Получение наночастиц mPEG-ICA, нагруженных ICA, и их применение в лечении LPS-индуцированного повреждения клеток H9c2

Введение

Воспалительная реакция участвует во всем патологическом процессе ремоделирования желудочков и является основной причиной рационального ремоделирования болезни сердца после сердечной травмы [1, 2]. Эти провоспалительные цитокины, которые включают фактор некроза опухоли (TNF) -a, IL-1β, IL-6 и IL-18, приводят к повреждению миокарда и долгосрочному патологическому ремоделированию [3]. Когда кардиомиоциты повреждены, они также могут высвобождать DAMP (молекулярные модели, связанные с повреждением), такие как HMGBI, для активации эндотелиальных клеток для экспрессии хемокиновых рецепторов, генерации воспалительных факторов и индукции некроза или апоптоза кардиомиоцитов [4, 5]. Кроме того, HMGB способствует накоплению воспалительных клеток, таких как макрофаги и нейтрофилы, в поврежденном сердце через CXCL12 / CXCR4, усугубляя сердечную нагрузку и травмы [5]. Следовательно, блокирование активации воспалительной реакции может использоваться как эффективная стратегия уменьшения патологического ремоделирования сердца.

Икариин (ICA C ₃₃ H ₄₀ О ₁₅ ) представляет собой липосомное соединение, экстрагированное из китайской лекарственной травы epimedii [6]. Обширные исследования показали, что ИКА обнадеживает как иммунорегуляторное, кардиозащитное, антиоксидантное, противовоспалительное и антиапоптотическое средство [7, 8]. Несмотря на положительные свойства ICA, существуют различные факторы, ограничивающие его применение, в том числе низкая растворимость в воде, короткий период полувыведения и низкая биодоступность при пероральном приеме [9]. Наноносители стали новой стратегией повышения эффективности прямого воздействия на цель, противовоспалительного действия и защиты сердца; Кроме того, наноносители могут преодолеть недостатки ICA [10, 11].

В последнее время исследователи сосредоточили внимание на системах доставки лекарств [12]. Были разработаны различные наноносители, такие как мицеллы [13], липосомы [14] и углеродные нанотрубки [15]. Чтобы снизить смертность и заболеваемость сердечно-сосудистыми заболеваниями, необходимо срочно разработать новую нанодозировочную форму, содержащую достаточное количество ICA и обладающую свойствами направленного высвобождения.

Для преодоления ограничений применения ИКА в качестве носителя мы использовали монометиловый эфир полиэтиленгликоля (мПЭГ) [16, 17]. мПЭГ - это производное полиэтиленгликоля, которое имеет стабильные химические свойства и более высокую гидрофильность, чем ПЭГ [18]. Однако, поскольку конечная гидроксильная активность мПЭГ очень мала, мПЭГ, как нагруженный лекарством наноматериал, должен подвергаться гидроксильной активации. Поэтому мы использовали ICA в качестве гидрофобного конца и карбоксильный мПЭГ, образованный этерификацией мПЭГ и янтарного ангидрида, в качестве гидрофильного конца для химического соединения. Образовавшаяся сложноэфирная связь может ускорять расщепление в кислых условиях.

Наночастицы обладают уникальными преимуществами при доставке нерастворимых лекарств [19], полимерных лекарств [20] и генной терапии [21]. Подобно опухолевой ткани, воспалительные участки миокарда имеют сходные функции проницаемости и удерживания (EPR) [22]. Наночастицы размером примерно 200 нм могут проникать через межуточный промежуток для обогащения лекарственного средства [23]. НЧ mPEG-ICA были приготовлены на ранней стадии, что подтвердило их роль в ишемии миокарда, но из-за отсутствия нагрузки ICA они не смогли достичь наилучшего эффекта [24]. Таким образом, новый вид наночастиц mPEG-ICA, нагруженных ICA, полученных путем сочетания химического синтеза и физического улавливания, может не только улучшить растворимость в воде и лекарственную нагрузку ICA, но также продлить время длительного высвобождения нанопрепаратов при воспалении миокарда и эффективно улучшить биодоступность лекарств, достигая наилучшего эффекта от целенаправленного лечения LPS-индуцированного повреждения клеток H9c2 с помощью ICA. Мы исследовали высвобождение ICA из загруженных ICA НЧ mPEG-ICA в растворах PBS с pH 7,4 и 6,8. Кроме того, чтобы изучить влияние наночастиц mPEG-ICA на воспаление миокарда, мы использовали липополисахарид (LPS) для индукции клеток H9C2, чтобы установить внешнюю воспалительную модель, выявили жизнеспособность клеток, скорость апоптоза и экспрессию мРНК провоспалительных цитокинов, а затем изучили фармакодинамический эффект наночастиц mPEG-ICA, нагруженных ICA, на процесс воспаления миокарда.

