Новая доставка митоксантрона с гидрофобно модифицированными наночастицами пуллулана для ингибирования раковых клеток мочевого пузыря и влияние размера нанопрепарата на эффективность ингибирования

Фон

Химиотерапия - это распространенное лечение опухолей. Однако из-за отсутствия тканевой специфичности терапевтический эффект химиотерапии ограничен и часто имеет сильные побочные эффекты [1, 2]. Поэтому исследования по использованию препаратов наночастиц (НЧ) для увеличения целевой способности химиотерапевтических препаратов увеличились [3,4,5].

После пассивного воздействия на опухолевые ткани за счет эффекта повышенной проницаемости и удерживания (EPR) нанолекарства, такие как низкомолекулярные противоопухолевые препараты, нагруженные NP, в основном проявляют свою эффективность двумя способами:(1) высвобождаясь в опухолевых тканях и попадая в них. клетки в свободной форме для проявления эффективности и (2) поглощение клетками в форме микрочастиц и высвобождение в клетке для оказания фармакодинамических эффектов [6, 7]. Когда нано-фармацевтический агент пассивно нацелен на опухоль, какой из двух методов играет главную роль или оба играют важную роль одновременно, и участвуют ли другие факторы, является сложным вопросом. Из-за метаболической активности опухолевых тканей, ишемии и гипоксии и накопления молочной кислоты, а также из-за того, что внеклеточная жидкость опухолевых тканей имеет слабую кислотность, многие нанопрепараты демонстрируют повышенное высвобождение в кислой среде для повышения эффективности [8]. Эффективность высвобождения лекарств из нанолекарств в кислой среде тесно связана с физико-химическими свойствами наноматериалов, а также зависит от размера наночастиц [9,10,11]. После того, как НЧ пассивно нацелены на опухолевую ткань, поскольку опухолевые клетки выполняют функцию фагоцитоза, нанофармацевтический препарат попадает в клетки в основном через пиноцитоз и сложные процессы, опосредованные белками клеточной мембраны [12, 13]. При разложении внутриклеточных лизоцимов нано-фармацевтические препараты выделяют лекарственные средства и проявляют эффективность [14].

Эффективность поглощения клетками-мишенями тканями-мишенями тесно связана со свойствами наноматериалов, модификацией поверхности, морфологией, зарядом и размером наночастиц [15,16,17,18]. Поглощение клетками в значительной степени зависит от размера NP. Интернализация (эндоцитоз) НЧ Her-gold сильно зависит от размера, наиболее эффективное поглощение происходит в НЧ в диапазоне от 25 до 50 нм [19]. Чрезвычайно маленькие или большие наночастицы будут иметь неэффективное поглощение. Размер от 40 до 50 нм является критической точкой для рецептор-опосредованного эндоцитоза [20]. Кроме того, размер NP влияет на цитотоксичность. При сравнении НЧ 45 и 90 нм размер полимерных НЧ обратно пропорционален цитотоксичности [21]. Размер НЧ влияет на высвобождение лекарства в опухолевой ткани, а также на эффективность поглощения клетками и, в конечном итоге, играет важную роль в эффективности лекарства.

Локальная адгезия полисахаридов улучшает функцию локализации и нацеливания. Кислая среда внешних раковых клеток приводит к частичному высвобождению полисахаридных нанолекарств, вызывая двойной терапевтический эффект загруженных лекарством НЧ и свободных лекарств после пассивного воздействия на опухолевые ткани [22, 23].

Пуллулан, который не токсичен, легко разлагается в организме, а его холестерин является внутренним веществом в организме, поэтому он безопасен и подходит в качестве носителя для лекарств [24, 25]. Полимеры пуллулана, гидрофобно модифицированные холестерилом (ГПК), которые имеют гидрофобные холестерильные группы и гидрофильные сахарные цепи, могут самособираться в наносферические структуры с гидрофобными центральными ядрами и гидрофильными оболочками [26, 27]. Амфифильные полимеры самоорганизуются в НЧ в сфероидальных структурах, при этом гидрофобное ядро ​​образовано гидрофобными группами, такими как холестерильные группы [28].

