Оценка свойств доставки генов в антимикробные, апоптотические и раковые клетки для белковых наночастиц золота, синтезированных из съедобного микоризного гриба Tricholoma crassum

Фон

В связи с неизбежным и повсеместным применением наночастиц в сельском хозяйстве, медицине и бытовых товарах возрастает необходимость понимания вредного воздействия и способов его уменьшения [1]. Зеленый синтез наноматериалов с использованием живых организмов или их ферментов имеет то преимущество, что он экологичен, экономичен и безопасен для терапевтического использования [2]. Среди микробов нитчатые грибы обладают большей способностью синтезировать наночастицы из-за их способности секретировать большее количество ферментов [3, 4]. Внеклеточные наночастицы золота (AuNP) были произведены с использованием нескольких грибов [5,6,7], но лишь несколько упоминаний о естественных белковых оболочках поверх этих частиц в этих отчетах [8, 9].

В медицине с появлением бактерий с множественной лекарственной устойчивостью наночастицы стали альтернативным выбором, поскольку они не вызывают резистентности [10]. AuNP особенно перспективны для терапии и диагностики опухолевых клеток и доставки генов на основе наноносителей [11,12,13]. В физиологических условиях AuNPs демонстрируют низкую проницаемость через клеточную мембрану, но в опухолевых клетках захват увеличивается из-за усиленного эффекта проницаемости и удерживания (EPR) [14]. Это поглощение еще больше усиливается, когда AuNP блокируются белками. Белковый колпачок помогает стабилизировать наночастицы в коллоидном состоянии и обеспечивает места стыковки лекарств или генов для доставки [14]. Однако процесс укупорки предполагает дополнительные этапы. Обеспечение естественного протеинового колпачка исключает использование химических маршрутов, которые являются наиболее опасными [5]. Несмотря на его важность, имеется ограниченное количество сообщений о зеленом синтезе наночастиц благородных металлов с естественными белковыми оболочками [15, 16].

Перед применением AuNP в терапии важным аспектом, который необходимо проанализировать, является биосовместимость наноматериала с клеточными мембранами [6]. Другой аспект - цитотоксичность, и AuNP могут агрегировать эритроциты [13]. Следовательно, необходимо делать упор на опасные аспекты и использовать их в безопасных пределах [7, 17].

Наша лаборатория на сегодняшний день сообщила о единственных съедобных микоризных грибах, которые производят внеклеточные наночастицы серебра, грибок Tricholoma crassum (Берк.) Сакк [2]. Здесь мы описываем зеленый синтез AuNP из T. грубый размером 5–25 нм и различной формы. Они были охарактеризованы и проанализированы на антимикробную активность против бактерий, грибов, а также патогенных бактерий с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ). Они оказывали ингибирующее действие на кинетику роста бактерий и активность спор грибов. Что наиболее важно, частицы имеют естественное белковое покрытие. Мы протестировали эти частицы на их эффективность в качестве средства доставки генов в раковые клетки. Анализ гемолиза был проведен для проверки биосовместимости и токсичности этих частиц. Апоптотические свойства AuNP были протестированы с помощью кометных анализов на эукариотических клетках для оценки рабочей концентрации для терапевтического использования с минимальными побочными эффектами. Таким образом, в настоящей работе делается попытка оптимизировать синтез и применение AuNP в медицинских и нанотехнологических областях в безопасных пределах, чтобы нанести минимальный экологический и биологический ущерб.

Методы

Грибы, бактерии и условия роста растений

Tricholoma crassum (Берк.) Sacc. был использован для производства наночастиц. Для антимикробных анализов E. coli (DH5α), Agrobacterium tumefaciens (LBA4404), штаммы E. coli (DH5α) и A. tumefaciens (LBA4404). Патогенные грибы растений Magnaporthe oryzae и Alternaria solani были использованы. Саженцы томатов (сорт Pusa Ruby) и табака (сорт SR1) выращивали на почве в камерах для выращивания с фотопериодом свет / темнота 16:8 ч, 28 ± 1 ° C и интенсивностью света 50 мкмоль м ^{- 2} s ^{- 1} .

Синтез AuNP

Т. грубый мицелий культивировали в бульоне картофельной декстрозы (PDB) в течение 7 дней при 28 ° C. 1 г мицелиального мата перемешивали с 10 мл деионизированной воды на шейкере при 50 об / мин в течение 24, 48 и 72 часов при 28 ° C. Супернатанты фильтровали через фильтровальную бумагу Whatman No. 1. Клеточный фильтрат (pH 5,2) инкубировали с 1 мМ водным раствором хлораурата (HAuCl ₄ ) и перемешивали при 28 ° C в темноте в соответствии с нашим отчетом [2] в течение 1 часа для каждого типа клеточного фильтрата, полученного за 24, 48 и 72 часа инкубации с мицелием.

Для биосинтеза AuNP при различных значениях pH использовали 1 M HCl или 1 M NaOH для доведения pH бесклеточного фильтрата до кислого диапазона (3,5) и щелочного диапазона (7, 8 и 9) перед инкубацией. AuNP также были синтезированы с использованием различной температуры реакции (0, 15, 28, 75 и 100 ° C), различной концентрации бесклеточного фильтрата (× 0,5, × 1, × 2) и хлораурат-ионов (0,5, 1, 2 мМ. ).

