мл:полученный раствор анализировали для оценки содержания Si и Ti. Элементный анализ проводился методом атомно-эмиссионной спектроскопии с индуктивно связанной плазмой (ICP-AES) на спектрометре Varian Vista AX.

Анализ WST-8

Клетки Caco-2 и A549 высевали в 96-луночные микропланшеты в концентрации 5 × 10 ³ . клеток / лунка после 24 ч стабилизации. Исходные растворы НЧ (SiO ₂ НЧ и TiO ₂ НЧ) добавляли к клеточной среде в концентрации 15 мкг / мл и 45 мкг / мл. Клетки инкубировали в течение 24, 48, 72 и 96 часов. В конечном итоге жизнеспособность клеток определяли с помощью стандартного анализа WST-8 (Sigma-Aldrich). Анализы выполняли в соответствии с процедурой, ранее описанной в De Matteis et al. [31]. Данные были выражены как среднее ± стандартное отклонение.

Анализ ЛДГ

Клетки Caco-2 и A549 обрабатывали SiO ₂ НЧ и TiO ₂ НЧ в соответствии с процедурой, описанной для анализа WST-8. Анализ лактатдегидрогеназы (ЛДГ) выполняли на микропланшетах с применением реагента CytoTox-ONE для анализа целостности гомогенной мембраны (Promega), следуя инструкциям производителя. Культуральную среду собирали и уровень ЛДГ измеряли путем считывания оптической плотности при 490 нм с использованием спектрофотометра для микропланшетов Bio-Rad. Данные были выражены как среднее ± стандартное отклонение.

Анализ DCF-DA

Клетки Caco-2 и A549 высевали в 96-луночные микропланшеты и обрабатывали SiO ₂ . НЧ и TiO ₂ НЧ в конечных концентрациях 15 мкг / мл и 45 мкг / мл. Через 24 часа, 48 часов, 72 часа и 96 часов взаимодействия клетки с NP на микропланшетах проводили анализ DCF-DA (Sigma) в соответствии с процедурой, описанной De Matteis et al. [32] Данные выражены как среднее ± стандартное отклонение.

Анализ SOD

Экстракты клеток Caco-2 и A549 (инкубированные с 15 мкг / мл, 45 мкг / мл в течение 24 ч, 48 ч, 72 ч и 96 ч) получали в соответствии с протоколом, описанным в [33]. Анализ выполняли на микропланшетах с применением анализа SOD (Cayman Chemical Company, Michigan, OH, USA), который измеряет все три типа SOD (Cu / ZnSOD, MnSOD и FeSOD). В анализе использовали соль тетразолия для обнаружения супероксидных радикалов, генерируемых ксантиноксидазой и гипоксантином. Одна единица SOD определяется как количество фермента, необходимое для демонстрации 50% дисмутации супероксидного радикала. Активность СОД измеряли путем считывания оптической плотности при 440–460 нм с помощью спектрофотометра для микропланшетов Bio-Rad.

Анализ MDA

Экстракты клеток Caco-2 и A549 (инкубированные с 15 мкг / мл, 45 мкг / мл в течение 24 ч, 48 ч, 72 ч и 96 ч) получали в соответствии с ранее описанными процедурами [33]. Анализ выполняли на микропланшетах с применением набора для анализа перекисного окисления липидов (MDA) (Abcam):MDA в образце реагировал с тиобарбитуровой кислотой (TBA) с образованием аддукта MDA-TBA. Этот метод включал спектрофотометрическое измерение красного цвета, возникающего при образовании аддукта MDA-TBA, который можно количественно определить (в единицах нмоль / мг белка) путем измерения оптической плотности при 532 нм с использованием спектрофотометра для микропланшетов Bio-Rad.

Анализ CLSM

Клетки высевали в 24-луночный планшет в концентрации 10 ⁵ . клеток / лунку и последовательно инкубировали с SiO ₂ НЧ и TiO ₂ НЧ в концентрации 15 мкг / мл и 45 мкг / мл в течение 24 ч, 48 ч, 72 ч и 96 ч. После обработки для каждой временной точки среду, содержащую наночастицы, удаляли, и клетки трижды промывали PBS, фиксировали 0,25% глутаровым альдегидом ( v / v в PBS, Sigma-Aldrich) в течение 20 мин и, наконец, проницаемость с помощью 0,1% тритона ( v / v в PBS, Sigma-Aldrich) в течение 5 мин. Для окрашивания актина использовали Phalloidin-ATTO 488 (Sigma-Aldrich) в концентрации 1 мкг / мл в течение 30 мин. Ядра метили с помощью DAPI (Sigma-Aldrich) в концентрации 1 мкг / мл в течение 7 мин. Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия выполнялась на конфокальном микроскопе Zeiss LSM700 (Zeiss), оборудованном инвертированным микроскопом Axio Observer Z1 (Zeiss), с использованием масляной иммерсионной линзы с числовой апертурой × 100, 1,46 для визуализации. Файлы конфокальных данных обрабатывали с использованием программного обеспечения ZEN2010 (Zeiss), а морфометрические количественные оценки (когерентность и интегрированная плотность F-актина) выполняли на 15 клетках с использованием программного обеспечения для анализа ImageJ 1.47. Плагин OrientationJ использовался для количественной оценки параметра когерентности путем выбора определенной последовательности областей интереса в конфокальных сборах на основе измерения тензоров структуры в локальной окрестности. В то же время программа рассчитала значение ориентации и когерентности, которые представляют степень, в которой актиновые волокна были ориентированы:больше неупорядоченных волокон имеют значения около 0, тогда как идеально выровненные волокна показывают значение когерентности около 1 [34]. Интегрированная плотность также была рассчитана как сумма значений пикселей в областях интереса при конфокальных сборах, чтобы количественно определить количество актиновых волокон в клетках.