Митоксантрон, противоопухолевый активный антрациклиновый антибиотик широкого спектра действия, который может интеркалировать ДНК и ингибировать топоизомеразу II, является классическим противоопухолевым препаратом. Однако из-за его кардиотоксичности использование митоксантрона ограничено. Митоксантрон загружается на гидрофобный центр НЧ КГП за счет гидрофобного взаимодействия с образованием препаратов нанометрового диапазона КГП, которые обладают пассивным нацеливающим эффектом за счет эффекта ЭПР. По сравнению со свободными лекарствами, ГПК НЧ, нагруженные лекарствами, демонстрируют пониженное токсическое действие лекарств и повышенную противоопухолевую эффективность [29, 30]. Холестерил с гидрофобной группой в полимере КГП управляет формированием структуры ядра НЧ, и в определенном диапазоне, чем выше степень замещения гидрофобной группы, тем меньше размер НЧ [31, 32]. Стабильность КГП была выше по крайней мере 2 месяца без значительных изменений размера и дзета-потенциала, а наночастицы пуллулана могут попадать в опухолевую ткань, чтобы убить раковые клетки за счет эффекта ЭПР [33, 34].

В этом исследовании мы использовали НЧ пуллулана (CHP), гидрофобно модифицированные холестерином, в качестве носителей противоопухолевых препаратов для загрузки митоксантрона. НЧ пуллулана, нагруженные митоксантроном, были получены путем синтеза полимеров КГП с различным соотношением заряда эфира холестерина (CHS) янтарного ангидрида для изучения влияния размера НЧ на длительное высвобождение лекарства, высвобождение лекарства в кислой среде, токсичность для рака мочевого пузыря. клетки, эффективность захвата клеток и миграция клеток. В этом эксперименте оценивался диапазон размеров НЧ с пассивным нацеливанием для отбора подходящего НЧ в качестве носителя лекарственного средства и для повышения эффективности препарата.

Материалы и методы

Реагенты и инструменты

Митоксантрон был от компании Aladdin Chemistry (Шанхай); мешок для диализа (BioSharp, США, 8000 ~ 12000 Да) был от Tianjin Junyao Biotechnology. Остальные реагенты были от Beijing Xinze Technology.

Использовали японский флуоресцентный спектрофотометр F-4500, хроматограф кругового дихроизма J-810 (Jasco Co., Япония), анализатор размера частиц (MALVERN, Nano 2S-90, Япония) и проекционный электронный микроскоп (JEM-100CXII, Япония). .

Синтез и характеристика полимера ГПК и расчет степени замещения холестерина

Ранее сообщалось о синтезе янтарного ангидрида CHS [35]. Образец пуллулана 0,5 г растворяли в 15 мл дегидратированного диметилсульфоксида для резерва. CHS (сахарная единица / CHS =0,20, 0,15, 0,05 ммоль / ммоль), 4-диметилпиридин (DMAP ∕ CHS =1 ммоль / ммоль) и гидрохлорид 1- (3-диметиламинопропил) -3-этилкарбодиимида (EDC CHS =1,2 ммоль / ммоль) отдельно растворяли в 10 мл ДМСО, перемешивали при комнатной температуре и активировали в течение 1 часа; реакция активации капала в раствор пуллулана; и реакция была остановлена ​​через 48 часов. Реакционную смесь по каплям добавляли в 200 мл абсолютного этанола, после чего образовывался белый осадок. Фильтровали отсасыванием, и продукт промывали подходящими количествами этанола, тетрагидрофурана и диэтилового эфира, а затем сушили при 80 ° C. Были получены три вида полимеров КГП с разной степенью замещения холестерина:КГП-1, КГП-2 и КГП-3 [36]. Полисахарид пуллулана и 10–20 мг полимера КГП растворяли в ДМСО-d6 в ультразвуковых условиях и ¹ Исследованы спектры ЯМР 1Н. Степень замещения холестерина в полимере КГП определялась на основе гликозидных связей α-1,4 и α-1,6 и площади под пиком метилена.