УФ-видимая спектроскопия

Поглощение супернатантов из каждого клеточного фильтрата, инкубированного в течение 1 часа с раствором хлораурата, анализировали с помощью УФ-видимого спектрофотометра между 450 и 750 нм и использовали для построения спектров поглощения.

Сканирующая электронная микроскопия (SEM), просвечивающая электронная микроскопия (TEM), атомно-силовая микроскопия (AFM) и дифракция рентгеновских лучей (XRD)

Эти анализы были выполнены согласно Chowdhury et al. [15] с небольшими изменениями. Наночастицы золота, полученные с использованием 24-часового клеточного фильтрата с последующей 1-часовой инкубацией с 1 мМ HAuCl ₄ раствор при 28 ° C (pH 5,5) охарактеризовали с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM), просвечивающей электронной микроскопии (TEM), атомно-силовой микроскопии (AFM) и дифракции рентгеновских лучей (XRD). Тонкую пленку AuNP на стеклянном стержне сушили в вакууме и подвергали СЭМ с использованием FEI Quanta 200 (FEI, США).

Формы и размеры AuNP определялись методом просвечивающей электронной микроскопии. Каплю (10 мкл) суспензии AuNP помещали на покрытые углеродом медные сетки и подвергали вакуумной сушке перед загрузкой на держатель образца. ПЭМ-микрофотографии этих наночастиц были получены с использованием ПЭМ TECNAI G с низковольтной (100 кВ) конструкцией.

Для построения изображений методом АСМ AuNP наносили на свежесколотый лист мусковитовой слюды Ruby (Ruby Mica Co. Ltd., Индия) и сушили с использованием вакуумной сушилки. АСМ в режиме акустического переменного тока (AAC) выполняли с использованием АСМ Pico plus 5500 ILM (Agilent Technologies, США).

Для исследования XRD тонкую пленку суспензии AuNP равномерно распределяли на предметном стекле и сушили с помощью вакуумной сушилки. Картины XRD записывали в системе D8 Advance DAVINCI XRD (Bruker AXS Pvt. Ltd.), работающей при напряжении 40 кВ и токе 40 мА с излучением CuKα (λ =1,54060 / 1,54443 Å), и регистрировали дифрагированные интенсивности. от 35 ° до 80 ° по углам 2θ.

Анализ компьютерного программного обеспечения

Измерения AuNP и построение гистограммы проводились с использованием программного обеспечения OLYMPUS MEASURE IT tool. Концентрация наночастиц рассчитывалась согласно Sriram et al. [18] и в нашей предыдущей публикации Chowdhury et al. [15].

Трансформация бактерий для развития множественной лекарственной устойчивости

А. tumefaciens штамм LBA4404 и E. coli штамм DH5α приобрел множественную лекарственную устойчивость путем трансформации с использованием плазмид pCAMBIA2301 и pUC19 с pZPY112, соответственно, с использованием нашего опубликованного протокола [2, 15].

Антибактериальные анализы и анализы роста бактерий

Эти анализы были выполнены в соответствии с нашим опубликованным протоколом [15]. Наночастицы золота, которые были синтезированы с использованием 24-часового клеточного фильтрата и 1-часовой инкубации с 1 мМ HAuCl ₄ раствор при 28 ° C (pH 5,5), использовали для всех биологических анализов. Для анализов на бумажных дисках использовали возрастающие количества полидисперсных AuNP (0,249, 0,498, 0,747, 0,996, 1,245 мкг). Из свежих ночных культур каждого бактериального штамма аликвоту 25 мкл наносили на чашки с агаром LB. Серии разбавлений раствора наночастиц были составлены с использованием раствора AuNP с концентрацией 31,121 мг / л и стерильной деионизированной воды. Стерильные бумажные диски диаметром 5 мм с увеличивающимся количеством наночастиц золота в каждом диске, например 0,249, 0,498, 0,747, 0,996 и 1,245 мкг (в общем объеме 40 мкл), помещали на бактериальные планшеты и инкубировали. А. tumefaciens планшеты инкубировали при 28 ° C в течение 48 ч и E. coli при 37 ° C в течение 12 ч. Для анализа роста DH5α и LBA4404 к 7,5 мл бактериальной культуры добавляли 2,5 мл AuNP.

Противогрибковый анализ

Водная суспензия М. oryzae количество спор составляло 6,1 × 10 ⁵ спор / мл с помощью гемоцитометра. 150 мкл этой суспензии наносили на чашку MEA. Стерильные бумажные диски диаметром 5 мм с увеличивающимся количеством полидисперсных AuNP (0,249, 0,498, 0,747, 0,996 и 1,245 мкг) помещали на планшеты и инкубировали при 28 ° C. Зоны ингибирования измеряли через 2 дня.

Антимикробный анализ бактериальных клеток, обработанных AuNP

Жидкую культуру LBA4404 в течение ночи обрабатывали равным объемом суспензии AuNP (15,56 мг / л) в течение 12 ч при 28 ° C. 50 мкл суспензии смешивали с равным объемом 0,4% раствора трипанового синего (0,5 г трипанового синего, 500 мл глицерина, 450 мл дистиллированного H ₂ O, 50 мл HCl) наблюдали под сложным микроскопом (Leica DMLS, Германия).