Анализ AFM

Клетки Caco-2 и A549 высевали в пластиковые чашки Петри (Corning) в концентрации 10 ⁵ . ячейка / лунка и выращивают до 70–80% слияния. Затем клетки обрабатывали 45 мкг / мл TiO ₂ НП _S и SiO ₂ НЧ в DMEM в течение 72 ч. Последовательно удаляли NP и клетки промывали PBS. Клетки фиксировали 0,25% глутаровым альдегидом в течение 20 мин с последующей промывкой PBS. Измерения проводились с помощью усовершенствованного сканирующего зондового микроскопа (Bioscope Catalyst, Bruker Inc., США), установленного на инвертированном оптическом микроскопе (Zeiss Observer Z1, Zeiss GERMANY). Вся система размещена на основании, которое действует как изолятор по отношению к механическим колебаниям окружающей среды. АСМ-эксперименты проводились в режиме «сила-объем» с использованием V-образного микрорычага Bruker Sharp (MSNL, наконечник C):высокочувствительного кантилевера из нитрида кремния с номинальной жесткостью пружины 0,01 Н / м. Это значение было точно оценено методом тепловой настройки [35] до проведения АСМ регистрации. Использовались следующие параметры:область сканирования 50 мкм, частота линейного изменения 3 Гц, частота сканирования FV 0,03 Гц, порог срабатывания 100 нм, количество выборок 128, выборка на строку 64 и строки 64. Модуль Юнга (E) был определен на 20 клеток, из которых было извлечено 25 кривых сила-расстояние в соответствии с площадью ядра и 25 кривых в области цитоплазмы. Набор данных подхода (от точки контакта до максимального значения силы), полученный из извлеченных кривых, был адаптирован с помощью модифицированной модели Снеддона:

где z и δ c были экспериментальные данные по нагружению (высота и прогиб консоли соответственно), α - половина угла кончика, k _c - значение постоянной упругости кантилевера, а ν коэффициент Пуассона (принимается равным 0,5 для биологического образца). В алгоритме подбора точка контакта рассматривалась как подгоночная переменная, и силы адгезии учитывались на 20 ячейках.

Статистический анализ

Данные были выражены как среднее значение и соответствующее стандартное отклонение. Различия между различными средними значениями считались статистически значимыми при выполнении теста Стьюдента t тест с p значение ˂ 0,05 (<0,05 *, <0,01 ** и <0,005 ***).

Результаты

Характеристика SiO ₂ НЧ и TiO ₂ НП

SiO ₂ НЧ и TiO ₂ НЧ были синтезированы различными и воспроизводимыми способами синтеза с целью получения НЧ, имеющих узкое и контролируемое распределение по размерам (см. Раздел «Методы»). Затем НЧ были глубоко охарактеризованы с помощью ТЕМ, DLS, ζ-потенциала и XRD как в воде, так и в среде для культивирования клеток (DMEM) с различными концентрациями источника белка (FBS). Это очень важно, так как белки среды могут покрывать поверхность НЧ, тем самым изменяя их физико-химические свойства и, следовательно, биологические эффекты [36]. Анализ ПЭМ показал, что SiO ₂ НЧ имеют сферическую форму со средним диаметром 20 ± 2 нм (рис. 1а). TiO ₂ НЧ имеют одинаковый размер (25 ± 5 нм), но разную морфологию (рис. 1). Измерения DLS, проведенные в воде через 96 часов, подтвердили гидродинамический радиус 21 ± 7 нм и 27 ± 12 нм для SiO ₂ . НЧ и TiO ₂ НЧ соответственно (рис. 1б и рис. 1д). Как и ожидалось, эти данные хорошо согласуются с наблюдениями ПЭМ. Анализ ζ-потенциала также подтвердил значения поверхностного заряда в воде - 45 ± 3 мВ для SiO ₂ . НЧ и от - 50 ± 3 мВ для TiO ₂ НЧ (рис. 1в, е). Как и ожидалось, физико-химические свойства НЧ изменились при инокуляции в среду для культивирования клеток. DLS подтвердил значительное увеличение размера NP, особенно в присутствии DMEM с добавлением 20% FBS (таблица 1). В частности, SiO ₂ НЧ имели размер 29 ± 9 нм, а TiO ₂ НЧ увеличились до 41 ± 14 нм через 96 ч. Увеличение пика DLS, наблюдаемого в измерениях DMEM (с или без FBS), является признаком агломерации НЧ, чему может способствовать ионная сила среды (данные не показаны). Кроме того, измерения ζ-потенциала показали, что поверхностный заряд обеих НЧ сдвинулся к более отрицательным значениям . Это большое зависящее от времени явление было связано с довольно стабильным образованием короны белков [37, 38], вызванным присутствием сывороточных белков в среде для культивирования клеток, которые были адсорбированы на поверхности НЧ:размер и заряд НЧ изменяются как функция концентрации FBS.