Приготовление и определение характеристик НЧ ТЭЦ, нагруженных лекарствами

Синтез нагруженных митоксантроном НЧ КГП, как описано [37, 38], НЧ, нагруженные лекарством, были получены диализом с 40 мг каждого из трех НЧ КГП, замещенных различной степенью холестерина и 4 мг митоксантрона для резервного копирования. Вновь приготовленные НЧ с лекарством или НЧ с лекарством, диспергированные в дистиллированной воде после лиофилизации, капали на медную сетку с углеродной поддерживающей пленкой, и фильтровальная бумага осушалась. Сетки помещали в эксикатор, затем 2% ( w / w ) добавляли фосфорновольфрамовую кислоту (2%), которая была отрицательной после естественной сушки и наблюдалась с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) [38]. Раствор вновь приготовленных НЧ с лекарством или НЧ с лекарством, диспергированных в дистиллированной воде после лиофилизации, разливали в кюветы и помещали в анализатор размера частиц для обнаружения. Каждый образец был обработан трижды, чтобы получить равный размер и даже потенциал НЧ.

Измерение загрузки лекарственного средства и эффективности инкапсуляции нагруженных лекарством ЯЧ ТЭЦ

Содержание загруженного лекарственного средства (LC%) и эффективность инкапсуляции (EE%) загруженных митоксантроном НЧ КГП измеряли, как описано [31, 39], следующим образом:

Исследование выпуска наркотиков

Три типа НЧ, нагруженных митоксантроном, помещали в фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) и в среду для высвобождения с pH =6,8 и 4,0. Высвобождение митоксантрона изучали in vitro с помощью диализа, и процент накопленного высвобождения (Q%) рассчитывали, как описано [40].

Линии клеток и условия культивирования

Клеточная линия рака мочевого пузыря мыши MB49, предоставленная доктором П. Го (Институт урологии Сианьского университета Цзяотун, Сиань, Шэньси, Китай), была культивирована в среде DMEM (Lonza) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (Hyclone, Logan). , Штат Юта, США) и 1% пенициллин-стрептомицин при 37 ° C в увлажненном воздухе, содержащем 5% CO ₂ .

Анализ жизнеспособности клеток

Жизнеспособность клеток оценивали с помощью анализа на основе тетразолия. Вкратце, клетки засевали в количестве 2 × 10 ⁴ на лунку в 96-луночных планшетах для культивирования и оставляли прикрепляться на 24 часа. В начале экспериментов была оптимизирована разная плотность посева. Клетки обрабатывали митоксантроном в различных концентрациях в течение 24 ч в инкубаторе. Митоксантрон в концентрациях 0,0078, 0,0156, 0,03125, 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5 и 1 мкМ растворяли в DMEM с добавлением 1% фетальной бычьей сыворотки. Количество 50 мкл тетразолиевой соли МТТ (Sigma), растворенное в сбалансированном растворе Хэнка в концентрации 2 мг / мл, добавляли в каждую лунку с указанной обработкой и инкубировали в CO ₂ инкубатор на 5 ч. Наконец, среду отсасывали из каждой лунки и добавляли 150 мкл ДМСО (Sigma) для растворения кристаллов формазана. Оптическую плотность каждой лунки получали с использованием планшет-ридера Dynatech MR5000 при тестовой длине волны 490 нм и эталонной длине волны 630 нм.

IC ₅₀ Значения митоксантрона определяли по кривым доза-ответ. Три концентрации НЧ (0,0625, 0,125, 0,25 мкМ) с тремя степенями замещения сравнивали с помощью МТТ. Процедура эксперимента была такой же, как и для митоксантрона.

Оценка апоптоза

Скорость апоптоза клеток определяли с помощью проточной цитометрии с аннексином V-FITC / йодидом пропидия (PI). Вкратце, обработанные клетки дважды промывали холодным PBS, затем ресуспендировали в связывающем буфере при 2 × 10 ⁶ клеток / мл в соответствии с инструкциями производителя. Затем 5 мкл аннексина V-FITC и 5 мкМ PI добавляли в 100 мкл клеточной суспензии и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте. После добавления 300 мкл связывающего буфера меченые клетки были обнаружены проточной цитометрией в течение 1 часа.

Все клетки раннего апоптоза (положительные по аннексину V-FITC [окрашены зеленым], PI-отрицательные), некротические клетки (отрицательные по аннексину V-FITC, положительные по PI), клетки позднего апоптоза (двойные положительные), а также живые клетки ( двойной отрицательный) были обнаружены с помощью проточной цитометрии (FCM) и проанализированы с использованием программного обеспечения Cell Quest (Becton Dickinson). Длина волны возбуждения аргонового лазера составляла 488 нм, а длина волны излучения 530 нм (канал FL-1) для флуоресцеинизотиоцианата (FITC) и 670 нм (канал FL-3 c3) для PI. Также апоптоз исследовали с помощью флуоресцентной микроскопии. Во-первых, 1.0 × 10 ⁵ клетки высевали в 96-луночные культуральные планшеты, и через 24 часа клетки обрабатывали, как указано выше, затем через 24 часа в клетки добавляли 100 мкл связывающего буфера, 1 мкл аннексина V-FITC и 1 мкл лейкоцитов при комнатной температуре в темноте. в течение 15 минут, выдерживали при низкой температуре и наблюдали с помощью флуоресцентной микроскопии.