Анализ прорастания спор грибов в присутствии AuNP

Была проведена серия разбавлений наночастиц с 20, 40, 60, 80 и 100% v / v используя основной раствор наночастиц с концентрацией 15,56 мг / л, доводя конечный объем до 100 мкл водой. Равные объемы этих суспензий добавляли к 50 мкл Alternaria solani . суспензия спор (4,2 × 10 ⁵ спор / мл) и инкубировали при 28 ° C. Споры наблюдали через 0, 2, 4 и 6 ч под сложным микроскопом (Leica DMLS, Германия).

Анализ комет

Апоптогенные свойства AuNP измеряли стандартным методом комет [19] с небольшими модификациями. Табак или листья томатов подвергались воздействию возрастающих концентраций (0, 15, 20 и 30% v / v для табака; 5, 10, 15 и 20% об. / Об. для томата) AuNP (15,56 мг / л бульона) в течение 24 ч. Электрофорез изолированных ядер проводили при 0,74 В / см (25 В, 300 мА) в течение 30 мин при 4 ° C. Срезы нейтрализовали 0,4 М трис-буфером, обезвоживали в метаноле, окрашивали бромидом этидия (20 мкг / мл) и наблюдали под флуоресцентным микроскопом с фильтром возбуждения 515–560 нм и барьерным фильтром 590 нм. Данные были проанализированы с помощью программного обеспечения Tritek CometScore.

SDS-PAGE

Белки выделяли согласно нашей публикации [15]. Для анализа белков, связанных с наночастицами, AuNP промывали стерильной водой, кипятили в буфере Лэммли в течение 10 минут и центрифугировали при 8000 об / мин в течение 10 минут. Образцы, обработанные SDS, и необработанные образцы обрабатывали на 12% SDS-PAGE.

Культура линии раковых клеток

Клеточная линия саркомы 180 культивировалась в среде RPMI 1640 [20], содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 200 Ед / мл пенициллина и 200 мкг / мл стрептомицина при 37 ° C, 5% CO ₂ в увлажненном инкубаторе.

Доставка комплекса плазмидной ДНК-AuNP в раковые клетки

Плазмиду выделяли из DH5α, содержащего pCAMBIA1302, по опубликованному протоколу [15]. Плазмида, содержащая конструкцию gfp Последовательность, клонированная под промотором pCaMV35s, была доставлена ​​в клетки саркомы 180 по стандартному протоколу [21]. Клетки просматривали под флуоресцентным микроскопом с использованием фильтра, специфичного для GFP (максимум возбуждения =395 нм) (Axioskop-40, Carl Zeiss). Клетки, обработанные «голой» плазмидной ДНК, оставили в качестве контроля.

Гемолитический анализ

Гемолитический анализ проводили по стандартному протоколу [22]. Равные объемы эритроцитов (1,6 × 10 ⁹ эритроцитов / мл) обрабатывали различными концентрациями AuNP (0,1, 0,5, 1, 5, 10 и 20 мкл / мл из исходного раствора 15,56 мг / л) в течение 1 ч и рассчитывали гемолитическую активность наночастиц при различных концентрациях.

Результаты и обсуждение

Биосинтез AuNP при pH 5,5

Во время синтеза на образование AuNP указывает изменение цвета клеточного фильтрата от светло-желтого до фиолетового [23] из-за изменения поверхностного плазмонного резонанса (SPR). 1 мМ HAuCl ₄ раствор без грибкового фильтрата был зеленовато-желтым (рис. 1a, «A»), а клеточный фильтрат T. грубый который был бледно-желтым (рис. 1а, «В»). После инкубации цвет смеси изменился на фиолетовый в течение 1 часа (рис. 1a, «C»), что указывает на образование AuNP.

Биосинтез AuNP с использованием Tricholoma crassum и спектроскопический анализ. а Изменение цвета во время реакции. А 20 мМ раствор HAuCl ₄ . Б Клеточный фильтрат без мицелия Tricholoma crassum . В 1 мМ HAuCl ₄ с 24-часовым клеточным фильтратом в течение 1 часа, показывающим фиолетовый цвет, указывающий на синтез AuNP. б УФ-видимые спектры AuNP, синтезированных с разными периодами инкубации (24, 48, 72 ч). Сплошная стрелка показывает пик поглощения при 552 нм за 24-часовой инкубационный период. Пунктирная стрелка показывает небольшое красное смещение максимумов поглощения с увеличением периода инкубации. c AuNPs, синтезированные при разном pH, показывают разные цвета. г УФ-видимые спектры то же самое. Сплошная стрелка показывает пик поглощения при 552 нм для pH 5,5, а пунктирная стрелка указывает на синий сдвиг максимумов поглощения с увеличением pH

Одним из недостатков других методов производства наночастиц из микроорганизмов является то, что они требуют много времени, а организмы вырабатывают токсины. Ранее Phanerochate chrysosporium Бесклеточный экстракт использовали для получения AuNP за 90 мин [3]. Недавно наночастицы серебра и золота были биосинтезированы с использованием Sporosarcina koreensis с использованием увеличенного времени реакции на 1-2 дня [24]. В нашем отчете время производства AuNP было сокращено до 1 часа.