Характеристики SiO ₂ НЧ и TiO ₂ НЧ в воде. а - г Типичные изображения ПЭМ. б - е Динамическое рассеяние света (DLS) и c - е Измерения ζ-потенциала. г Рентгеноструктурный анализ (XRD) TiO ₂ НП

Диаграмма XRD TiO ₂ НП _S , прокаленный при 430 ° C, показал смесь кристаллических фаз анатаза и рутила (рис. 1g ) . Доминирующие пики при 2θ =25,4 ° (101), 48,1 ° (200), 54,1 ° (211), 62,4 ° (204) и 68,8 ° (116) были характерны для фазового согласования анатаза со стандартными данными JCPDS ( карта №:21–1272). Фаза рутила представлена ​​дифракционными пиками при 27,5 ° (110), 36,2 ° (101) и 41,2 ° (111).

Поглощение НЧ клетками Caco-2 и A549

Для определения количества SiO ₂ НЧ и TiO ₂ НП _S захваченных клетками, мы провели элементный анализ ICP-AES над лизированными клетками в качестве предварительного исследования. Клетки обрабатывали 15 мкг / мл и 45 мкг / мл НЧ. Экспериментальные данные подтвердили наличие SiO ₂ НЧ и TiO ₂ NPs в обеих клеточных линиях с зависящей от времени эффективностью интернализации (Fig. 2a). TiO ₂ НЧ показали большее поглощение по сравнению с SiO ₂ НП. Это было особенно очевидно в Caco-2, где содержание Ti достигло внутриклеточных концентраций 8,2 ± 0,4 мкг и 9,7 ± 0,031 мкг через 72 и 96 часов соответственно . Количество Ti, обнаруженного в A549, было ниже:мы обнаружили 5 ± 0,599 мкг через 72 часа и 7,12 ± 0,11 мкг через 96 часов инкубации. SiO ₂ НЧ меньше поглощались клетками по сравнению с TiO ₂ НП, даже если интернализация была более выражена в Caco-2. Также в этом случае количество интернализованного SiO ₂ НЧ в клетках Caco-2 составляли 4,69 ± 0,031 мкг через 72 ч и 5,78 ± 0,045 мкг через 96 ч инкубации. Значения уменьшились в A549, где мы количественно определили 2,58 ± 0,045 мкг через 72 часа и 4,7 ± 0,04 мкг через 96 часов.

TiO ₂ НЧ и SiO ₂ Накопление НЧ в клеточных линиях Caco-2 и A549, подвергнутых воздействию 15 мкг / мл и 45 мкг / мл TiO ₂ НЧ и SiO ₂ НП в течение 24, 48, 72 и 96 часов. Затем клетки собирали, живые клетки подсчитывали и измеряли содержание Ti и Si в 360000 клеток (мкг Ti и мкг Si). Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение от трех независимых экспериментов; статистическая значимость экспонированных клеток по сравнению с контрольными клетками для p значение <0,05 (<0,05 *, <0,01 ** и <0,005 ***)

Влияние НЧ на CaCo-2 и A549:жизнеспособность клеток, повреждение мембраны и производство АФК

