Генерация активных форм кислорода в водных растворах, содержащих наночастицы GdVO4:Eu3 + и их комплексы с метиленовым синим

Фон

Лучевая терапия (ЛТ) остается важным компонентом лечения рака:примерно 50% всех онкологических больных получают ЛТ в течение их болезни [1,2,3]. Точный механизм гибели клеток из-за радиации все еще является областью активных исследований. Двухцепочечные разрывы ядерной ДНК считаются наиболее важным клеточным эффектом радиации, ведущим к необратимой потере репродуктивной целостности клетки и, в конечном итоге, к гибели клетки [4]. Такое радиационное повреждение может быть вызвано (i) прямой ионизацией и (ii) непрямой ионизацией посредством свободных радикалов и активных форм кислорода (ROS), химически активных форм, содержащих кислород, образованных в результате радиолиза клеточной воды и молекул кислорода [2,3, 4]. В клинической терапии повреждение обычно носит косвенный характер. При этом вода теряет электрон и становится очень реактивной. Затем посредством трехступенчатой ​​цепной реакции вода последовательно превращается в ряд радикалов и молекулярных продуктов:гидратированные электроны (\ ({e} _ {aq} ^ {-} \ Big) \), атом водорода ( H ^∙ ), гидроксильный радикал OH ·, гидропероксильный радикал (\ ({HO} _2 ^ {.} \ Big) \), пероксид водорода (H ₂ О ₂ ) и молекулы водорода (H ₂ ) [5, 6]. Гидратированные электроны и атомы водорода - сильные восстановители. Напротив, гидроксильные радикалы являются очень сильными окислительными формами и немедленно удаляют электроны из любой молекулы на своем пути, превращая эту молекулу в свободный радикал и тем самым распространяя цепную реакцию [5]. Когда растворенный молекулярный кислород присутствует в облученной воде, его восстановление дает супероксидный радикал (\ ({O} _2 ^ {.-} \)) и является предшественником большинства других АФК, включая синглетный кислород ( ¹ О ₂ ) [7].

Недавно было показано, что наночастицы (НЧ) с высоким атомным номером (на основе Au, Ag, Hf, Gd, Ti) [8,9,10,11], полупроводниковые НЧ (оксид металла TiO ₂ ZnO, CuO, CeO ₂ , Al ₂ О ₃ ; квантовые точки ZnS, ZnS, LaF ₃ и др.) [8, 12,13,14], а некоторые неорганические НЧ (углеродные нанотрубки) [15, 16] повышают эффективность ОТ. Теоретические основы взаимодействия рентгеновских лучей с НЧ хорошо описаны [8, 12, 14]. Каскадное взаимодействие фотонов высоких энергий с решеткой НЧ происходит, главным образом, за счет фотоэлектрического эффекта и эффекта комптоновского рассеяния. Комптоновские, фото- или оже-электроны могут вызывать эмиссию вторичных электронов, которые могут уйти в окружающую среду и будут захвачены акцептором (т.е. водой, биомолекулами, кислородом, оксидами азота), локализованным вблизи поверхности НЧ, и индуцировать биомолекулярные радикалы и продукция АФК [8, 12, 14]. Радиосенсибилизирующие эффекты НЧ связаны с биомолекулярными радикалами и генерацией АФК как завершающей стадией взаимодействия рентгеновских лучей с НЧ. В полупроводниковых НЧ, таких как НЧ оксидов металлов, цитотоксический эффект, связанный с генерацией АФК, также может быть вызван УФ-облучением [17,18,19,20]. Механизм заключается в том, что, когда НЧ облучают УФ-светом (энергия превышает ширину запрещенной зоны), индуцируется разделение зарядов с образованием дырки (h ⁺ ) в валансной полосе и электрон (e ^- ) в дирижирующем диапазоне. Электроны и дырки обладают высокой восстанавливающей и окислительной способностями соответственно [18]. Электроны могут реагировать с молекулярным кислородом с образованием супероксидного радикала (\ ({O} _2 ^ {\ cdotp -} \)) посредством процесса восстановления, тогда как дырки могут отрывать электроны от воды и / или гидроксильных ионов, генерируя гидроксильные радикалы (OH ·) Посредством окислительного процесса [18,19,20]. Для TiO ₂ , Главный исполнительный директор ₂ , Al ₂ О ₃ , и наночастицы ZnO, ¹ О ₂ о генерации путем окисления \ ({O} _2 ^ {\ cdotp -} \) сообщалось [18, 21, 22].