Ультрафиолетовая и видимая спектроскопия

Спектры оптического поглощения металлических наночастиц определяются формой, агрегацией и SPR, которые смещаются в соответствии с размером и формой частиц [25, 26]. На рисунке 1b показаны УФ-видимые спектры AuNP, синтезированных с использованием клеточных фильтратов, полученных в течение 24, 48 и 72 часов с последующим 1 часом инкубации с 1 мМ HAuCl ₄ . раствор (pH 5,5). Здесь пик поглощения находится при 552 нм для фильтрата 24-часовой клетки. Полоса поперечного плазмонного резонанса, которая появляется сначала при 552 нм, слегка смещается в сторону красного от 24 до 48 и 72 часов (показана сплошной линией по сравнению с пунктирной линией на рис. 1b), подтверждая красное смещение с постепенно увеличивающейся интенсивностью поглощения. Уширение пиков указывает на полидисперсность частиц. Сильный SPR с центром около 550–560 нм характерно для коллоидного золота (рис. 1б). Поскольку концентрация клеточного фильтрата увеличивалась с увеличением периодов инкубации (т.е. 24, 48, 72 ч), поглощение также увеличивалось пропорционально. Когда реакцию проводили при 28 ° C, она достигала равновесия через 1 час и оставалась стабильной в течение 30 дней без признаков агрегации, вероятно, из-за стабилизирующей белковой оболочки. В предыдущих исследованиях AuNP, покрытые BSA, не показывали агрегации [27]. Дальнейшие исследования были проведены с использованием AuNP, приготовленных из 24-часового клеточного фильтрата.

Биосинтез AuNP при различных pH и УФ-видимая спектроскопия

AuNP были синтезированы при различных pH 3,5, 5,5, 7, 8 и 9, что привело к окраске от розового до темно-фиолетового (рис. 1c). УФ-видимая спектроскопия показала максимумы поглощения, а длина волны SPR увеличилась с pH 3,5 до pH 5,5, что привело к красному смещению. Однако при дальнейшем увеличении pH от 7 до pH 9 максимумы поглощения и длина волны SPR уменьшались, показывая синий сдвиг (рис. 1d). Пик при pH 9 имел меньшую амплитуду и неизменный цвет, что указывает на образование лишь небольших количеств AuNP. Поскольку это ферментативный биосинтез, pH 9, вероятно, ингибирует ферментативную реакцию, необходимую для образования AuNPs (Fig. 1d). Наночастицы, полученные при разных значениях pH, не агрегировались через 1 месяц при комнатной температуре.

Производство AuNP с использованием различных температур, концентраций субстрата и концентраций прекурсоров

Оптимизация физико-химических условий во время биосинтеза имеет решающее значение для создания функционально эффективных наночастиц [28]. Синтез с использованием более высоких концентраций фильтрата показал повышенную продукцию AuNP с большей интенсивностью окраски и максимумами поглощения (рис. 2a, b). Небольшой сдвиг в синий цвет максимального локализованного поверхностного плазмонного резонанса (LSPR) наблюдался для синтеза с фильтратом × 2, что указывает на увеличение расстояния между частицами и уменьшение размера кластера [29, 30].

Биосинтез и УФ-видимая спектроскопия AuNP из Tricholoma crassum с использованием различных параметров синтеза. а , b Различные концентрации клеточного фильтрата. c , d Различные концентрации HAuCl ₄ . е , f Различные температуры реакции. г , ч В темноте и при свете. Сплошная стрелка показывает типичный пик поглощения при 552 нм для клеточного фильтрата × 1 и 1 мМ HAuCl ₄ . при 28 ° C pH 5,5 и пунктирная стрелка указывает на синий сдвиг максимумов поглощения, пунктирная стрелка показывает красный сдвиг в полосе SPR

Из трех протестированных концентраций хлорида золота (0,5, 1 и 2 мМ) синтез был максимальным для 1 мМ с максимумом поглощения при 552 нм. (Рис. 2в, г). Оптимальной для синтеза оказалась температура 28 ° C. Более высокие температуры (75 и 100 ° C), хотя и опосредуют более быстрый синтез AuNP, темный цвет и красное смещение максимума поглощения (рис. 2e, f) указывают на более крупные частицы, чем при 28 ° C. При 0 и 15 ° C не было проявления цвета или пика поглощения в диапазоне 550–600 нм. Синтез на свету привел к темно-фиолетовой окраске (рис. 2g) и красному смещению максимума поглощения с широким пиком (рис. 2h), обозначающим более крупные частицы. Размер и количество частиц определяли с помощью DLS (рис. 3a – j). Это изменение размера и агрегации наночастиц зависит от природы и количества связанного органического вещества [30], которое также зависит от условий синтеза.

DLS показывает распределение синтезированных AuNP по размеру a с × 1 бесклеточным фильтратом, 1 мМ HAuCl4 при 28 ° C в темноте, b при свете, c с × 0,5 бесклеточного фильтрата, d с × 2 бесклеточным фильтратом, e при 0 ° C, f при 15 ° C, г при 75 ° C, ч при 100 ° C, я с 0,5 мМ HAuCl ₄ и j с 2 мМ HAuCl ₄

Сканирующая электронная микроскопия (SEM) и просвечивающая электронная микроскопия (TEM)

СЭМ показало AuNP небольшого размера и отчетливой геометрической формы при увеличении × 80000 (рис. 4а). ПЭМ-анализ четко показал полидисперсные AuNP размером от 2 до 22 нм (рис. 4б). График распределения по размерам показывает, что AuNP размером 5–10 нм имеют самую высокую частоту, за которой следуют 2–5 нм, 10–15 нм, 15–20 нм и 20–22 нм (рис. 4c). Они имели разные геометрические формы, такие как маленькие круглые или ромбовидные с диаметром 5 нм или меньше, шестиугольники, кубоиды, равнобедренные треугольники и почти равносторонние треугольники со сторонами от 4,36 до 22,94 нм (рис. 4d, e).