Материалы и методы

Экспериментальные инструменты

Были использованы:электронные весы JA302 (Shanghai Suzhan Metrology instrument Co., Ltd.); роторный испаритель RE52CS-1 (Шанхайский завод биохимических инструментов Яронг); магнитная мешалка с постоянной температурой с цифровым дисплеем 78HW-1 (Hangzhou instrument Motor Co., Ltd.); электрическая пескоструйная сушилка 101-OA (Tianjin Telester instrument Co., Ltd.); Инфракрасный спектрометр с преобразованием Фурье NEXUS670 (Neliko Co., Ltd.); УФ-видимый спектрофотометр (Beijing Leiboteke instrument Co., Ltd.); просвечивающая электронная микроскопия (ТЕМ Glacios); прибор для ультразвуковой дисперсионной экстракции, генератор на водяной бане JP-010S (China Jiemeng Co., Ltd.); прибор для количественной флуоресцентной ПЦР в реальном времени; многофункциональный прибор для маркировки ферментов; инвертированный микроскоп (компания Olympus) флуоресцентный микроскоп (Leica, Гейдельберг, Германия); инкубатор клеток с углекислым газом (компания Thermo).

Экспериментальные реактивы

Использовали следующее:название реагента, чистота / спецификация / номер производственной партии (производитель):икариин (95% / 1 г / DL070208 Sahn Chemical Technology Co., Ltd.); липополисахарид (Модель 055-100 г / Z06J9Y52452 B5 25 мг Sigma Co., Ltd.); монометиловый эфир полиэтиленгликоля (Analytical Pure / 250 г / MKBT7172 V, Sigma Co., Ltd.); дихлорметан (Analytical Pure / 500 мл / 20171103 Sinopharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd.); 4-диметиламинопиридин (Analytical Pure / 100 г / л 170741 Shanghai Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd.); N-гидроксисукцинимид (биологический реагент / 100 г / RA328L758 Shanghai Ruiyong Biotechnology Co., Ltd.); Одноэтапный метод FastKing для удаления первой цепи предварительно смешанного набора для синтеза геномной кДНК (Tiangen Biotechnology Co., Ltd.); набор для обнаружения апоптоза (Biyuntian); Набор для количественного анализа флуоресценции SYBR Green (компания QIAGENGmbH).

Синтез mPEG-COOH

Взвешивали мПЭГ (5,00 г), янтарный ангидрид (SA, 0,40 г) и 4-диметиламинопиридин (молярное соотношение 1:1,5 / 1,5, 0,50 г) и помещали в круглодонную колбу на 250 мл. Добавляли пятьдесят миллилитров дихлорметана, кипятили с обратным холодильником и перемешивали при 60 ° C в течение 2 часов. Дихлорметан удаляли на роторном испарителе при 35 ° C в течение половины дня и получали белое твердое вещество, которое выдерживали при комнатной температуре и атмосферном давлении в течение половины дня до тех пор, пока не перестанет появляться эфирный остаток. Порошок растворяли в 50 мл вторичной дистиллированной воды и подвергали диализу в диализном мешке 2 кДа в течение 48 ч с постоянной заменой воды. Растворенную СК удаляли, а нерастворенное вещество отфильтровывали. Карбоксилированный mPEG (mPEG-COOH) получали лиофилизацией фильтрата и взвешиванием.

Синтез полимера мПЭГ-икариина

мПЭГ-СООН (0,37 г), N -гидроксисукцинимид (0,024 г) и 4-диметиламинопиридин (0,026 г) взвешивали в круглодонной колбе на 250 мл, а затем добавляли 10 мл дегидратированного диметилсульфоксида (ДМСО) в качестве растворителя и перемешивали при комнатной температуре в течение половины времени. день для активации карбоксильной группы. Затем 100 мг стандарта икариина помещали в небольшую пробирку и добавляли 5 мл ДМСО, из которого была удалена вода, для полного растворения стандарта. Затем стандартный образец добавляли в круглодонную колбу и перемешивали в течение 48 ч в атмосфере азота при комнатной температуре. После непрерывного диализа вторичной дистиллированной водой стандартный образец не содержал ДМСО, и мы подтвердили удаление ДМСО с помощью УФ. Затем диализованный материал сушили вымораживанием в вакуумной сублимационной сушилке в течение 48 часов с получением светло-желтого продукта, а именно полимера mPEG-ICA.

Приготовление наночастиц (НЧ) mPEG-ICA, нагруженных ICA

mPEG-ICA (5 мг) взвешивали в небольшой пробирке, растворяли в 2 мл ДМСО и затем встряхивали в воде при 37 ° C в течение 5 минут. Пять миллиграммов ICA растворяли в подходящем количестве ДМСО и помещали в небольшой химический стакан, медленно добавляли mPEG-ICA и растворяли в ДМСО и добавляли 5 мл дистиллированной воды. Затем раствор перемешивали на магнитной мешалке при комнатной температуре в течение 15 минут. Затем реагент подвергали диализу в диализном мешке 3500 и диализовали в воде в течение 24 часов, в течение которых воду постоянно меняли, растворитель ДМСО подвергали чистому диализу, и после фильтрации получали наночастицы mPEG-ICA, нагруженные ICA. P>

Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье

Соответствующие количества стандартных полимеров ICA, mPEG-COOH и mPEG-ICA измельчали ​​в порошок в агатовой ступке, смешивали с соответствующими количествами сухого порошка KBr и измельчали ​​в мелкие порошки. После прессования таблеток смесь сканировали на инфракрасном Фурье-спектрометре с диапазоном сканирования 4000–4400 см / моль ^-1 . , и его инфракрасные спектры. ICA и mPEG-COOH были использованы для характеристики материала, а полимер mPEG-ICA был использован для характеристики продукта.