Еще один подход к повышению эффективности лечения рака (фотодинамическая терапия, ФДТ) с использованием сцинтилляционных НЧ был предложен Ченом и Жангом [23]. Этот подход объединяет возбужденные рентгеновскими лучами (сцинтилляционные) НЧ и молекулы фотосенсибилизатора (ФС). Сцинтилляционные НЧ служат в качестве преобразователя энергии, передающего энергию, собранную в результате рентгеновского облучения, на ПС, который генерирует синглетный кислород для разрушения опухоли. Такой подход позволяет проводить глубокое лечение рака и улучшает как ФДТ, так и лучевую терапию. К настоящему времени в качестве фотодинамических агентов, индуцируемых рентгеновскими лучами, были изучены различные сцинтилляционные НЧ и их комплексы с ФС [12, 14, 23,24,25,26,27,28].

Недавно мы сообщили о создании комплексов на основе сцинтилляционных НЧ ортованадата гадолиния, допированных ионами европия GdVO ₄ :Eu ³⁺ (ВНЧ) и фотосенсибилизатора метиленового синего (МБ) и изучение переноса энергии электронного возбуждения в комплексах [29]. Показано, что благодаря эффективному преобразованию энергии возбуждения в комплексах они могут быть перспективными в качестве индуцируемого рентгеновским излучением фотодинамического агента. Целью данной работы было изучение эффективности генерации АФК в водных растворах, содержащих ВНЧ и их комплексы с МБ, при УФ и рентгеновском облучении.

Экспериментальный

Химические вещества

Гадолиния хлорид GdCl ₃ · 6H ₂ O (99,9%), хлорид европия EuCl ₃ · 6H ₂ O (99,9%), динатрий EDTA · 2Na (99,8%) и безводный метаванадат натрия NaVO ₃ (96%) были получены от Acros organic (США) и все использовались без дополнительной очистки. Гидроксид натрия NaOH (99%) закуплен у «Макрохим» (Украина). Ортованадат натрия Na ₃ ВО ₄ раствор получали добавлением 1 М раствора NaOH в водный раствор NaVO ₃ до pH =13. L-a-фосфатидилхолин (PC) из яичного желтка, катионный краситель 3,7-бис (диметиламино) феназатионий хлорид (метиленовый синий (MB), M _w =373,90 г / моль), 1,2-бензопирон (кумарин, M _w =146,14 г / моль) были приобретены у Sigma-Aldrich (США) и использовались в том виде, в котором они были получены. Динатриевая соль антрацен-9,10-дипропионовой кислоты (ADPA, M _w =366,32 г / моль) получали из коллекции красителей доктора Игоря Борового (Институт сцинтилляционных материалов НАН Украины) с чистотой, контролируемой методом тонкослойной хроматографии. Все остальные химические вещества были аналитической чистоты.