Электронная микроскопия AuNP. а СЭМ при увеличении 80 000 раз. б Просвечивающая электронная микроскопия, показывающая дисперсные частицы разного размера в микроскопическом поле. c Гистограмма, показывающая гранулометрический состав AuNP. Увеличенный вид отдельных AuNP, показывающий различные геометрические формы и их схематические изображения с размерами. г Шаровидная (слева) и ромбовидная (справа) небольшого размера. е Слева направо:шестиугольник, равносторонний треугольник, ромбовидный, многогранный и равнобедренный треугольник

Атомно-силовая микроскопия (АСМ)

На рис. 5а показано АСМ-изображение диспергированных AuNP. Двумерный вид (рис. 5а) показывает, что частицы имели примерно одинаковую толщину поверхности. Высота этих частиц была визуализирована с помощью одноповерхностной 3D АСМ (рис. 5b). АСМ 2D-график AuNP, лежащих в случайной линейной зоне (отмечен пунктирной линией, рис. 5c), показывает высоту в диапазоне от 1 до 4 нм. Полоса плоских поверхностных плазмонов указывает на то, что толщина частиц меньше длины кромки.

АСМ и рентгеновская дифракция AuNP. а Изображение АСМ:вид сверху. б Изображение AFM:трехмерное изображение. c АСМ-изображение AuNP и графический профиль высот наночастиц, лежащих на пунктирной линии в поле. г Рентгенограмма наночастиц с пиками, типичными для золота

Исследования дифракции рентгеновских лучей (XRD)

Рентгенограмма тонкой пленки частиц показала присутствие только AuNP. Сильный дифракционный пик при температуре около 38 ° обычно приписывается грани {111} гранецентрированной кубической (ГЦК) структуры [3]. На рентгенограмме здесь показан доминирующий дифракционный пик при 38,23, приписываемый структуре FCC. На остальных четырех гранях дифракционные пики были слабее. Четыре отчетливых брэгговских дифракционных пика при 38,23, 44,31, 64,60, 77,58 и 81,63 близко соответствуют пикам AuNP (рис. 5d, дополнительный файл 1:таблица S1).

Расчет концентрации AuNP

Концентрация наночастиц [15] составила 15,56 мг / л для частиц, полученных с 24-часовым клеточным фильтратом, инкубированным с 1 мМ HAuCl ₄ . .

Антимикробный анализ AuNP с использованием патогенных бактерий и грибов

AuNP проявляли сильную антимикробную активность против человеческих бактерий, а также патогенных бактерий и грибков растений. Антимикробную активность наночастиц определяли с использованием бумажных дисков с возрастающими количествами AuNP, т.е. 0,249, 0,498, 0,747, 0,996 и 1,245 мкг. Человеческие бактерии E. coli (DH5α), патогенные бактерии растений A. tumefaciens (LBA4404) и патогенный гриб растений M. oryzae были использованы. AuNP ингибировали все эти микроорганизмы даже при самых низких концентрациях, и зоны ингибирования увеличивались пропорционально увеличению концентрации частиц (рис. 6). На рис. 6a – c показано, что зоны ингибирования для E. coli (DH5α), А. tumefaciens (LBA4404) и M. oryzae , соответственно. На рис. 6f – h показан график зон ингибирования этих трех микробов в зависимости от количества используемых AuNP. Сам по себе грибковый экстракт не оказывал ингибирующего действия. Сравнительная тенденция ингибирования трех микробов указывает на больший ингибирующий эффект на DH5α по сравнению с LBA4404 и M. oryzae (Дополнительный файл 2:Рис. S1a).

Анализ антимикробных свойств AuNP на патогенных бактериях, грибах и бактериях с множественной лекарственной устойчивостью (MDR). а , f Планшеты и соответствующие графики, показывающие диско-диффузионный анализ наночастиц с увеличивающимися зонами ингибирования для E. coli . Зоны ингибирования, полученные в аналогичных анализах с b , г Agrobacterium tumefaciens . c , ч Magnaporthe oryzae . г , я MDR E. coli . е , j MDR А. tumefaciens . Все эксперименты проводились с увеличивающимся количеством AuNP на бумажных дисках; по часовой стрелке сверху:0,249 мкг (20%), 0,498 мкг (40%), 0,747 мкг (60%), 0,996 мкг (80%) и 1,245 мкг (100%) AuNP. Данные представляют собой средние значения ± стандартная ошибка трех повторов. Разные буквы указывают на статистически значимые различия между образцами ( P <0,05, тест HSD Тьюки). Влияние AuNP на кривую роста k Э. coli , l А. tumefaciens , м MDR E. coli , и n MDR А. tumefaciens . Звездочки указывают на существенные различия для контроля ( t Стьюдента тест, P <0,05). o Микроскопия контроля А. tumefaciens клетки. р А. tumefaciens демонстрирует потерю клеточной целостности после лечения AuNP