Спектр водорода ядерного магнитного резонанса

Полимеры ICA, mPEG-COOH и mPEG-ICA растворяли в дейтерированном диметилсульфоксиде (ДМСО-d6) и загружали в пробирку для образца, которую вставляли в ротор. Затем образец помещали на спектрометр ядерного магнитного резонанса 500 МГц и задавали параметры отбора проб.

УФ – видимый спектр

Стандарт икариина (4,0 мг) добавляли в мерную колбу на 25 мл с добавлением метанола в масштабе, затем встряхивали и растворяли до осветления. Затем аликвоты стандартного раствора икариина на 0,3 мл, 0,5 мл, 1,0 мл, 1,5 мл, 2,0 мл и 2,5 мл точно отмеряли в 25-мл мерных колбах и добавляли метанол для регулирования объема. Затем измеряли значения поглощения растворов на ультрафиолетовом спектрофотометре при длине волны 270 нм (максимальная длина волны поглощения) с метанолом в качестве холостого контроля. Данные были записаны для создания линейной регрессии.

Полимер mPEG-ICA (4,3 мг) точно взвешивали в мерной колбе на 25 мл с добавлением метанола в масштабе. Раствор встряхивали до растворения и осветления. Затем раствор образца объемом 2,0 мл точно измеряли три раза и растворяли в мерной колбе на 25 мл, доводя объем метанолом. Затем измеряли значения оптической плотности растворов на ультрафиолетовом спектрофотометре при длине волны 270 нм (максимальная длина волны поглощения), используя метанол в качестве холостого контроля, и данные записывали три раза, принимая среднее значение. Затем было рассчитано содержание икариина.

Наночастицы mPEG-ICA, нагруженные ICA, полученные в соответствии с описанным выше методом, помещали в колбу вместимостью 25 мл, добавляли метанол в масштабе и колбу встряхивали до растворения и осветления раствора. Затем раствор образца объемом 2,0 мл точно измеряли три раза и растворяли в мерной колбе на 25 мл, доводя объем метанолом. Затем измеряли значения оптической плотности растворов на ультрафиолетовом спектрофотометре при длине волны 270 нм (максимальная длина волны поглощения), используя метанол в качестве холостого контроля, и данные записывали три раза, принимая среднее значение. Данные были собраны для расчета среднего содержания ICA в наночастицах mPEG-ICA, нагруженных ICA.

Характеристика НЧ mPEG-ICA, нагруженных ICA

Обнаружение динамического рассеяния света

Анализатор частиц с динамическим светорассеянием (DLS; The zetasizer 3000hs, Malvern instruments, Malvern, UK) использовали для измерения распределения частиц по размерам и потенциала НЧ mPEG-ICA, нагруженных ICA. Вновь приготовленные mPEG-ICA и загруженные ICA НЧ mPEG-ICA лиофилизировали и повторно диспергировали в дистиллированной воде, выливали в колориметрическую чашку и затем помещали в пул образцов анализатора размера частиц с динамическим светорассеянием для обнаружения. Каждый образец был проанализирован трижды.

Наблюдение за морфологией с помощью ТЕА

Раствор НЧ mPEG-ICA, нагруженный ICA (1,0 мг / мл), наносили по каплям на медную сетку с углеродной пленкой и фильтровальной бумагой для сушки. Сетку помещали в сушилку, добавляли 2% (мас. / Мас.) Фосфорновольфрамовую кислоту и давали ей высохнуть естественным путем в течение 10 мин. Затем морфологические характеристики загруженных ICA НЧ mPEG-ICA наблюдались при ускоренном напряжении 80 кВ с помощью просвечивающей электронной микроскопии.

Измерение устойчивости

Подготовленные НЧ mPEG-ICA, нагруженные ICA, сушили вымораживанием с 5% маннитом в вакуумной сублимационной сушилке в течение 48 часов, а затем лиофилизированные наночастицы повторно растворяли в бидистиллированной воде для обнаружения изменений размера их частиц и значения PDI. .

Определение загрузки лекарства и эффективности захвата

Раствор mPEG-ICA NP объемом 1,8 мл, нагруженный ICA, точно измеряли в мерной колбе объемом 10 мл, добавляли 0,2 мл ДМСО и проводили ультразвуковое исследование в течение 2 мин. Оптическую плотность раствора определяли при 270 нм, и полимер mPEG-ICA с тем же растворителем использовали в качестве холостого опыта. Поглощение определенного образца подставляли в уравнение стандартной кривой и рассчитывали содержание икариина. В ДМСО / H ₂ O =1/9 системы растворителей, квазикривое уравнение икариина было измерено при 270 нм, и были рассчитаны загрузка лекарственного средства (EE%) и эффективность захвата (LC%) наночастиц.