Анализ миграции клеток

Всего 8 × 10 ⁵ клетки высевали в шестилуночные планшеты и позволяли достичь полного слияния. Монослой был поврежден коктейльной палочкой. Клетки инкубировали с бессывороточной DMEM, как указано. Цифровые изображения были получены через 0, 6, 12, 24 и 48 часов. Средняя площадь была рассчитана с использованием изображения J, и эксперименты были повторены трижды.

Результаты и обсуждение

Конъюгаты CHP и степень замещения холестерина

¹ Значение H ЯМР для CHP (ДМСО-d6 с ТМС, ppm) составляло 2,53 ppm (2 метиленовые группы, –OCH ₂ Канал ₂ O–). На рисунке 1 показан ¹ . Спектры ЯМР 1Н, подтверждающие, что холестерин был химически связан с длинной цепью пуллулана через янтарный спейсер. Спектры трех НЧ КГП, синтезированных при различных соотношениях подачи (a, b, c), показали характерные пики пуллулана; Гликозидные связи α-1-4 и α-1,6 составляли ∂ _4.68 (1Hα _1–6 ), ∂ _5,05 (1Hα _1–4 ) и ∂ _2.53 (2 метиленовые группы, –OCH ₂ Канал ₂ O–) соответственно, которые также было легко различить. Появились новые характеристические пики от 0,40 до 2,40 (водород на холестерическом каркасе), что подтвердило успешный синтез трех полимеров ГПК. Площадь под пиком отражает количество атомов, а степень холестерического замещения может быть рассчитана следующим образом [41]:

Спектры ЯМР для CHP-1 ( a ), ТЭЦ-2 ( б ) и ТЭЦ-3 ( c )

где сумма A _∂4.68 и A _∂5.05 представляет количество сахарных единиц, A _{∂ 2,53} - количество атомов водорода в –OCH ₂ Канал ₂ O– холестерилянтарной кислоты и A _{∂ 2,53} / 4 - число –OCH ₂ Канал ₂ O–, то есть количество холестеринов в янтарном ангидриде CHS. Таким образом, приведенная выше формула представляет степень холестерического замещения в молекуле CHP как количество холестерильных групп на 100 единиц глюкозы. Рассчитанные соотношения подачи и молярные отношения холестерил и пуллулан сахарных единиц составляли 1/5, 3/20 и 1/20 соответственно, а степень замещения трех синтезированных CHP-1, CHP-2 и CHP-3 полимеры составляли 6,82%, 5,78% и 2,74% соответственно. Степень замещения холестерина в цепи пуллулана увеличивается с увеличением соотношения подачи корма. Однако фактическая степень замещения была ниже, чем при обоих соотношениях подачи.

Цепь пуллулана может существовать в виде гибкой спиральной цепи в растворителе, и после добавления определенного количества холестерина привитой холестерин демонстрирует большее молекулярное стерическое препятствие, что влияет на дальнейшую прямую реакцию этерификации сукцинилхолестерина и гидроксильной группы. на пуллулановой цепи. Сложность реакции была значительно увеличена, поэтому степень замещения стала меньше.

НЧ ТЭЦ с лекарственными препаратами и их размер

Размеры трех холостых НЧ КГП для КГП-1, КГП-2 и КГП-3 составляли 79,1, 104,9 и 166,8 нм. При определенной степени замещения гидрофобность усиливается с увеличением степени замещения холестерина. Чем сильнее гидрофобность, тем лучше самоагрегированные НЧ КГП образуют более компактное гидрофобное ядро, что уменьшает размер НЧ [42]. На рис. 2 показан размер загруженных лекарством ЯЧ ТЭЦ. Размеры частиц для CHP-1, CHP-2 и CHP-3 составляли 86,4, 162,30 и 222,28 нм соответственно. При том же соотношении лекарств и материалов размер частиц загруженных лекарством NP с высокой степенью замещения гидрофобной группы полимера был небольшим, но диаметр частиц загруженных лекарством NP был больше, чем у неинкапсулированного лекарственного средства. -содержащий пустой НП с такой же степенью замещения. Когда митоксантрон проникает в гидрофобное ядро, размер частиц НЧ увеличивается. На рис. 2d дзета-потенциал загруженных лекарством НЧ ГПК составляет -1,12 мВ. Рис. 2e представляет собой ПЭМ-изображение, показывающее, что загруженные лекарством НЧ имеют сферическую форму.