Анализ антимикробной активности AuNP с использованием патогенных бактерий человека и растений с множественной лекарственной устойчивостью

Были получены плазмиды с множественной лекарственной устойчивостью (MDR) DH5α и LBA4404 с генами устойчивости. MDR DH5α, несущий pUC19, был устойчив к 100 мкг / мл ампициллина и 35 мкг / мл хлорамфеникола. LBA4404, трансформированный pCAMBIA2301, был устойчив к 25 мкг / мл рифампицину и 50 мкг / мл канамицину. AuNP показали сильную ингибирующую активность против MDR DH5α и MDR LBA4404 (фиг. 6d, e). На рис. 6i, j представлены графики, показывающие усиление ингибирования с увеличением концентрации наночастиц. Сравнительная тенденция ингибирования для двух бактерий MDR указывает на большие зоны ингибирования для A. tumefaciens по сравнению с E.coli (Дополнительный файл 2:Рис. S1b).

Анализ роста бактерий с течением времени в присутствии AuNP

Кривая роста DH5α, обработанного AuNPs, значительно отличалась от контрольной группы (рис. 6k, m). В контрольных наборах DH5α и MDRDH5α логарифмическая фаза кривой роста начиналась в течение 2 часов после инокуляции, тогда как в обработанных AuNP DH5α и MDR DH5α рост не наблюдался в течение 6 часов после инокуляции. Кривые роста достигли стационарной фазы через 12 ч как в контрольных, так и в обработанных клетках, но рост был значительно снижен в случае обработанных бактерий. Кривая роста LBA4404 показала начало логарифмической фазы через 4 часа после инокуляции в контрольном наборе по сравнению с 6 часами в наборе, обработанном AuNP. Аналогичный эффект на кривую роста MDR LBA4404 наблюдался, хотя в контрольном MDR LBA4404 логарифмическая фаза начиналась в течение 2 часов (рис. 6l, n).

Влияние AuNP на морфологию и жизнеспособность бактериальных клеток

В целом, большинство наночастиц могут эффективно прилипать к клеточным мембранам, адсорбироваться и, как следствие, влиять на целостность клетки [31]. Нормальный А. tumefaciens бактерии имеют палочковидную форму с четкими очертаниями (рис. 6o). Бактерии при инкубации с AuNP показали искаженную морфологию, разрушение внешней мембраны, приводящее к неправильным очертаниям, и потерю целостности формы и размера клеток (рис. 6p). Это соответствует тому, что наблюдалось ранее в E. coli клетки, обработанные наночастицами кремнезема [32]. Мы обнаружили, что инкубация бактериальных клеток с наночастицами в течение более длительных периодов времени показала полный распад клеток.

Анализ прорастания спор грибов

AuNP были мощным подавителем вирулентности патогенного гриба растений Alternaria solani . Обработка грибковых конидий увеличивающимися дозами AuNP в разные периоды инкубации показала постепенное уменьшение частоты прорастания и длины зародышевых трубок (рис. 7a). Репрезентативные изображения конидий (рис. 7a) и графики показывают, что процент прорастания (рис. 7b) и средняя длина зародышевых трубок (рис. 7c), выходящих из грибковых конидий, уменьшались с увеличением доз частиц и увеличением инкубации. периоды. Таким образом, эти AuNP обладают значительными противогрибковыми свойствами, которые опосредуются подавлением прорастания спор и замедлением роста гиф.

Влияние AuNP на прорастание спор патогенного гриба растений Alternaria solani ; а Споры после обработки AuNP (полоса =30 мкм). Строки сверху вниз:контрольные споры, за которыми следуют споры, обработанные различными разведениями AuNP (15,56 мг / л исходный раствор). Столбцы слева направо:увеличение времени инкубации с AuNP, показывающее наименьшее прорастание через 6 часов инкубации со 100% AuNP. б Частота прорастания спор (%) при различных концентрациях AuNP в зависимости от времени инкубации. Звездочки указывают на существенные различия для контроля ( t Стьюдента тест, P <0,05). c Средняя длина зародышевой трубки при различных концентрациях AuNP в зависимости от времени инкубации. Данные представляют собой средние значения ± стандартная ошибка трех повторов. Разные буквы указывают на статистически значимые различия между образцами ( P <0,05, критерий множественного диапазона Дункана). Частота прорастания спор и средняя длина зародышевой трубки уменьшались с увеличением доз AuNP и увеличением периода инкубации

Таким образом, эти AuNP обладают антимикробной функцией как в отношении бактерий, так и грибов, что редко встречается в отношении AuNP. Эти AuNP, являющиеся токсичными для бактерий человека с множественной лекарственной устойчивостью, могут быть использованы для лечения заболеваний человека, связанных с МЛУ или бактериями с широкой лекарственной устойчивостью (ШЛУ), которые трудно лечить. Кроме того, антимикробный эффект против типичных фитопатогенов, таких как Agrobacterium и грибов, он делает частицы пригодными для использования в качестве бактериоцидов и фунгицидов в форме нано-агрохимикатов. Это позволит обеспечить устойчивое управление потерей урожая за счет исключения чрезмерного и неизбирательного использования агрохимикатов, вызывающих ухудшение здоровья почвы, деградацию агроэкосистемы, загрязнение окружающей среды и устойчивость патогенов [33].