Синтез GdVO ₄ :Eu ³⁺ коллоидные растворы

Водные коллоидные растворы наночастиц ортованадата гадолиния, легированные ионами европия Gd _0,9 Eu _0,1 ВО ₄ (GdVO ₄ :Eu ³⁺ ) были синтезированы по методике, описанной ранее [30]. Сначала 0,4 мл водного раствора хлорида гадолиния (1 M) смешивали с 0,05 мл хлорида европия (1 M), затем к смеси добавляли 49,55 мл бидистиллированной воды. Затем полученный раствор смешивали с 37,5 мл раствора динатрия ЭДТА (0,01 М). Затем 37,5 мл Na ₃ ВО ₄ (0,01 М) по каплям (рН =10,5). Смесь интенсивно перемешивали с помощью магнитной мешалки и нагревали на водяной бане с обратным холодильником в течение 24 ч при 100 ° С. Полученный бесцветный прозрачный раствор рассеивает свет при боковой засветке (конус Тиндаля). Затем раствор охлаждали и диализовали против воды в течение 24 ч для удаления избытка ионов. Для этого полученный раствор промывали в диализном мешке (Cellu Sep T2, мембрана с отсечкой по молекулярной массе 12 кДа, размер пор ~ 2,5 нм) и помещали в 2-литровый стакан с дистиллированной водой. Через каждые 6 ч воду обновляли.

Инструменты и характеристика

Синтезированные ВНЧ охарактеризованы с помощью просвечивающей электронной микроскопии (электронный микроскоп ТЕМ-125 К, Selmi, Украина) и метода динамического светорассеяния (анализатор ZetaPALS, Brookhaven Instruments Corp., США). Спектры поглощения измеряли на спектрометре Specord 200 (Analytik Jena, США). Спектры флуоресценции и возбуждения флуоресценции снимали на спектрофлуориметре Lumina (Thermo Scientific, США).

Приготовление комплексов ВНП – МБ

Решения для исследований готовились следующим образом. Сначала готовили исходные растворы МБ в воде (1 ммоль / л). Для получения водных растворов ВНЧ – МБ в колбу добавляли необходимое количество исходного раствора красителя и водного раствора ВНЧ и тщательно перемешивали на роторном испарителе (Rotavapor R-3, Buchi) в течение 1 ч до полного испарения хлороформа. Затем в колбу добавляли 1 мл водного раствора VNPs и осторожно встряхивали в течение 1 ч для образования комплекса VNPs – MB. Концентрация МБ в полученном растворе составляла 10 мкмоль / л. Концентрация наночастиц составляла 0,1, 1 или 10 мг / мл.

Обнаружение активного кислорода и свободных радикалов

Образование АФК при УФ / рентгеновском облучении водных растворов, содержащих ВНП, МБ или комплексы ВНП-МБ, было обнаружено спектроскопически с использованием нескольких методов.

Тест образования конъюгированных диенов

Окисление липидов при УФ-облучении измеряли с помощью суспензии липосом ПК. Однослойные липидные везикулы ПК получали методом экструзии [31]. Вкратце, соответствующее количество PC (25 мг / мл) в хлороформе помещали в колбу и сушили до полного испарения хлороформа с использованием роторного испарителя (Rotavapor R-3, Buchi). Затем тонкую пленку липидных красителей гидратировали 10,8 мл бидистиллированной воды. Полученную липидную суспензию окончательно экструдировали через поликарбонатный фильтр с размером пор 100 нм с использованием мини-экструдера (Avanti Polar Lipids, Inc., США). Концентрация ПК составляла 1,2 ммоль / л. Для теста образования конъюгированных диенов 1 мл суспензии липосом ПК смешивали с 1 мл водного раствора ВНП (водный раствор МБ или водный раствор ВНП – МБ). Конечная концентрация МБ составляла 10 мкмоль / л, а VNP - 1 г / л. Концентрация ПК в растворах составляла 0,6 ммоль / л. Полученные водные растворы помещали в кварцевые кюветы (10 × 10 мм) и облучали ртутной лампой 250 Вт (полоса пропускания l =310–400 нм, световой поток 43 Вт / см ² ) в течение 30 мин. Затем абсорбцию суспензий регистрировали при 234 нм (максимум конъюгированных диенов) на спектрофотометре Specord 200 (Analytik Jena, Германия). За контроль принимали концентрацию конъюгированных диенов, образующихся в воде без добавок (НЧ, МБ или комплексов ВНП – МБ). Каждая экспериментальная точка представляла собой среднее значение по крайней мере трех независимых тестов. Статистическая обработка проводилась с использованием пакета программ Statistika v. 5.0 (StatSoft, США).