• Загрузка лекарственного средства (EE%) =масса лекарственного средства наночастиц / общая масса наночастиц, загружающих лекарственное средство × 100%

• Степень инкапсуляции (LC%) =масса лекарства в наночастицах / дозировка × 100%.

Высвобождение лекарства in vitro

Пять миллилитров свободного ICA, полимера mPEG-ICA и загруженных ICA НЧ mPEG-ICA помещали в диализные мешки (3500 кДа), которые прикрепляли с обоих концов и подвергали диализу в 25 мл PBS (высвобождающая среда) при 37 ° C и Ультразвуковая вибрация 100 об / мин (pH =7,4). Два миллилитра были удалены в течение заранее определенного периода времени (Tn, n =0, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48 и 72 ч) и заменены свежим раствором того же объема. Спектрофотометрию в УФ-видимом диапазоне проводили для определения оптической плотности диализата при 270 нм в разное время. Процентное соотношение высвобождения ICA рассчитывали, как описано, и измеряли три образца для расчета среднего высвобождения лекарственного средства. Содержание диализата определяли методом стандартной кривой, и тест высвобождения повторяли 3 раза in vitro.

Формула высвобождения лекарства: Q % =( C _n × V + V _n Σ ⁿ _{т =0} C _я ) / (W _NP × LC%), где W - масса NP, LC% - загрузка наночастиц лекарством, C _n - концентрация образца при Tn, V - общий продукт высвобождающей среды (25 мл), Vn - вес образца (2 мл), и C _я это T _я ( я =0, 0,5, 1,…., n h , V ₀ = C ₀ =0).

Выпуск mPEG-ICA-ICA NP на разных носителях выпуска

Два миллилитра нагруженного ICA раствора mPEG-ICA NP помещали в диализный мешок (4–88 кДа, пороговое значение молекулярной массы) и помещали в фосфатно-солевой буфер с pH 7,4 и pH 6,8 (среда для высвобождения PBS, 37 ° C, 25 ° C). мл). Затем 2 мл высвобождающей среды собирали для отбора проб и заменяли свежим раствором того же объема через заданные интервалы (Tn, n =0, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24 и 48 ч). Поглощение диализата при 270 нм в разное время определяли спектрофотометрией в УФ-видимом диапазоне. Было рассчитано процентное соотношение высвобождения ICA и измерено три образца для расчета среднего высвобождения лекарственного средства.

Эксперимент по тестированию ячеек

H9c2 (крысиный H9c2), линия миобластов желудочков крысы, была приобретена в Шанхайском институте биохимии и клеточной биологии, Китай. Клетки культивировали в среде DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки (Gibco, США), при 37 ° C в CO ₂ -содержащая атмосфера. Клетки H9c2 обычно высевали в 10-сантиметровую культуральную чашку [25]. Когда клетки выросли примерно до 80%, их пересевали с 0,25% трипсином (Gibco). Затем клетки высевали в соответствующие чашки для культивирования или 96-луночные планшеты для следующих исследований.

Обработка клеток LPS или ICA-наночастицами

Клетки H9c2 были разделены на пять групп следующим образом:(1) контрольная группа:с использованием нормальной культуральной среды, (2) группа LPS:клетки обрабатывали 10 мг / л LPS в течение 24 часов; (3) группа ICA:клетки обрабатывали 20 мкмоль / л ICA (1:1000, ДМСО) и 10 мг / л LPS в течение того же времени; (4) группа полимера mPEG-ICA:клетки обрабатывали 20 мкмоль / Л полимера mPEG-ICA и той же конечной концентрации LPS в течение того же времени; (5) Группа mPEG-ICA NPS, нагруженных ICA:клетки обрабатывали 20 мкмоль / л ICA-нагруженными mPEG-ICA NP и 10 мг / л LPS, с другими условиями, такими же, как в вышеуказанной группе.

MTT

Жизнеспособность клеток наночастиц ICA против LPS-индуцированного повреждения кардиомиоцитов определяли с помощью MTT. Вкратце, клетки H9c2 обрабатывали LPS и различными наночастицами ICA в течение 24 часов. После этого клетки окрашивали МТТ в конечной концентрации 0,5 мг / мл в течение 4 ч при 37 ° C, а затем добавляли 150 мкл диметилсульфоксида (ДМСО) для растворения кристаллов щитовидной железы. Оптическую плотность измеряли при 570 нм на считывающем устройстве для микропланшетов (* / SpectraMax i3 Molecular Devices, Афганистан).

Высвобождение лактатдегидрогеназы (ЛДГ)

Чтобы исследовать влияние нано-ICA на LPS-индуцированное повреждение H9c2, мы оценили высвобождение ЛДГ в культуральной среде. Вкратце, согласно соответствующим обработкам в течение 24 часов, культуральная среда была собрана, и LDH был обнаружен в соответствии с протоколом набора LDH Detection Kit (Beyotime Biotechnology). Наконец, значение OD было измерено при 490 нм с помощью спектрометра.