AuNP обладают мощными апоптогенными свойствами

Одноячеечный гель-электрофоретический анализ или анализ комет является чувствительным методом для сравнения апоптоидных эффектов материалов [34, 35]. Обработка клеток табачного листа 7,78 мг / л AuNP в течение 15, 20 и 30 мин приводила к постепенному увеличению апоптоза, на что указывало увеличение процента ДНК в хвосте (рис. 8a, «A», «B»). , 'КОМПАКТ ДИСК'). Максимальная миграция ДНК произошла через 30 мин обработки, показав значение хвостовой ДНК 28,44 ± 0,74%, что было значительно выше, чем у необработанных контрольных клеток (1,7 ± 0,59%). Инкубационные периоды 15 и 20 минут вызвали меньшую миграцию ДНК со значениями хвостовой ДНК 7,25 ± 2,56 и 19,19 ± 1,54% соответственно (рис. 8b). Следовательно, эти AuNP обладают способностью вызывать апоптоз в эукариотических клетках в более высоких дозах. В последнее время наночастицы используются в новых стратегиях нацеливания и уничтожения раковых клеток. Как показано на динамической и количественной визуализации, успешное применение наночастиц в качестве альтернативной терапии рака зависит от апоптотических свойств частиц [36]. Таким образом, настоящие открытия демонстрируют мощные апоптогенные свойства этих AuNP, которые обещают будущую терапию рака.

Анализ апоптотических свойств AuNP. а Кометный анализ и флуоресцентные микроскопические изображения ядер листьев табака, обработанных AuNP для A 0 мин. Б 15 мин, C 20 мин. И D 30 мин (полоса =5 мкм). В контрольных наборах (инкубация 0 мин) большая часть ДНК расположена в голове кометы, в то время как клетки, подвергшиеся более длительной обработке, демонстрируют увеличивающееся повреждение ДНК и более длинные хвосты кометы. б Среднее значение% хвостовой ДНК ± стандартная ошибка после различных периодов инкубации. Данные представляют собой средние значения ± стандартная ошибка трех повторов. Разные буквы указывают на статистически значимые различия между образцами ( P <0,05, тест HSD Тьюки). c Анализ пороговой дозировки AuNP для апоптоза, показывающий изображения ядер клеток листьев томата, обработанных A 0% (контроль), B 5%, C 10%, D 15%, E 20% суспензии AuNP в течение 24 ч (столбик =10 мкм). г Средний% хвостовой ДНК ± стандартная ошибка после 24-часовой обработки различной концентрацией AuNP. Данные представляют собой средние значения ± стандартная ошибка трех повторов. Разные буквы указывают на статистически значимые различия между образцами ( P <0,05, тест HSD Тьюки). Дозировка ниже 10% указывает на незначительное повреждение ДНК, а более 20% указывает на начало повреждения ДНК.

Эти AuNP не являются апоптогенными при более низких дозах

Для безопасного применения металлических наночастиц в качестве терапевтического средства необходимо предварительное определение биологического действия частиц при пограничной токсичности [37]. Пороговый уровень наночастиц, необходимый для апоптоза, был получен путем обработки клеток листьев томата различной концентрацией AuNP в течение 24 часов (рис. 8c). Низкая концентрация, например, 5% v / v исходной суспензии AuNP (15,56 мг / л) не оказывал значительного апоптогенного действия на клетки томата даже после 24 часов воздействия. Ядра после обработки 10% AuNP показали 6,52 ± 0,63 процента ДНК в хвосте, что было выше, чем необработанные контрольные ядра (0,95 ± 0,66 процента ДНК в хвосте) и ядра, обработанные 5% суспензией AuNP (1,04 ± 0,89 процента ДНК в хвосте). ). Обработка клеток листьев томата 15 и 20% AuNP привела к небольшому увеличению повреждений ДНК, показав 7,15 ± 1,70 и 13,47 ± 2,16 процента ДНК в хвосте, показывая значительный апоптогенный эффект (фиг. 8d). Таким образом, в более низких дозах апоптогенный эффект незначителен, что свидетельствует о возможности использования этих наночастиц в качестве противомикробного агента или средства доставки лекарства / гена в эукариотических клетках.

AuNP покрыты белком

В нескольких предыдущих исследованиях упоминались наночастицы, покрытые белком природного происхождения [15]. ПЭМ при меньшем увеличении показала, что AuNP окружены белковоподобным материалом (рис. 9a, b). Чтобы подтвердить природу материала, AuNP промывали и запускали на SDS-PAGE вместе с бесклеточными экстрактами на других дорожках (фиг. 9c). Кипячение в SDS служило для отделения поверхностно-связанных белков от наночастиц. Кипяченные наночастицы (дорожка 4) показали присутствие одной интенсивной полосы 40 кДа, которая была подобна полосе белка, присутствующей на дорожке 2 (клеточный фильтрат). Однако в образце, который не кипятили (дорожка 3), слабая полоса белка, связанного с AuNP, была видна на уровне 116 кДа. Хотя еще одна слабая полоса действительно появилась на уровне 40 кДа из-за диссоциации покрывающих белков от частиц. Известно, что белковые оболочки способствуют стабильности наночастиц в растворе и их каталитической активности [28, 38]. Естественно сформированная белковая оболочка вокруг наночастиц делает их функционально эффективными для биомедицинского использования, включая легкую адсорбцию и доставку ДНК или гидрофобных лекарств [39]. Пептиды и доставка AuNP с помощью белков успешно используются для преодоления гематоэнцефалического барьера при лечении заболеваний центральной нервной системы [14]. Следовательно, эти биосовместимые AuNP могут быть потенциально подходящими для нескольких биомедицинских приложений из-за небольшого размера, уникальных физико-химических свойств и других преимуществ.