Жизнеспособность клеток Caco-2 и A549 оценивали с помощью анализа WST-8. Обработка SiO ₂ НЧ и TiO ₂ НЧ вызывали небольшое дозозависимое снижение жизнеспособности обеих тестируемых клеточных линий (рис. 3). TiO ₂ НЧ индуцировали повышенную цитотоксичность по отношению к SiO ₂ НЧ, и жизнеспособность клеток CaCo-2 была больше затронута, чем клетки A549, при обработке TiO ₂ НП. В частности, мы наблюдали снижение жизнеспособности примерно на 40% у Caco-2, обработанного 45 мкг / мл TiO ₂ НП на 72 ч. Это снижение еще больше снизилось до 50% через 96 часов, тогда как в клеточных линиях A549 TiO ₂ НЧ вызывали снижение жизнеспособности на 30% только после 96 ч обработки. Высвобождение ЛДГ и продукцию ROS оценивали в клетках Caco-2 и A549 после воздействия TiO ₂ НЧ и SiO ₂ НП. Как показано на рис. 4a, b, НЧ индуцировали порацию клеточной мембраны (и действительно высвобождение ЛДГ), что близко согласуется с результатами по жизнеспособности. Эффект был более очевиден в Caco-2 в отношении A549, особенно на TiO ₂ . Обработка НП, в самые высокие моменты времени (72 и 96 ч). Процент высвобождения ЛДГ увеличился примерно на 160% по сравнению с необработанными (контрольными) клетками после 96 часов воздействия. Генерация АФК широко изучается, потому что это один из основных эффектов, индуцируемых НЧ [39]. Этот феномен препятствует биологической реакции антиоксидантной защиты [40], хотя важно отметить, что реальный механизм действия все еще исследуется. Возможный окислительный стресс, вызванный NP, оценивали с помощью анализа DCFH-DA. Как и ожидалось, взаимодействие между НЧ и клетками стимулировало генерацию АФК дозозависимым образом с сильным эффектом Caco-2 на TiO ₂ Обработка НП (рис. 4в, г). Процент высвобождения достиг значений 165% по сравнению с контрольными клетками при наивысшей испытанной концентрации.

Анализ жизнеспособности (WST-8) Caco-2 ( a ) и A549 ( b ) клетки через 24 ч, 48 ч, 72 ч и 96 ч воздействия двух доз (15 мкг / мл и 45 мкг / мл) TiO ₂ НЧ и SiO ₂ НП. Жизнеспособность обработанных NP клеток нормализовали к необработанным контрольным клеткам. В качестве положительного контроля (P) клетки инкубировали с 5% ДМСО (данные не показаны). Данные, представленные как среднее ± стандартное отклонение из трех независимых экспериментов, считаются статистически значимыми по сравнению с контролем ( n =8) для p значение <0,05 (<0,05 *, <0,01 ** и <0,005 ***)

LDH ( а - б ) и ROS ( c - г ) анализы на клетках Caco-2 и A549. Клетки инкубировали с 15 мкг / мл и 45 мкг / мл TiO ₂ . НЧ и SiO ₂ НП в течение 24, 48, 72 и 96 часов. Процент утечки ЛДГ обработанных наночастицами клеток выражается относительно необработанных контрольных клеток. Положительные контроли (P) заключались в обработке клеток 0,9% Triton X-100, показывающим ок. Увеличение ЛДГ на 500% (данные не показаны). Уровни АФК регистрировали при воздействии на клетки Caco-2 и A549 15 мкг / мл и 45 мкг / мл TiO ₂ НЧ и SiO ₂ НЧ в течение 24 ч, 48 ч, 72 ч и 96 ч инкубировали со 100 мкМ DCFH-DA. Измеряли флуоресценцию клеток. В качестве положительного контроля (P) клетки инкубировали с 500 мкМ H ₂ . О ₂ показывая ок. Увеличение DCFH-DA на 300% (не показано). Данные, представленные как среднее ± стандартное отклонение из трех независимых экспериментов, считаются статистически значимыми по сравнению с контролем ( n =8) для p значение <0,05 (<0,05 *, <0,01 ** и <.005 ***)

Влияние НЧ на активность антиоксидантов и перекисное окисление липидов в клетках Caco-2 и A549

Фермент СОД участвует в системе антиоксидантной защиты после индукции окислительного стресса. Этот фермент катализирует дисмутацию высокореактивного супероксида (O ₂ ^{• -} ) анион в пероксиды H ₂ О ₂ [41]. Мы наблюдали дозозависимое снижение активности фермента SOD как в Caco-2, так и в A549 после инкубации с SiO ₂ НЧ и TiO ₂ НЧ (15 мкг / мл, 45 мкг / мл) в разные моменты времени (от 24 до 96 ч) (рис. 5а, б). В полном соответствии с оценками цитотоксичности, эффект был более очевиден в Caco-2 на TiO ₂ Воздействие НП. Например, уровни активности СОД были снижены с 4,1 ± 0,2 Ед / мл в контроле до 1,03 ± 0,325 Ед / мл в клетках Caco-2, подвергшихся воздействию 45 мкг / мл TiO ₂ НП, через 96 ч. Воздействие той же концентрации SiO ₂ НЧ снижали активность СОД до 1,45 ± 0,12 Ед / мл. Анализ на основе MDA использовался для проверки потенциального перекисного окисления липидов, опосредованного АФК, что, в свою очередь, является еще одним способом проверки окислительного стресса клеток. [42] Клеточные уровни MDA выросли после воздействия двух типов НЧ как для Caco-2, так и для A549 (рис. 5c, d). Как и ожидалось, повышенные уровни МДА были пропорциональны концентрации и времени воздействия.