OH · обнаружение радикалов

Для обнаружения образования гидроксильных радикалов в растворе при УФ-облучении в качестве молекулы зонда использовали кумарин. Кумарин реагирует с радикалами ОН · с образованием высокофлуоресцентного 7-гидроксикумарина [32, 33]. Методика эксперимента была следующей. Водный раствор кумарина (0,1 ммоль / л) смешивали с водными растворами МБ (10 мкмоль / л), ВНЧ (0,1, 1 или 10 г / л) или ВНП – МБ. Полученные водные растворы помещали в кварцевые кюветы (10 × 10 мм) и облучали He-Cd лазером λ _exc =325 нм в течение 1 ч. При рентгеновском облучении кювету облучали сверху (с открытой части) рентгеновским излучением на аппарате ISOVOLT 160 Titan E с вольфрамовым катодом в течение 30 мин. Напряжение на трубке составляло 30 кВ (20 мА). Расстояние от рентгеновской трубки до облучаемых образцов составляло 25 см. Спектры флуоресценции (возбужденных на 325 нм) растворов регистрировали на спектрофлуориметре Lumina (Thermo Scientific, США). Была проанализирована относительная интенсивность флуоресценции 7-гидроксикумарина.

Обнаружение синглетного кислорода

¹ О ₂ Продукцию в растворах, содержащих ВНП, МБ или комплексы ВНП – МБ, анализировали при оценке спектров флуоресценции АДФК [34, 35]. Измерения проводились в кварцевых кюветах (10 × 10 мм). Водный раствор АДФК (10 мкмоль / л) смешивали с водными растворами МБ (10 мкмоль / л), НЧ (1 г / л) или ВНП – МБ в кюветах. Растворы облучали при 457 нм с использованием синего твердотельного лазера высокой стабильности MBL-457, 50 мВт (Changchun New Industries Optoelectronics Tech. Co., Ltd.). Флуоресцентное излучение АДФК, возбужденное на длине волны 378 нм, собирали в различных временных масштабах (0, 10, 20, 30, 40 и 60 мин) с использованием спектрофлуориметра Lumina (Thermo Scientific, США).

Результаты и обсуждения

Характеристика синтезированных VNP

Рисунок 1a и Дополнительный файл 1:Рисунок S1 показывает ТЕМ-изображения синтезированных VNP с гистограммой бокового распределения и рентгенограммой, которые поддерживают GdVO ₄ :Eu ³⁺ Кристаллическая структура НЧ. Синтезированный GdVO ₄ :Eu ³⁺ НЧ имеют веретеновидную форму с размером 8 × 25 ± 5 нм и тетрагональной фазовой структурой типа циркона. Отрицательный заряд поверхности НЧ (ζ-потенциал - 18,75 ± 0,15 мВ, pH =7,8) обусловлен карбоксилатными группами динатриевого стабилизатора ЭДТА, использованного в процессе синтеза. Превышение гидродинамического диаметра ГдВО ₄ :Eu ³⁺ наночастиц 44,0 ± 0,3 нм. Спектр поглощения GdVO ₄ :Eu ³⁺ НЧ представляют собой интенсивную широкую полосу в спектральном диапазоне 250–350 нм, которая соответствует переносу заряда от кислородных лигандов к атому ванадия в группе \ ({VO} _4 ^ {3-} \) (рис. 1b) [36] ]. Допинг ГдВО ₄ НП с Eu ³⁺ ионы придают VNP сильную флуоресценцию в красном спектральном диапазоне, который определяется переходом внутри f-электронной конфигурации ионов европия [37] (не будет обсуждаться в этой статье).