Изображения размера NP, загруженного митоксантроном (CHP-1 ( a ), ТЭЦ-2 ( б ), ТЭЦ-3 ( в )), потенциальные образы (CHP-2 ( d )) и изображения ПЭМ (CHP-2 ( e ))

Высвобождение лекарственного средства из наночастиц с лекарственными средствами разного размера и в различных кислых средах

Когда соотношения лекарственного средства и полимера ГПК были одинаковыми, загрузка лекарственного средства и эффективность захвата загруженных лекарством НЧ СНР-1, CHP-2 и CHP-3 составляли 8,17% и 88,92%; 7,62% и 82,28%; и 4,83% и 50,67% соответственно. Чем выше холестерическое гидрофобное замещение в полимере КГП, тем меньше размер образующихся частиц и тем выше нагрузка лекарственного средства и эффективность захвата. На рисунке 3 показаны профили высвобождения лекарства для трех загруженных лекарством НЧ КГП. В PBS препарат отпускали 48 ч. Нормы выбросов для ТЭЦ-1, ТЭЦ-2 и ТЭЦ-3 составили 38,73%, 42,35% и 58,89% соответственно. Все три NP показали свойства замедленного высвобождения, но чем меньше размер NP, тем сильнее гидрофобность и медленнее высвобождение лекарственного средства. При pH 6,8 скорости высвобождения лекарственного средства для CHP-1, CHP-2 и CHP-3 составляли 43,82%, 49,48% и 64,18% соответственно. В слабокислых условиях НЧ КГП устойчиво высвобождали лекарство, но скорость высвобождения значительно увеличивалась. При pH 4,0 после 48-часового высвобождения лекарства скорости высвобождения лекарства для CHP-1, CHP-2 и CHP-3 составляли 51,25%, 56,23% и 75,46% соответственно. Высвобождение лекарственного средства CHP NP происходило значительно быстрее при более низком pH, особенно для NP CHP-3, самого большого из трех НЧ ГПК.

Высвобождение митоксантрона (МТО) из НЧ пуллулана в фосфатно-солевом буфере (черный квадрат:CHP-1, белый кружок:CHP-2, черный треугольник, направленный вниз:CHP-3), при pH 6,8 (белый треугольник, направленный вверх:CHP- 1, черный ромб:CHP-2, белый квадрат:CHP-3) и pH 4,0 (черный треугольник:CHP-1, белый ромб:CHP-2, черный кружок:CHP-3) при 37 ° C in vitro

Цитотоксичность НЧ КГП, нагруженных митоксантроном

В анализе МТТ (рис. 4) IC ₅₀ Значения митоксантрона для ингибирования роста клеток рака мочевого пузыря составляли 0,25, 0,20 и 0,06 мкМ через 24, 48 и 72 часа соответственно (Таблица 1). Мы считали, что время дозирования составляет 24 часа.

Влияние лечения митоксантроном и НЧ на пролиферацию клеток линии MB49 рака мочевого пузыря. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью анализа на основе тетразолия с 24-, 48- и 72-часовой обработкой митоксантроном и нанопрепаратами от 0 до 0,5 мкг / мл на линии клеток рака мочевого пузыря мыши MB49

Поскольку концентрация свободного митоксантрона и НЧ митоксантрон-КГП одинакова при одинаковом введении, результаты экспериментов МТТ на фиг. 5 показывают, что концентрация свободного митоксантрона была более токсичной для клеток рака мочевого пузыря, чем НЧ митоксантрон-КГП. При сравнении НЧ митоксантрон-КГП с тремя степенями замещения холестерина, наиболее сильным цитотоксическим эффектом был СНР-3, за ним следовал СНР-2, а самым слабым был СНР-1.