а - г Анализы SOD и MDA на клетках Caco-2 и A549. Клетки инкубировали с 15 мкг / мл и 45 мкг / мл TiO ₂ . НЧ и SiO ₂ НП на 24 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч. В анализе SOD использовалась соль тетразолия для обнаружения супероксидных радикалов, генерируемых ксантиноксидазой и гипоксантином. Стандартную кривую использовали в качестве положительного контроля (данные не показаны). Уровни MDA определяли количественным определением аддукта MDA-TBA (OD =532 нм). Данные, представленные как среднее ± стандартное отклонение из трех независимых экспериментов, считаются статистически значимыми по сравнению с контролем ( n =8) для p значение <0,05 (<0,05 *, <0,01 ** и <0,005 ***)

Морфомеханические эффекты, вызванные НП

Анализ с помощью конфокальной микроскопии Caco-2 и A549, инкубированных с 15 мкг / мл и 45 мкг / мл SiO ₂ НЧ и TiO ₂ НЧ для 24 ч, 48 ч, 72 ч и 96 ч представлены на рис. 6 и 7. Контрольные клетки Caco-2 имели морфологию, аналогичную кишечным энтероцитам, с плотными контактами и щеточной каймой на апикальной стороне [43]. После обработки НЧ плотные контакты клеток разрушились, и структура клеток стала изолированной и приобрела удлиненную форму. Эти эффекты были более очевидны, когда клетки обрабатывались TiO ₂ . НЧ при 45 мкг / мл в течение 72 часов инкубации, демонстрируя соответствующие изменения паттернов актина, а также изменения в морфологии клеток. Необработанные клетки A549 проявляли камешковидную форму и функциональные межклеточные адгезии [44], тогда как обработка NPs уменьшала межклеточные контакты и изменяла морфологию клеток в сторону более вытянутых форм. Рисунок 8 показывает конфокальную фигуру в увеличенном масштабе, которая позволяет обнаруживать изменения в распределении актина. Измененная организация актиновой сети после воздействия НЧ (72 часа 45 мкг / мл SiO ₂ НЧ и TiO ₂ НЧ) количественно анализировали по плотности флуоресценции и когерентности с помощью программного обеспечения ImageJ (рис. 9). Мы специально выбрали эти два параметра, потому что интегральная плотность позволила нам количественно оценить количество актина, в то время как когерентность дала нам информацию о степени ориентации волокон по сравнению с окружающей средой [45]. Необработанные клетки Caco-2 имели значение плотности 129,4 ± 16, и это не влияло на обработку NP; значения составили 127,7 ± 20 и 128,5 ± 18 после воздействия SiO ₂ НЧ и TiO ₂ НЧ соответственно, рис. 9а). Точно так же плотность окрашенной актином сети осталась неизменной в A549 до и после обработки (68,4 ± 14, 67,9 ± 15 и 67,7 ± 18 для отрицательного контроля, SiO ₂ НЧ и TiO ₂ НЧ соответственно, рис. 9б). Хотя лечение NP не вызывает изменения количества актина, анализ когерентности предполагает несходную пространственную реорганизацию актина. В Caco-2 значения когерентности обработанных клеток для SiO ₂ NP (0,16 ± 0,04) и для TiO ₂ Обработка NP (0,09 ± 0,02) снизилась по сравнению с контролем (0,26 ± 0,03) (фиг. 9c). Even the A549 cells underwent a decrease of coherency after interacting with SiO₂ NPs and TiO₂ NPs (0.2 ± 0.07 and 0.158 ± 0.04) compared to the control cells (0.4 ± 0.03) (Fig. 9d). Hence, NPs induced a significant reorganization of actin network, which showed an actin isotropic orientation, but they did not change the overall quantity of actin expressed. In addition to cytoskeletal rearrangements, we also analyzed the area described by the nucleus/cytoplasm ratio. Values of N/C ratio were calculated as the ratio between nuclear area and the whole cellular area (measured performed on 15 cells). We observed opposite values following the treatment with 45 μg/ml of NPs for 72 h with significant statistical validity. In particular, the ratio was (0.40 ± 1.7) in untreated Caco-2 cells, and this increased up to 0.554 ± 0.09 and 0.62 ± 0.12 after SiO₂ NP and TiO₂ NP exposure (Fig. 9e). The trend was different in A549. The nuclear/cytoplasm ratio dropped down upon exposure to NPs from values of 0.550 ± 0.04 for control cells to 0.334 ± 0.06 for SiO₂ NPs and 0.225 ± 0.09 for TiO₂ НП. After the morphological investigations, we analyzed the elastic properties of cells after exposing them to 45 μg/ml of SiO₂ NPs and TiO₂ NPs for 72 h by AFM, in force–volume mode. We measured the different elasticity expressed by Young’s modulus values in the nuclear and cytoplasmic region. Caco-2 cells displayed Young’s modulus value of 105 ± 25 kPa for nuclear region and 47 ± 21 kPa for the cytoplasm. After SiO₂ NP treatment, we observed a reduction of value to 42 ± 8 kPa for the nucleus and 19.59 ± 2 kPa for the cytoplasm. The effects were more evident after treatment with TiO₂ NPs:the Young modulus for the nucleus was 27 ± 4 kPa and 18 ± 4 kPa for the cytoplasm (Fig. 10a). We found an opposite outcome concerning the elastic properties of A549 cells. In this case, Young’s modulus was 129 ± 24 kPa for the nuclear region and 147 ± 26 kPa for the cytoplasmic area. After SiO₂ NP treatment, the values of elasticity increased to 152 ± 23 kPa for nucleus and 152 ± 25 kPa for cytoplasm. When cells were doped with TiO₂ NPs, Young’s modulus values drastically increased to 372 ± 60 kPa for nucleus region and 549 ± 40 kPa for cytoplasmic region (Fig. 10b).