Окрашивание по Hoechst 33 258

Окрашивание Hoechst 33,258 использовали для наблюдения морфологии ядра с помощью флуоресцентной микроскопии. После обработки клетки H9c2 дважды промывали PBS, фиксировали в 4% параформальдегидном буфере (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), промывали PBS и окрашивали Hoechst 33,258 при 37 ° C в течение 15 мин [26]. После окрашивания морфологические аспекты ядра немедленно наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа (Leica, Гейдельберг, Германия). Индекс апоптоза =количество апоптотических ядер / общее количество ядер × 100%.

Тест TUNEL (маркировка ник-конца терминального dUTP)

Для определения целостности ДНК клеток H9c2 мы применили методику TUNEL. Клетки H9c2 культивировали в 24-луночном культуральном планшете. После обработки их 3 раза промывали PBS и фиксировали 4% полиформальдегидом в течение 30 мин [27]. Затем добавляли 1% Triton X-100 на 5 мин для увеличения проницаемости клеточной мембраны. Затем клетки окрашивали с помощью набора для одноэтапной диагностики TUNEL (Beyotime Biotechnology) в соответствии с инструкциями и наблюдали апоптоз клеток с помощью флуоресцентного микроскопа. Скорость апоптоза каждой группы выражается как процент зеленых флуоресцентных ядер (TUNEL-позитивных) к общему количеству ядер (синий) (ядра окрашены DAPI) [28].

Проточная цитометрия для обнаружения апоптоза

Для дальнейшего изучения влияния различных наночастиц ICA на апоптоз клеток, индуцированный LPS, мы использовали метод двойного окрашивания аннексином V-FITC / PI для анализа скорости апоптоза. После обработки H9c2, как описано выше, клетки собирали и ресуспендировали в 195 мкл связывающего буфера, содержащего 10 мкл аннексина V-FITC и 5 мкл PI, а затем инкубировали в течение 15 мин при комнатной температуре в темноте. После центрифугирования при 1500 об / мин в течение 10 минут при 4 ° C буфер для окрашивания аспирировали, клетки дважды промывали PBS и ресуспендировали в 100 мкл PBS. Наконец, образцы были измерены проточным цитометром.

Количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (RT – qPCR)

RT – qPCR использовали для определения уровней экспрессии мРНК воспалительных маркеров, включая TNF-α, IL-1β и IL-6. После обработки клеток H9c2 в течение 24 часов, общую РНК экстрагировали с помощью TRIzol, как описано ранее, и измеряли с помощью спектрофотометра NanoDrop ™ One / OneC в микро ультрафиолетовом и видимом диапазонах (Thermo, ND-ONEC-W, США). кДНК синтезировали с использованием набора ExScript RT, и амплификацию выполняли на флуоресцентном аппарате для количественной ПЦР (BIO-RAD CFX96 Touch *) с реагентом SYBR Green при следующих условиях:95 ° C в течение 5 минут, 95 ° C в течение 30 с, 58 ° C в течение 30 с, всего 28 циклов. В этом исследовании используются следующие праймеры:

Actin ::

Форвард 5 ′ GCTGTCCCTGTATGCCTCT-3 ′;

Обратный 5′-TTGATGTCACGCACGATTT-3 ′;

TNF-α ::

Нападающий 5′TCTATACCACTTCACAAGTCGGA-3 ′;

Обратный 5'-GAATTGCCATTGCACAACTCTTT-3 ';

IL-1β ::

Нападающий 5′GGATGATGACGACCTGCTA 3 ′;

Обратный 5′-CACTTGTTGGCTTATGTTCTG3 ′

IL-6 ::

Нападающий 5′TGCCTTCTTGGGACTGAT-3 ′;

Обратный 5′-CTGGCTTTGTCTTTCTTGTTAT-3 ′.

Количество каждого гена-мишени было нормализовано к количеству гена актина. Эксперименты повторяли трижды.

Результаты и обсуждение

FTIR и H ¹ Спектры ЯМР

Из спектров mPEG-ICA пики поглощения валентных колебаний двух сложноэфирных связей (–C =O–) находятся при 1700 ^-1 и 1740 ⁻¹ см. По сравнению со спектрами mPEG-COOH, наблюдается избыточный пик валентного колебания C =C при 1650 см ^-1 . , что указывает на то, что этерификационный синтез ICA и mPEG-COOH был успешным с образованием mPEG-ICA (рис. 1).

FTIR-спектры mPEG-ICA ( A ), ICA ( B ) и mPEG-COOH ( C ). H ¹ Спектры водорода ЯМР для mPEG-COOH и mPEG-ICA

Из спектра водорода mPEG-ICA 12,6 м.д. указывает на фенольные гидроксильные группы ICA из-за присутствия -C =O групп электронов с сильным поглощением, движущихся в слабое поле. Пик водорода бензольного кольца примерно при 7,5 ч / млн и площадь пика 3,5 ч / млн очень велики, что оценивается как –CH ₂ –O– пик водорода в полимере мПЭГ. Большое количество анализов показывает, что сигнал алкильного водорода составляет 0–2 ppm. Таким образом, можно сделать вывод, что 1,7 ppm - пик водорода двойной связи в ICA. Характерные пики mPEG-COOH и ICA появляются в полимерах mPEG-ICA, демонстрируя успешный синтез mPEG-COOH с ICA (рис. 1).