Цитотоксичность свободных митоксантрон и нагруженных митоксантроном НЧ КГП через 24 часа (синий квадрат:митоксантрон, розовый кружок:CHP-1, зеленый треугольник:CHP-2, красный треугольник, направленный вниз:CHP-3)

Хотя токсические эффекты различных концентраций НЧ митоксантрон-СНР на клетки рака мочевого пузыря были сходными, особенно СНР-2 и СНР-3, эффект СНР-1 был значительно снижен. Это явление проявлялось в каждой концентрации CHP-1. Таким образом, чем больше размер НЧ митоксантрон-КГП, тем сильнее цитотоксичность.

Терапевтический эффект НЧ состоит из двух частей:(1) поглощение НЧ клеткой и (2) НЧ, высвобождаемые за пределы клетки, и лекарства, свободно поступающие в клетки, чтобы проявить свою эффективность. Поскольку свободный митоксантрон имеет более сильный эффект, чем митоксантрон-КГП НЧ, КГП-3 имел более сильный терапевтический эффект, чем два других НЧ КГП при той же дозе лекарственного средства. Высвобождение КГП-3 было самым быстрым, а терапевтический эффект НЧ КГП зависел в основном от токсичности свободного митоксантрона в клетках после высвобождения нано-фармацевтического препарата.

Апоптоз клеток НЧ митоксантрон-КГП

Мы использовали иммунофлуоресценцию и проточную цитометрию, чтобы сравнить влияние одной и той же концентрации митоксантрона 0,2 мкг / мл и трех загруженных лекарственным средством НЧ КНР на апоптоз клеток MB49. Свободный митоксантрон был сильнее для апоптоза, чем три НЧ митоксантрон-КГП (рис. 6). Однако наиболее сильным эффектом был КГП-3, а наименьшим - КГП-1. Предыдущие результаты МТТ были дополнительно подтверждены.

Апоптоз митоксантрона и нанопрепаратов через 24 часа на раковых клетках мочевого пузыря MB49 ( a ДМСО, b митоксантрон, c ТЭЦ-3, д ТЭЦ-2, е CHP-1):A. Двойное окрашивание аннексином V-FITC / PI было обнаружено с помощью флуоресцентной микроскопии, клетки с ранним апоптозом показали положительное окрашивание на аннексин V-FITC (зеленый), некротические клетки были PI-положительными (красный), а клетки с поздним апоптозом показали положительное двойное окрашивание (желтый). B. Скорость апоптоза определяли с помощью FCM. Живые клетки (Q3), скорость раннего апоптоза (Q4), скорость позднего апоптоза (Q2), некротические клетки (Q1). Чем сильнее окрашиваются клетки, тем выше скорость апоптоза

Миграция клеток НЧ ТЭЦ, нагруженных митоксантроном

24- и 48-часовая способность свободного митоксантрона и трех НЧ КНР ингибировать миграцию клеток MB49 наблюдалась при сравнении с контролем (рис. 7). Ингибирование миграции не было значительно сильнее для свободного митоксантрона, чем для трех НЧ КГП. В анализе МТТ и тесте на апоптоз ингибирование миграции было более сильным для свободного лекарственного средства, чем для трех НЧ КНР, в основном потому, что свободное лекарственное средство более легко проникало в клетки для уничтожения раковых клеток. Кроме того, в эксперименте по миграции клеток свободное лекарство может ингибировать миграцию клеток более эффективно, чем нано-фармацевтические препараты CHP, что может быть связано с тем, что некоторые нано-фармацевтические препараты CHP не фагоцитируются между клетками, что приводит к устойчивости раковых клеток к миграции. Более того, три НЧ КГП не различались по ингибированию миграции раковых клеток, поэтому стерическое сопротивление, сформированное НЧ, играло важную роль в миграции клеток. Следовательно, нагруженные лекарством CHPNP ингибируют раковые клетки двумя способами:(1) внеклеточное высвобождение является доминирующим способом, при котором нанолекарства высвобождают лекарства за пределы клеток и убивают раковые клетки как свободные лекарства, при этом НЧ CHP-3 являются более токсичными. чем другие НЧ КГП, и (2) НЧ КГП вне раковых клеток создают стерическое сопротивление, тем самым блокируя миграцию раковых клеток.