Effects of SiO₂ NPS and TiO₂ NPs on actin network of Caco-2 cells. Caco2 were treated with 15 μg/ml and 45 μg/ml of NPs for 24 h, 48 h, 72 h, and 96 h; cells were fixed and then stained with Phalloidin–ATTO 488 and DAPI. The 2D images of cortical actin were acquired by a Zeiss LSM700 (Zeiss) confocal microscope equipped with an Axio Observer Z1 (Zeiss) inverted microscope using a × 100, 1.46 numerical aperture oil immersion lens. All data were processed by ZEN software (Zeiss)

Effect of SiO₂ NPS and TiO₂ NPs on actin network on A549 cells. A549 were treated with 15 μg/ml and 45 μg/ml of NPs for 24 h, 48 h, 72 h, and 96 h; successively they were fixed and stained with Phalloidin–ATTO 488 and DAPI. The 2D images of cortical actin were acquired by a Zeiss LSM700 (Zeiss) confocal microscope equipped with an Axio Observer Z1 (Zeiss) inverted microscope using a × 100, 1.46 numerical aperture oil immersion lens. All data were processed by ZEN software (Zeiss)

Local enlargement of confocal acquisitions acquired in Figs. 6 and 7 showed (more in details) the effect of SiO₂ NPS and TiO₂ NPs on actin network of Caco-2 and A549 cells after the exposure of 45 μg/ml of NPs for 72 h and 96 h

Integrated density (a , b ) and coherency (c , d ) for Caco-2 and A549 cells treated with 45 μg/ml of SiO₂ NPs and TiO₂ NPs after 72 h. The integrated density and coherency values were expressed as a mean value and relative SD, calculated from confocal acquisitions by ImageJ (calculation on 15 cells). The mean values and their standard deviations were reported in the histograms. Results were statistically significant for p < 0.05 (< 0.05*, < 0.01**, and < 0.005***). е Analyses of nucleus/cytoplasm ratio on Caco-2 and A549 after exposure to 45 μg/ml of SiO₂ NPs and TiO₂ NPs for 72 h. The ratio was calculated on 15 cells by ImageJ. The mean values and the SD were reported in the histogram. Results were statistically significant for p  < 0.05 (< 0.05*, < 0.01**, and < 0.005***)

Young’s modulus values expressed in kPa, calculated from the nuclear region and the cytoskeletal area of Caco-2 (a ) and A549 (b ) cell lines after a treatment to 45 μg/ml of SiO₂ NPs and TiO₂ NPs for 72 h