Изображение TEM ( a ), спектр поглощения ( b ) и энергетической зависимости ( αhv ) ² ( c ) ГдВО ₄ :Eu ³⁺ наночастицы

Известно, что размер НЧ влияет на оптическую запрещенную зону в полупроводниковых материалах. Энергия запрещенной зоны, E _г , можно оценить по длине волны края поглощения межзонного перехода в соответствии с соотношением Таука [38]:

где a - коэффициент поглощения, hv - энергия падающего фотона, A - не зависящая от энергии константа (параметр хвоста зоны), а n - константа (коэффициент мощности переходного режима), которая зависит от природы материала (кристаллический или аморфный). Значение n обозначает характер перехода, n =1/2 для прямых разрешенных переходов, n =3/2 для прямых запрещенных переходов, n =2 для непрямых разрешенных переходов и n =3 для непрямого запрещенного перехода [39]. GdVO ₄ является прямозонным полупроводником, для которого n =1/2 [40] Таким образом, уравнение. (1) можно переписать как:

Коэффициент поглощения ( a ) рассчитывается по оптической плотности как a =2,303 D / l , где D абсорбция и l - длина оптического пути.

На рисунке 1c представлена ​​энергетическая зависимость ( a hv) ² для синтезированного GdVO ₄ :Eu ³⁺ наночастицы. Значение ширины запрещенной зоны E _г был определен путем экстраполяции линейной части ( a hv) ² кривая зависимости энергии фотона hv до нуля. Полученное значение E _г =4,13 эВ выше, чем указано для GdVO ₄ :Eu ³⁺ порошки с размером кристаллитов от 14,4 до 43 нм (3,56–3,72 эВ) [41, 42]. Мы предполагаем, что это могло быть связано с различием в используемых методах синтеза, которые в нашем случае дают более мелкие наночастицы с узкой полосой поглощения, смещенной в синий цвет, по сравнению с полосой поглощения, полученной гидротермальными методами или методами Печини.

Фотоиндуцированное образование свободных радикалов (тест с конъюгированными диенами)

Принято считать, что древовидные типы ROS (\ (\ mathrm {OH} \ cdotp, {\ mathrm {O}} _ 2 ^ {\ cdotp -} \) и ¹ О ₂ ), образующиеся в системах НЧ при УФ-облучении, вносят свой вклад в основной окислительный стресс в биологических системах [43, 44]. Хотя фотокаталитическая активность таких металлооксидных НЧ, как TiO ₂ , ZnO, CuO, CeO ₂ , Al ₂ О ₃ , и Fe ₂ О ₃ хорошо описан [17,18,19,20], мало исследований изучали фотокаталитическую активность ReVO ₄ НП [45,46,47,48]. Было показано, что ReVO ₄ НЧ эффективны при фотокаталитическом разрушении органических загрязнителей. Однако ни одно исследование не изучало типы ROS, генерируемые ReVO ₄ НЧ под УФ-облучением.

Чтобы имитировать биологическую среду, мы использовали суспензию липосом ПК и обнаружили образование свободных радикалов при УФ-облучении в суспензиях, содержащих MB, VNPs или VNPs – MB комплексы при окислении липидов (тест образования конъюгированных диенов) [49,50,51]. Окисление липидов молекулярным кислородом через цепные радикальные реакции может быть инициировано ионизирующим излучением, когда в системе появляются АФК и свободные радикалы [43, 44]. Радикальные цепные реакции с участием полиненасыщенных жирных кислот вызывают перегруппировку двойных связей, приводящую к конъюгированным диенам. Полученные сопряженные диены демонстрируют полосу поглощения при 234 нм, которая может быть обнаружена фотометрически. На рис. 2 показаны относительные концентрации конъюгированных диенов, образующихся в липидных суспензиях, содержащих MB, VNPs или комплексы VNPs – MB. Видно, что во всех растворах концентрация конъюгированных диенов увеличивается по сравнению с суспензией чистых липосом ПК. Однако эффективность этого процесса разная. Метиленовый синий - одна из обычных молекул фотосенсибилизатора с основными максимумами поглощения λ _макс =665 нм и менее интенсивная полоса поглощения в УФ-диапазоне спектра (дополнительный файл 1:Рисунок S2). При УФ-облучении МБ могут происходить два основных фотохимических процесса [34, 52]. МБ, возбужденная УФ-светом, подвергается межсистемному процессу пересечения ( Q _p =0,54 [53]) в долгоживущее триплетное состояние ( ³ МБ ^* ) и вступает в реакцию с молекулами кислорода ( ³ О ₂ ) с образованием синглетного кислорода ( ¹ О ₂ ):