Размер частиц, дзета-потенциал и ТЕА

Средний размер наночастиц mPEG-ICA составляет приблизительно (145,0 ± 15,2) нм, а значение индекса дисперсии (PDI) полимера составляет (0,277 ± 0,00). Размер частиц наночастиц mPEG-ICA, нагруженных ICA, немного увеличился, примерно до (220,0 ± 13,7) нм, а PDI составил (0,119 ± 0,00). Чем меньше PDI, тем более равномерно распределение загруженных ICA НЧ mPEG-ICA. Дзета-потенциал наночастиц mPEG-ICA составлял (0,439 ± 0,258) мВ, а дзета-потенциал наночастиц mPEG-ICA, нагруженных ICA, составлял (2,30 ± 1,33) мВ. Просвечивающая электронная микроскопия показала, что наночастицы mPEG-ICA, нагруженные ICA, были сферическими, регулярными по морфологии и относительно однородными по размеру (рис. 2).

Размер частиц, дзета-потенциал и ПЭМ НЧ mPEG-ICA, нагруженных ICA

Эффективность загрузки и инкапсуляции лекарств

Содержание ICA в загруженных ICA НЧ mPEG-ICA можно рассчитать с помощью ультрафиолетовой спектрофотометрии. Была построена стандартная кривая концентрации ICA, и содержание ICA в полимере было получено путем расчета концентрации лекарственного средства на основе стандартной кривой. Согласно расчетам, основанным на поглощении полимера mPEG-ICA (1,2397 ± 0,1024), содержание ICA составило (0,4132 ± 0,0359) мг / мл, с поглощением наночастиц mPEG-ICA, нагруженных ICA (1,6289 ± 0,0923), и содержание ICA составило (0,5496 ± 0,3234) мг / мл. Рассчитанная в соответствии с формулой метода, загрузка лекарственного средства полимера mPEG-ICA составляла (16,5 ± 0,014)%, а степень инкапсуляции составляла (41,3 ± 0,036)%; Содержание лекарственного средства загруженных ICA НЧ mPEG-ICA составляло (21,9 ± 0,013)%, а степень инкапсуляции составляла (54,9 ± 0,032)% (Таблица 1).

Определение стабильности

Размер частиц наночастиц mPEG-ICA, нагруженных ICA, полученных методом диализа, составлял (220,0 ± 13,7) нм, а PDI составлял (0,119 ± 0,00). После сушки вымораживанием в 5% манните в течение 48 часов наночастицы можно повторно растворить в воде с образованием стабильных наночастиц. Размер частиц 255 нм, PDI (0,326 ± 0,00), что немного больше, чем у диализных наночастиц (рис. 3).

Стабильность НЧ mPEG-ICA, нагруженных ICA

Высвобождение лекарства mPEG-ICA-ICA in vitro

На фиг. 4 высвобождение ICA в значительной степени зависит от pH среды высвобождения. В среде для высвобождения фосфатно-солевого буфера (PBS) при pH 7,4 свободный икариин высвобождался (77,21 ± 0,15)% в течение 12 часов и высвобождался полностью. Поскольку НЧ mPEG-ICA, нагруженные препаратами икариина, могут увеличивать высвобождение наночастиц, высвобождение лекарственного средства наночастиц mPE-ICA высвобождается до (44,08 ± 0,12)% в течение 72 часов, а наночастиц mPEG-ICA, нагруженных ICA, достигает (52,80 ± 1,70) %. Наночастицы mPEG-ICA, нагруженные ICA, помещали в буферный раствор с pH 6,8, и мы обнаружили, что опосредованное наночастицами высвобождение лекарств достигло (75,66 ± 0,17)% в течение 48 часов. Вероятно, это связано с тем, что некоторые загруженные ICA НЧ mPEG-ICA имеют деполимеризованные НЧ или молекулы mPEG-ICA разрываются в НЧ. Эти наблюдения показали, что высвобождение ICA было более благоприятным в кислых условиях pH 6,8. Он также показал, что характеристики высвобождения наночастиц mPEG-ICA, нагруженных ICA, были полезны для местного лечения воспалительного повреждения миокарда, поскольку локальные поражения приводят к образованию очага со слабокислой средой.