Митоксантрон сам по себе и НЧ, нагруженные митоксантроном, показали нарушение миграции в анализах заживления ран. а ДМСО, b митоксантрон, c ТЭЦ-3, д ТЭЦ-2, е ТЭЦ-1. Изображения показали разрыв поцарапанной области в разное время; A ₀ , А ₂₄ , и A ₄₈ представляют 0, 24 и 48 часов обработки ДМСО соответственно

Целью этого исследования был скрининг НЧ КГП подходящего размера в качестве носителей лекарств и предоставление экспериментальных данных о терапевтическом действии НЧ КГП. Мы синтезировали три вида стеролзамещенных пуллулановых полимеров (CHP), CHP-1, CHP-2 и CHP-3, со степенью замещения холестерина 6,82%, 5,78%, 2,74% соответственно и диаметром 86,4, 162,30 и 222,28. нм. Скорость высвобождения трех видов НЧ митоксантрон-КГП за 48 ч составила 38,73%, 42,35% и 58,89% соответственно. Степень гидрофобного замещения в полимере была связана с процессом самосборки наночастиц, влияя на их размер и, следовательно, на скорость высвобождения лекарственного средства. В кислотных высвобождающих средах высвобождение было значительно ускорено. Чем больше NP, тем больше скорость высвобождения лекарства. Через 24 часа IC ₅₀ значение составляло 0,25 M, для наилучшего ингибирующего действия митоксантрона на рост клеток рака мочевого пузыря. Нагруженные лекарством НЧ КНР-3 с наибольшим размером были наиболее токсичными для клеток рака мочевого пузыря, а НЧ КНР-3 оказывали наиболее сильное влияние на стимулирование апоптоза клеток. Все НЧ могут ингибировать миграцию клеток MB49, но НЧ СНР-3 большого размера обладают наиболее сильным ингибированием.

Амфифильные полимеры могут самоорганизовываться в НЧ в водных растворах; примерами являются полисахариды пуллулан и хитозан, которые могут быть модифицированы в амфифильные полимеры путем гидрофобной модификации малых молекул и самоорганизуются в сферические НЧ в водных растворах с гидрофобными группами в качестве ядра и гидрофильных оболочек сахарных цепей [43, 44]. Во время самосборки гидрофобные группы являются движущей силой образования НЧ и ключом к формированию их оболочки и структуры ядра. Свойства и молекулярная масса гидрофильных групп также оказывают важное влияние на образование и размер НЧ [45, 46]. Когда тот же полимер модифицируется небольшой долей гидрофобной группы, степень гидрофобного замещения должна быть умеренной, и только в пределах определенного диапазона гидрофобное замещение может самоорганизовываться в НЧ. Если степень гидрофобного замещения слишком высока, гидрофобность полимера слишком высока, что не способствует самосборке. Если гидрофобное замещение слишком мало, гидрофобная движущая сила слишком мала для образования НЧ [47].

В этом исследовании мы успешно синтезировали три типа полимеров КГП с различной степенью замещения холестерина, разработав подходящую пропорцию подачи, и все они могли самоорганизовываться в НЧ определенного размера. Во время самосборки полимеров ГПК гидрофобные лекарства, такие как митоксантрон, могут быть встроены в гидрофобный центр НЧ с образованием НЧ, нагруженных лекарством (рис. 8). Размер загруженных лекарством НЧ зависит от степени замещения полимера ГПК:чем выше степень замещения, тем меньше размер. Степень замещения полимеров также влияет на количество лекарства, загруженного в НЧ после самосборки. Когда соотношение полимера и лекарственного средства одинаково, чем выше степень замещения, тем больше лекарственная нагрузка [48]. Кроме того, соотношение полимера и лекарственного средства влияет на эффективность инкапсуляции и загрузку лекарственного средства. Только когда соотношение подачи находится в надлежащем диапазоне, загрузка лекарственного средства и эффективность инкапсуляции будут относительно высокими [31]. Высвобождение лекарственного средства НЧ напрямую влияет на их терапевтический эффект, который тесно связан с видами наноматериалов, поверхностным зарядом и гидрофобной группой НЧ, значением pH высвобождающей среды и адсорбцией белка сывороточного альбумина человека (HSA) in vivo. [49, 50]. Высвобождение лекарственного средства из нагруженных митоксантроном НЧ КГП показало медленное высвобождение. Высвобождение лекарственного средства НЧ КГП большого размера происходило быстрее, а НЧ в кислой среде - быстрее. Скорость высвобождения лекарства из наночастиц большего размера была более очевидной и быстрой.