Относительная эффективность образования сопряженных диенов в липидных суспензиях:1 - без добавок; 2 - с МБ; 3 - с ВНП; 4 - с комплексами ВНПс-МБ

Второй фотохимический процесс может происходить при высоких концентрациях МБ. Молекулы MB в основном состоянии могут работать как восстановители, отдавая электрон триплету MB и образуя полу-восстановленный радикал (MB ·) и полувосстановленный радикал, соответственно (MB ^{· 2+} ) [52]:

Окисление МБ · молекулярным кислородом, возвращающим краситель в основном состоянии и приводящим к образованию супероксидных радикалов (\ ({O} _2 ^ {\ cdotp -} \)):

Синглетный кислород и супероксидные радикалы, а также радикалы МБ, образующиеся в Реакциях (4) - (6), могут влиять на процесс окисления липидов. В разбавленном растворе, где не наблюдается образования димеров MB ([MB] <20 мкМ), реакции (3) и (4) будут преобладать [52]. Однако в комплексах VNPs – MB из-за повышенной концентрации MB на поверхности VNPs [29] может иметь место второй фотохимический процесс. Таким образом, увеличение образования сопряженных диенов в липидной суспензии, содержащей МБ, можно объяснить действием МБ как ¹ О ₂ фотогенератор под УФ-облучением. Следует отметить, что эффективность этого процесса намного меньше, чем при возбуждении МБ в длинноволновом максимуме поглощения.

В суспензии, содержащей GdVO ₄ :Eu ³⁺ наночастиц, окисление липидов более эффективно. Этот эффект можно объяснить фотокаталитическим поведением VNPs при УФ-облучении. Электроны проводящей зоны (e ^- ) и дырки валентной зоны (h ⁺ ) образуется при УФ-облучении ( E > E _г ) может взаимодействовать с молекулярным кислородом и молекулами воды, адсорбированными на поверхности НЧ, по следующим реакциям [18, 20, 47]:

Ионы гидроксила, образующиеся при фотолизе воды и адсорбированные на поверхности НЧ, также могут взаимодействовать с дырками с образованием гидроксильных радикалов:

Более того, окисление \ ({O} _2 ^ {\ cdotp -} \) дает синглетный кислород [18, 21, 22]:

Его реакция с ионами водорода приводит к образованию перекиси водорода:

в результате его взаимодействия с электронами могут образовываться гидроксильные радикалы и гидроксильные ионы:

Таким образом, повышение эффективности концентрации конъюгированных диенов в суспензии, содержащей VNP (рис. 2, столбец 3), можно приписать продуктам, образующимся в результате реакций (7) - (12) и способствующим окислению липидов.

В липидной суспензии, содержащей комплексы VNPs – MB, самые высокие концентрации конъюгированных диенов могут быть объяснены продуктами, образующимися как в результате реакций (3) - (6), так и реакций (7) - (12) (рис. 2, столбец 4). Более того, в комплексах VNPs – MB в реакциях (3) и (4) генерация синглетного кислорода могла происходить как за счет прямого возбуждения MB, так и за счет безызлучательной передачи энергии возбуждения от VNPs к MB, что достаточно эффективно в данном составе [29].