Анализ протеиновой шапки. а , b ПЭМ-изображения, показывающие покрывающий белковый слой (стрелки) вокруг AuNP. c SDS-PAGE внеклеточного белка, секретируемого T. грубый и белок, связанный с наночастицами. Дорожка 1, маркер молекулярного размера. Дорожка 2, общий внеклеточный белок. Дорожка 3, наночастицы, загруженные без кипячения, показывают слабую полосу белка, связанную с AuNP, на отметке 116 кДа. Также имеется полоса отсоединенного белка на отметке 40 кДа. Дорожка 4, наночастицы после кипячения с 1% загрузочным буфером SDS, демонстрирующие исчезновение полосы 116 кДа и отдельной полосы 40 кДа. Стрелка указывает 40 кДа

AuNP могут доставлять ген зеленого флуоресцентного белка (GFP) в линии раковых клеток саркомы 180

Плазмидная ДНК pCAMBIA1302, несущая gfp Маркерный ген в комплексе с AuNPs был использован для лечения клеток саркомы 180. Клетки производили зеленую флуоресценцию, указывающую на поглощение комплекса плазмидной ДНК / AuNP и последующую экспрессию гена в раковой клетке, тогда как клетки, обработанные только голой плазмидной ДНК, не проявляли флуоресценции (фиг. 10a, b). Это подтверждает высокий потенциал этих частиц не только доставлять гены в раковые клетки, гены стабильно экспрессируются и остаются функциональными после доставки в клетки.

Доставка генов с использованием AuNP в раковые клетки саркомы 180 и анализ гемолиза с человеческими эритроцитами; флуоресцентное микроскопическое изображение a раковые клетки, экспрессирующие белок зеленой флуоресценции после поглощения комплекса ДНК-AuNP и b контрольные клетки, обработанные свободной плазмидной ДНК (столбцы =20 мкм). c Процент гемолиза с разными разведениями AuNP. Данные представляют собой средние значения ± стандартная ошибка трех повторов. Разные буквы указывают на статистически значимые различия между образцами ( P <0,05, тест HSD Тьюки)

Ранее было показано, что металлические наночастицы обладают огромным терапевтическим потенциалом при лечении различных заболеваний, таких как неоваскуляризация сетчатки, ВИЧ, лимфома Дальтона, и проявляют активность против вируса гепатита, респираторно-синцитиального вируса и вируса простого герпеса [18]. В соответствии с этими отчетами, доставка лекарств на основе золотых наноносителей в настоящем исследовании с использованием AuNP может рассматриваться как перспективный посредник во многих медицинских приложениях, включая диагностику, доставку лекарств и лечение рака.

Совместимость AuNP с эритроцитами человека и анализ токсичности

Эритроциты представляют собой простую и удобную модель клеточной мембранной системы и используются для изучения взаимодействий наночастиц с мембраной [40]. Гемолитический анализ выявляет мембранолитическую активность AuNP при различных концентрациях. Рисунок 10c показывает, что мембранолитическая активность наночастиц была незначительной при низких концентрациях. Наивысшая гемолитическая активность, обнаруженная при более высоких концентрациях суспензии наночастиц (до 20 мкл / мл), составила менее 8%, что указывает на очень низкую токсичность для крови. Постепенно возрастающая гемолитическая активность с увеличением концентрации AuNP, вероятно, связана с повышенным сродством и адгезией большего количества частиц с эритроцитами. Ожидается, что это сродство частиц к клеточным мембранам облегчит их клеточный транспорт. Низкая гемолитическая активность наряду с эффективным клеточным захватом делает наночастицы очень подходящими для разработки безопасных и эффективных тераностических агентов [41].

Выводы

Использование съедобного микоризного гриба для синтеза AuNP различной геометрической формы за короткое время реакции с естественной белковой оболочкой делает этот метод простым и уникальным. Белковая оболочка съедобного гриба не оказывала заметных токсических эффектов и способствовала легкому прикреплению ДНК к поверхности частиц. В целом, эти AuNP являются многообещающими антимикробными агентами для апоптоза для доставки генов в раковые клетки.

Поскольку мицелиальные грибы могут выдерживать давление потока или волнение [15], T. грубый могут культивироваться в ферментерах для производства AuNP в крупном масштабе с использованием нетоксичных сельскохозяйственных отходов, что позволяет легко извлекать продукт и варианты пополнения системы [2]. Поскольку AuNP имеют разные геометрические формы, существует широкий ассортимент на основе формы с механическими средствами, такими как центрифугирование [42], и их можно использовать в соответствии с их особыми свойствами на основе формы.