Discussion

The spread of different kind of ENPs in several fields raises awareness about the importance to assess their potential toxicity in living organisms and the environments as well, taking into account their potential application in biomedical field [46,47,48]. In vitro and in vivo investigations are crucial to enrich the scientific knowledge and to release reliable clinical and epidemiological data [49]. The toxicity tests performed on different cells are considered the golden standard to assess the safety of NPs. However, few studies have investigated the interactions between NPs and cells from a biomechanical point of view. Cell mechanic is an important factor that influences many cellular pathways, including apoptosis, differentiation, migration, cancer metastasis, and wound healing [50]. In our work, we have addressed this point and related cell viability with the changes in mechanical properties of cells treated with different NPs. Firstly, we synthetized amorphous SiO₂ NPs and crystalline TiO₂ NPs with a size of c.a. 20 nm. NPs were stable in water and DMEM up to 96 h, even upon incubation with 10% and 20% of FBS. This was found to induce an increase in NPs size due to the formation of protein corona, in perfect agreement with the literature data. [51]. Since the entry route of NPs often occurs through inhalation and ingestion, we opted to investigate the potential effects on Caco-2 and A549 cells, which are representative models for the intestinal tract and airways mimicking oral and inhalation uptake [52]. As primary investigation, we quantified the cellular internalization of SiO₂ NPs and TiO₂ NPs by elemental analysis. The most effective uptake was observed in Caco-2 cells, especially upon treatment with TiO₂ NPs in a time-dependent manner. It has been reported that amorphous SiO₂ NPs, with a small size range of 15–20 nm, can bind the plasma membrane and then passively pass across the lipid bilayer to get access into the cells [53]. As demonstrated in A549 [54] and Caco-2 [55], in fact, small SiO₂ NPs can translocate in the cytoplasm with no apparent membrane encapsulation. The anatase crystalline form of TiO₂ NPs is the more chemically reactive [56] showing a faster absorption with respect to rutile, as previously reported [32]. However, the uptake mechanisms of Caco2 are still unclear, despite that some hypothesis have been formulated, some of these include metal ion release upon NPs degradation in the intestinal barrier lumen or/and direct uptake by endocytosis. [57]. In A549 cells, TiO₂ NPs were localized in cytoplasm and close the nucleus region [58]. We used WST-8 assay to assess the influence of different concentrations of SiO₂ NPs and TiO2NPs on cell viability. We have observed a general decrease of viability, especially in Caco-2, with TiO₂ NPs displaying the strongest toxicity. After assessing the viability, we monitored the extracellular release of the cytoplasmic enzyme LDH. We confirmed that the NPs induced an extensive membrane damage, which relates also to the increase of intracellular ROS levels, resulting in oxidative stress. In this context SOD, which acts as strong antioxidant against ROS [59], was significantly reduced most probably because of the unbalance of the redox repair systems. In addition, the oxidative stress increased the lipid peroxidation [60], as demonstrated by MDA measurements after NPs incubation. This is particularly evident in Caco-2 cells after TiO₂ NP exposure. It is worth mentioning that this effect can decrease membrane fluidity, which can further explain the observed higher entry levels of the TiO₂ NPs [61]. This was in significant accordance with the intracellular oxidative stress levels measured by SOD inhibition, as well as with the reactive oxygen species generation. After these assessments, we investigated the modulation of the cell cytoskeleton, as an increase of intracellular ROS could affect the F-actin organization [62]. The cytoskeleton is characterized by a set of filaments (actin microfilaments, microtubules, and intermediate filaments) organized in a network that affects the mechanical properties of cells, as well as their behavior [29]. In particular, actin filaments are crucial for cell mechanics, and any alterations may induce aberrations in cell morphology under sub-toxic conditions [63]. It has been demonstrated that actin was one of the most commonly bound protein by SiO₂ NPs and TiO₂ NPs in cellular extracts. This definitely suggests that the actin functions, as well as cell motility and organelles trafficking, can be strongly affected by the presence of these NPs [64, 65]. As a further proof, several in vivo studies have revealed the potential of NPs to induce alterations in the expression of genes related to the cytoskeleton [63]. In order to understand how NPs modulate the cytoskeleton, we performed qualitative and quantitative confocal analyses on Caco-2 and A549 cells, after SiO₂ NP and TIO₂ NP treatment. We focused on actin stress fibers and cortical actin because they allowed to maintain the physiological mechanical architecture of cells. As reported in Figs. 4 and 5, the treatment with NPs induced a significant reorganization of actin. This was more evident after 72 h of treatment with 45 μg/ml of NPs, and especially with the use of TiO₂ НП. The adverse effects were stronger in intestinal cells, where we have observed the formation of protrusions and philopodia at the plasma membrane level, together with the disruption of tight junctions. Fluorescence coherency and fluorescence density have been used as quantitative parameters to assess alterations of actin distribution in the cytoskeleton. While coherency gives information about the organization of actin, density quantifies the levels of fluorescent actin. Caco-2 and A549 exposed to NPs showed a reduction of coherency compared to untreated cells, especially upon incubation with TiO₂ НП. This was in good agreement with the qualitative confocal imaging analyses. The fluorescence density of actin was not altered by NP treatment in both the cell lines, even if untreated Caco-2 cells showed higher values with respect to untreated A549. These data could suggest a potential difference in the amount of actin, which is dependent on>the specific cell type. We also evaluated the nucleus-to-cytoplasm ratio as the relative area of the nucleus over the whole cell. We confirmed a reduction of values in A549 and an increase of the ratio in Caco-2 with respect to the control cells. This indicates changes in cell morphology after NP treatment:Caco-2 underwent an increase of nucleus area, whereas A549 became larger through cytoplasm extension. As a final point, we explored any potential change in cell elasticity upon NP treatment. Cell elasticity is commonly expressed by Young’s modulus (E), which is a ratio between the stress and the applied strain (with unit in Pascal) [66, 67]. Changes in cell elasticity due to cytoskeleton reorganization is often associated to disease progression [68], hence (E) can be a refined indicator of potential pathological states [67]. The deformability of cells was measured through indentation experiments by AFM [69]. Many studies showed the detrimental effects of NPs on the F-actin that induced an enhancement of cell elasticity. However, a clear relation between change in cell stiffness, actin rearrangement and cell viability has not been clearly established yet. Here, we have covered such topic and found that Caco-2 and A549 cells significantly change their (E) upon NP treatment, even though in two different ways. Caco-2 cells are softer as confirmed by the decreased Young’s modulus, which has been found to be a function of both the NPs type and the cell regions analyzed. In particular, TiO₂ NPs induced a general enhancement of elasticity, and this effect is more evident in the nuclear regions rather than the cytoplasmic one. On the other side, A549 displayed a remarkable increase of Young’s modulus after TiO₂ NP exposure in cytoplasm region, compared to control cells (594 ± 40 kPa versus 146 ± 26 kPa, respectively). These data indicated that TiO₂ NPs induce dose-dependent changes in force–deformation profiles in both cell lines, whereas SiO₂ NPs showed little effects. The decrease of Young’s Modulus, and consequently an increase of elasticity after NPs exposure, can potentially impact cell homeostasis and physiological pathways. The reorganization F-actin, together with a reduction of coherency, showed a strong modulation of mechanical cell properties. NPs have been demonstrated to make the nuclear region of Caco-2 cells softer than untreated cells. The increase of elasticity (corresponding to a reduction of Young’s modulus) is a critical factor in tumor progression, because it is an indicator of disruption of cell junctions, which promotes in turn cell migration and metastatization [70]. Therefore, the treatment with NPs on Caco-2 (and TiO₂ NP_S in particular) can potentially promote migration due to change of elastic properties and deformability of cells. Also, the larger and softer nucleus area can be associated to cancer progression [71].