Обнаружение гидроксильных радикалов

Следующим шагом было более точное исследование эффективности OH · и ¹ О ₂ генерация в растворах при УФ / рентгеновском облучении. Кумарин использовали в качестве молекулы-зонда для подтверждения появления гидроксильных радикалов в рассматриваемых растворах. Известно, что радикалы ОН · являются одними из основных продуктов фотолиза / радиолиза воды при УФ / рентгеновском облучении [5, 6]. В водном растворе радикалы ОН · взаимодействуют с молекулами кумарина, образуя высоко флуоресцентный продукт 7-гидроксикумарин (см. Схему на рис. 3), который может быть обнаружен спектроскопически по появлению новой полосы ( λ _макс ~ 460 нм) смещены в длинноволновую область спектра относительно полосы флуоресценции кумарина ( λ _макс ~ 400 нм), рис. 3 [32, 33]. Чем выше концентрация радикалов ОН · в растворе, тем эффективнее окисление кумарина и, следовательно, тем интенсивнее длинноволновая полоса. Таким образом, анализ относительной интенсивности длинноволновой полосы может дать информацию о концентрации радикалов ОН · в растворе под действием различных факторов.

Реакция кумарина с гидроксильным радикалом с образованием флуоресцентного 7-гидроксикумарина. Нормализованные спектры флуоресценции водного раствора кумарина, λ _exc =325 нм

Спектры флуоресценции водного раствора кумарина, содержащего МБ, ВНП или комплексы ВНП – МБ, измеренные после 1 ч УФ-облучения, представлены на рис. 3. Показано, что УФ-облучение водного раствора кумарина без каких-либо добавок (контроль) вызывает образование новой длинноволновой полосы флуоресценции, указывающей на образование радикалов ОН · и окисление кумарина (рис. 3). При наличии в растворе молекул МБ относительная интенсивность этой полосы не меняется, что свидетельствует об отсутствии дополнительных эффектов МБ на генерацию радикалов ОН · (рис. 3). В растворе, содержащем VNPs, интенсивность полосы 7-гидроксикумарина заметно увеличивается (рис. 3) из-за фотокаталитической активности VNPs при УФ-облучении, реакциях (8), (9) и (12). Отметим, что резкие пики в области 535–540 нм принадлежат флуоресценции иона европия в GdVO ₄ :Eu ³⁺ наночастицы (внутриконфигурационные переходы). В растворе, содержащем комплексы ВНЧ – МБ, относительная интенсивность полосы 7-гидроксикумарина была примерно вдвое меньше, чем в растворе, содержащем ВНЧ, что указывает на менее эффективное образование радикалов ОН · (рис. 3). Это можно объяснить тем фактом, что адсорбция красителя MB на поверхности VNPs может препятствовать адсорбции молекул воды и гидроксил-ионов и, следовательно, снижает фотокаталитическую активность VNPs в отношении образования радикалов OH · посредством реакций (8) и (9). Более того, в комплексах ВНЧ – МБ часть адсорбированной энергии передается безызлучательно молекулам МБ [29], что также снижает эффективность образования электронно-дырочных пар и, как следствие, способность ВНЧ генерировать радикалы ОН · в таких комплексах.

Неожиданные результаты наблюдались при облучении рентгеновскими лучами растворов, содержащих ВНЧ (рис. 4). В отличие от случая УФ-облучения, мы наблюдаем, что относительная интенсивность полосы 7-гидроксикумарина уменьшается по сравнению с водным раствором кумарина без наночастиц, что указывает на улавливание радикалов ОН ·, образующихся в растворах в результате радиолиза воды. Наблюдаемый эффект сильно зависит от концентрации VNP (рис. 4). Следует отметить, что основная дискуссия, касающаяся способности наночастиц служить поглотителем АФК, сосредоточена в основном на CeO ₂ нанокристаллы (наноцерия) [54,55,56,57]. Основные особенности, которые заставляют наноцерии действовать как поглотители АФК, обычно объясняются высоким содержанием кислородных вакансий и Ce ³⁺ ионы в наноцериях и его переключение между степенями окисления 3+ и 4+. Однако критическая зависимость биологической активности наноцериев от их размера и механизма саморегенерации все еще обсуждается [54,55,56,57]. Отметим также, что защитные эффекты ГдВО ₄ :Eu ³⁺ и главный исполнительный директор ₂ НЧ против повреждений, вызванных рентгеновскими лучами, наблюдались в нашей группе ранее в экспериментах in vivo [57]. Насколько нам известно, способность GdVO ₄ :Eu ³⁺ наночастица для удаления радикалов OH ·, образующихся в водном растворе под воздействием рентгеновского излучения, наблюдалась впервые и требует дальнейшего более глубокого исследования.