Самосборка наночастиц (НЧ), нагруженных митоксантроном

Химиотерапия рака является основным способом лечения рака в настоящее время, но химиотерапевтические препараты не являются тканеспецифичными и токсичны для нормальных тканей, а некоторые вызывают большой ущерб иммунным клеткам, что вредит общему эффекту лечения [51, 52]. Наномедицина может пассивно воздействовать на раковые ткани посредством эффекта EPR, тем самым уменьшая отложение лекарства в тканях, не являющихся мишенями, и уменьшая токсичность и побочные эффекты. В этом исследовании мы использовали раковые клетки мочевого пузыря в качестве модельных раковых клеток, и мы обсуждаем влияние НЧ и размера НЧ на рак мочевого пузыря. Противоопухолевый эффект был сильнее у свободного митоксантрона, чем у НЧ ГПК; однако, если вводится весь препарат, митоксантрон не тканеспецифичен. Отложение и истощение тканей, а также токсичность и побочные эффекты, вызываемые этими лекарствами, не будут столь же эффективными, как лечение нанолекарствами. Следовательно, токсическое действие на раковые клетки и ингибирование миграции клеток было лучше при использовании свободного лекарства, чем нагруженных лекарством НЧ, что не указывает на то, что общий терапевтический эффект нанометров КГП не так хорош, как у свободного митоксантрона. Мы отмечаем влияние степени гидрофобного замещения на размер наноразмерных лекарств и влияние наноразмеров на загрузку лекарственного средства, высвобождение лекарственного средства, цитотоксичность и миграцию раковых клеток. После того, как НЧ пассивно нацелены на раковую ткань посредством эффекта ЭПР, терапевтическая эффективность НЧ, нагруженных лекарством, в основном определяется высвобождением лекарств в ткани и высвобождением НЧ в клетки (рис. 9). Терапевтический эффект НЧ КГП заключается в том, играет ли доминирующая роль его внеклеточное или внутриклеточное высвобождение. Судя по клеточным экспериментам, размер НЧ КГП оказывает сильное влияние:при большом размере лекарств выделяется больше, но количество лекарства такое же. Следовательно, терапевтический эффект КГП-НЧ может зависеть главным образом от высвобождения в ткани, а не от поглощения клетками.

Эффективность лечения нагруженных митоксантроном НЧ КГП главным образом за счет высвобождения локализации в опухолевой ткани

Многие классические НЧ используются в качестве носителей лекарств, а полученные нами НЧ КГП превосходят другие. Например, биогенетические НЧ (такие как экзосома, внеклеточные везикулы-миметики, модульные внеклеточные везикулы) трудно приготовить [53]. Целевое распределение обычных липосом не идеально, и его нестабильность все еще остается проблемой [54]. Неорганические НЧ, такие как НЧ с квантовыми точками, очень стабильны, но как инородные тела их биосовместимость плохая, что может вызывать побочные эффекты для человека [55]. ГПК НЧ легко приготовить, и мы можем контролировать их размер, контролируя степень гидрофобного замещения [48]. Поскольку они могут непосредственно разрушаться амилазой in vivo, они обладают хорошей биосовместимостью [56]. Кроме того, НЧ КГП обладают хорошей стабильностью и превосходными свойствами высвобождения лекарств [57]. Недостатком является то, что они неизбежно частично проглатываются мононуклеарной фагоцитарной системой [58]. Необходимы дополнительные исследования, чтобы уменьшить удаление системой и повысить эффективную концентрацию НЧ в крови.

Заключение

Размер загруженных митоксантроном НЧ КГП связан со степенью замещения холестерина в полимере. Чем выше степень замещения гидрофобности, тем меньше размер, выше нагрузка лекарственного средства и эффективность инкапсуляции, а также тем медленнее высвобождение лекарственного средства. В кислых условиях, чем выше кислотность, тем быстрее выделяются НЧ ГПК. Более того, высвобождение НЧ большего размера является лучшим, а НЧ большего размера могут ингибировать рост клеток мочевого пузыря и их миграцию лучше, чем НЧ меньшего размера. НЧ КГП убивают раковые клетки в основном за счет высвобождения наноразмерных лекарств за пределы клетки.