А Высвобождение ICA из загруженных ICA NP mPEG-ICA в PBS при pH 7,4. Б Высвобождение ICA из загруженных ICA НЧ mPEG-ICA в PBS при pH 7,4 и pH 6,8 при 37 ° C in vitro

Жизнеспособность клеток H9C2 и высвобождение лактатдегидрогеназы

Во-первых, чтобы наблюдать цитотоксичность наночастиц mPEG-ICA, нагруженных ICA, мы добавили свободное лекарственное средство (20 мкМ ICA), НЧ mPEG-ICA и НЧ mPEG-ICA, нагруженные ICA, к клеткам H9c2, и результаты MTT не показали заметной цитотоксичности наночастицы (рис. 5). Затем мы дополнительно исследовали, могут ли они защитить клетки H9c2 от повреждения, вызванного LPS (рис. 6). После обработки LPS в течение 24 часов жизнеспособность клеток снизилась до (50,0 ± 3,22)% (контрольная группа 100%), при этом обработка ICA, НЧ mPEG-ICA и НЧ mPEG-ICA, нагруженных ICA, значительно увеличила жизнеспособность клеток H9c2 на (55,94 ± 1,06)%, (60,97 ± 2,615)% и (65,36 ± 1,214)% соответственно ( P <0,05).

Оценка цитотоксичности наночастиц ICA на клетки H9c2. Данные выражены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего для трех отдельных экспериментов

Оценка эффектов наночастиц ICA на LPS-индуцированное повреждение клеток H9c2. Жизнеспособность клеток в разных группах измеряли с помощью анализа МТТ. Данные представляют собой среднее значение ± SME. (** P <0,01 по сравнению с con; # P <0,05 и, ## P <0,01 по сравнению с LPS; & P <0,05 против . LPS + mPEG-ICA)

Кроме того, уровень ЛДГ является маркером повреждения клеток; поэтому мы измерили уровень высвобождения ЛДГ в культуральной среде (рис. 7). Уровни ЛДГ были увеличены в группе LPS по сравнению с группой нормальной культуры. Обработка ICA, mPEG-ICA NP или ICA-нагруженные mPEG-ICA NP снижала повышение уровня ЛДГ, индуцированное LPS, особенно в группе mPEG-ICA NP, нагруженных ICA. Эти результаты показали, что наночастицы ICA могут защищать клетки от LPS.

Влияние наночастиц ICA на уровень ЛДГ, индуцированный ЛПС в клетках H9c2. Данные представляют собой среднее значение ± стандартное отклонение. *** P <0,01 по сравнению с con; ## P <0,01 по сравнению с группой лечения LPS; * & P <0,05 по сравнению с группой LPS + mPEG-ICA

Апоптоз клеток, индуцированный LPS

Во-первых, ядерная морфология была обнаружена окрашиванием Hoechst 33,258 (рис. 8). Ядерный хроматин демонстрировал конденсацию, разрыв и фрагментацию после повреждения LPS в группе LPS. Тем не менее, для группы mPEG-ICA NP, нагруженных ICA, количество апоптотических клеток, очевидно, уменьшилось . Кроме того, мы использовали окрашивание TUNEL, чтобы наблюдать разрывы клеточной ДНК или повреждение ДНК (рис. 9). Количество апоптотических ядер в группе, индуцированной ЛПС, составило (47,57 ± 3,41)% (P 0,0001) по сравнению с (6,47 ± 1,87)% в группе нормальной культуры. После обработки НЧ mPEG-ICA, нагруженных ICA, НЧ mPEG-ICA и ICA, скорость апоптоза снизилась до (17,92 ± 3,12)% и (26,54 ± 3,68)% и (35,49 ± 4,25)%, соответственно, и НЧ mPEG-ICA значительно снижали скорость апоптоза по сравнению с NP mPEG-ICA. Кроме того, проточно-цитометрический анализ LPS-индуцированных клеток H9c2 показал, что (35,93 ± 2,23)% клеток находились на ранней и поздней стадиях апоптоза (фиг. 10). После обработки загруженными ICA NP mPEG-ICA или mPEG-ICA NP общие скорости апоптоза были снижены до (16,70 ± 2,77)% и (19,15 ± 3,67)%, соответственно. Эти результаты соответствовали результатам окрашивания Hoechst 33,258 и окрашивания TUNEL и показали, что загруженные ICA НЧ mPEG-ICA в значительной степени предотвращали апоптоз клеток.

Обнаружение апоптоза окрашиванием Hoechst 33,258. А Морфология ядра в клетках, окрашенных Hoechst 33,258. Б Количественный анализ скорости апоптоза окрашиванием Hoechst 33,258. Данные представляют собой среднее значение ± SEM (*** P <0,005 по сравнению с con; # P <0,05 по сравнению с LPS; & P <0,05 по сравнению с LPS + mPEG-ICA)

Обнаружение апоптоза по TUNEL. А Клетки с окрашиванием TUNEL и DAPI; Б скорость апоптоза. Данные представляют собой среднее значение ± SEM (**** P <0,0001 против . против; ### P <0,005 по сравнению с LPS; && P <0,01 по сравнению с LPS + mPEG-ICA)

А . Скорость апоптоза определяется с помощью проточной цитометрии. Клетки H9c2 окрашивали двойным окрашиванием аннексином V / PI. Клетки Q1-LL были дважды отрицательно окрашены аннексином V / PI, что указывает на жизнеспособность клеток; Клетки Q1-LR были окрашены по аннексину V-положительным и PI-отрицательным, что указывало на ранний апоптоз; Клетки Q1-UR были дважды положительно окрашены аннексином V / PI, что указывает на поздний апоптоз. Б . Скорость апоптоза (%). Данные представляют собой среднее значение ± SME. (*** P <0,005 по сравнению с con; # P <0,05 и ## P <0,01 по сравнению с LPS; & P <0,05 по сравнению с LPS + mPEG-ICA)