Нормализованные спектры флуоресценции водного раствора кумарина, содержащего различные концентрации VNP, зарегистрированные после 30 мин рентгеновского облучения

Производство синглетного кислорода

Оценить эффективность комплексов ВНП – МБ ¹ . О ₂ генерации в воде, мы используем метод окисления АДФА синглетным кислородом с образованием нефлуоресцентного эндопероксида АДФАО ₂ (Рис. 5). Таким образом, в присутствии синглетного кислорода флуоресценция АДФК необратимо тушится. Следует отметить, что при УФ-облучении молекулы АДФК подвергаются сильному фотообесцвечиванию, что затрудняет идентификацию воздействий МБ, ВНП или комплексов ВНП – МБ, связанных с ¹ О ₂ поколение. Чтобы преодолеть этот недостаток, мы применяем лазерное излучение на длине волны 457 нм, что соответствует одному из пиков возбуждения Eu ³⁺ ионы, легированные GdVO ₄ нанокристаллы (дополнительный файл 1:Рисунок S3). На рис. 5 видно, что молекулы ADPA не вступают в фотохимические реакции при облучении светом 457 нм. В растворе, содержащем МБ, можно было наблюдать небольшое уменьшение интенсивности ADPA во времени (фиг. 5), что связано с небольшим возбуждением МБ на этой длине волны и действием в качестве фотосенсибилизатора в соответствии с реакциями (3) и (4). Такой же эффект наблюдается для раствора, содержащего VNPs (рис. 5), и его можно отнести к образованию радикалов \ ({O} _2 ^ {\ cdotp -} \) на поверхности VNPs (реакция (7)) с последующим его окислением по реакции (10) с образованием синглетного кислорода. Более сильное тушение флуоресценции АДФК наблюдается в комплексах ВНЧ – МБ. Эффективность этого процесса вдвое выше, чем в решении с МБ или VNP. Более высокая эффективность генерации синглетного кислорода в растворе, содержащем комплексы VNPs – MB, связана с передачей энергии от VNPs к MB в комплексах, в которых VNPs служат преобразователями энергии для фотосенсибилизатора MB.

Reaction of ADPA with singlet oxygen to form endoperoxide ADPAO₂ . ADPA photobleaching after irradiation with λ  = 457 nm in water solutions

Unfortunately, due to ADPA sensor instability, we were not successful to measure the efficiency of the ¹ О ₂ generation in water solution under X-ray excitation.

Выводы

The efficiency of ROS generation in water solutions containing GdVO₄ :Eu ³⁺ nanoparticles and their complexes with MB have been analyzed under UV-Vis and X-ray irradiation by three methods (conjugated dienes test, OH· radical, and singlet oxygen detection). Complexes VNPs–MB reveal high efficiency of ROS generation under UV-Vis irradiation associated with both high efficiency of OH· radicals generation by VNPs and ¹ О ₂ generation by MB due to nonradiative excitation energy transfer from VNPs to MB molecules. For the first time, the strong OH· radicals scavenging by VNPs has been observed under X-ray irradiation. Our observation indicates that VNPs–MB complexes can be potentially used to activate photodynamic therapy.

Сокращения

MB:

Methylene blue

PS:

Photosensitizer

ROS:

Reactive oxygen species

VNPs:

Gadolinium orthovanadate GdVO₄ :Eu ³⁺ наночастицы