Conclusion

In this paper, we careful assessed the adverse effects of SiO₂ NPs and TiO₂ NPs on two different cell lines (Caco-2 and A549), mimicking the typical tissue that are exposed to NPs (ingestion and inhalation). SiO ₂ NPs presented a low cytotoxicity in comparison with TiO₂ NPS. We demonstrated how the cellular exposure to high doses of NPs induced morphostructural changes in term of actin reorganization, coherency, density and nucleus/cytoplasm ratio, which were more evident upon TiO₂ NP treatment. Cell membrane deformability measurements showed different behavior in the two cells. In Caco-2, the cell elasticity increased after NP treatment, whereas A549 displayed an increase of stiffness. These results demonstrated that NPs induce modifications of cytoskeleton structures and, as consequence, a different Young’s Modulus values. Hence, the phenotype of cancer cells can turn into a more invasive profile, characterized by enhanced migration. On the other side, the increased stiffness observed in A549 might not promote the mobility of this specific cell indeed. We are sure that the analysis of cell mechanics upon NP exposure, combined with standard toxicological assays, will represent a golden standard to accurately assess the safety of NPs and to predict any potential possible diseases triggered by NPs.

Сокращения

A549:

Human adenocarcinoma alveolar basal epithelial cells

AFM:

Атомно-силовая микроскопия

ATP:

Adenosine triphosphate

Caco-2:

Human epithelial colorectal adenocarcinoma

CLSM:

Confocal Laser Scanning Microscopy

DAPI:

4′,6′-Diamidino-2-phenylindole

DCF-DA:

2′,7′-Dichlorofluorescein diacetate

DLS:

Динамическое рассеяние света

DMEM:

Dulbecco’s modified Eagle’s medium

ENPs:

Engineered nanoparticles

FBS:

Fetal bovine serum

HCl/HNO3:

Hydrochloric/nitric acid

ICP-AES:

Inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy

LDH:

Lactate dehydrogenase

MDA:

Malondialdehyde

NH4OH:

Ammonium hydroxide

НП:

Наночастицы

PBS:

Phosphate Buffered Saline

ROIs:

Regions of interest

ROS:

Reactive Oxygen Species

SiO2NPs:

Silicon dioxide nanoparticles

SOD:

Superoxide dismutase

TBA:

Thiobarbituric acid

ТЕМ:

Просвечивающая электронная микроскопия

TEOS:

Tetraethyl orthosilicate

TiO2NPS:

Titanium dioxide nanoparticles

TTIP:

Titanium (IV) isopropoxide

XRD:

Рентгеновская дифракция