мРНК воспалительного цитокина в LPS-индуцированных клетках H9c2

Затем мы оценили влияние загруженных ICA NP mPEG-ICA на экспрессию мРНК TNF-α, IL-1β и IL-6 в LPS-индуцированных клетках H9c2. После 24-часовой обработки LPS в клетках H9c2 уровни мРНК TNF-α, IL-1β и IL-6 были увеличены. Это увеличение ослаблялось обработкой НЧ mPEG-ICA, нагруженными ICA, НЧ mPEG-ICA и ICA, а обработка НЧ mPEG-ICA, нагруженных ICA, заметно снижала экспрессию мРНК TNF-α, IL-1β и IL-6 (фиг.11). .

Влияние загруженных ICA NP mPEG-ICA на уровни экспрессии мРНК IL-1β, TNF-α и IL-6 в LPS-индуцированных клетках H9c2. Влияние загруженных ICA NP mPEG-ICA на мРНК IL-1β в LPS-индуцированных клетках H9c2. (** P <0,01 по сравнению с con; # P <0,05 по сравнению с LPS; & P <0,05 по сравнению с LPS + mPEG-ICA.) (2) Влияние загруженных ICA NP mPEG-ICA на мРНК TNF-α. (*** P <0,005 по сравнению с con; # P <0,05 по сравнению с группой LPS; & P <0,05 по сравнению с LPS + mPEG-ICA) (3) Влияние загруженных ICA NP mPEG-ICA на мРНК IL-6. Данные представляют собой среднее значение ± SEM (* P <0,05 по сравнению с con; # P <0,05 по сравнению с LPS; & P <0,05 по сравнению с LPS + mPEG-ICA)

В этом исследовании мы проанализировали пригодность полимерных наночастиц для нагрузки ICA для лечения LPS-индуцированного повреждения клеток H9c2. Метод синтеза весьма осуществим и имеет много преимуществ. Во-первых, мПЭГ нетоксичен и обладает хорошей биосовместимостью [29]. В этом исследовании был использован метод химического связывания для сборки mPEG и ICA в полимер mPEG-ICA, а затем был использован диализ, чтобы физически обернуть ICA и сформировать стабильные наночастицы [30]. Наночастицы могут значительно улучшить растворимость ICA в воде и обеспечить длительную циркуляцию наночастиц в организме [31, 32]. По сравнению с наночастицами mPEG-ICA, наночастицы mPEG-ICA, нагруженные ICA, имеют много значительных преимуществ. Во-первых, их значение PDI меньше, что доказывает, что гранулометрический состав более однороден [33]. Во-вторых, эффективность загрузки лекарственного средства и эффективность инкапсуляции загруженных ICA НЧ mPEG-ICA выше, чем у НЧ mPEG-ICA, что упрощает достижение эффективной концентрации препарата ICA [34]. В растворе с pH 6,8 наночастицы выделяют больше лекарств, а кислая среда может разрушить силу самосборки наночастиц и ускорить расщепление сложноэфирных связей, что приведет к более быстрому высвобождению лекарственного средства в среду и эффективному обогащению лекарственного средства в среде. очаг воспаления [35, 36]. Хуанг и др. использовали LPS-индуцированные остеобласты для проверки модели для изучения противовоспалительного механизма икариина. Они обнаружили, что икариин может значительно повышать экспрессию BMP-2 и Runx2 в LPS-индуцированных остеобластах, тем самым достигая эффективных терапевтических эффектов [37]. Исследование показало, что ICA может подавлять воспалительную реакцию хондроцитов, вызванную LPS, и уменьшать образование коллагена [38]. Кроме того, ICA может также ингибировать сигнальный путь каспазы-1, опосредованный инфламмасомой NLRP3, и уменьшать LPS-индуцированное провисание [39]. Однако клетки, индуцированные LPS, не могут эффективно поглощать ICA. Создание наночастиц ICA может хорошо решить эту проблему. Возможно, что ICA загружается наноносителями, значительно увеличивая его растворимость в воде и позволяя ему проникать в клетки путем свободной диффузии. В то же время исследования показали, что наночастицы могут способствовать эндоцитозу клеток и оттоку тканевых клеток, а также значительно улучшать биодоступность ICA [40, 41].

Результаты анализа МТТ и экспериментов по высвобождению лактатдегидрогеназы показали, что нагруженные ICA НЧ mPEG-ICA могут эффективно уменьшать повреждение клеток, вызванное LPS, а нагруженные ICA НЧ mPEG-ICA могут высвобождать ICA из частиц. Кроме того, по сравнению с NP mPEG-ICA, загруженные ICA mPEG-ICA NP могут загружать больше ICA и легче высвобождаться. Мы также обнаружили, что эти наночастицы заметно снижают апоптоз, индуцированный LPS, чтобы облегчить воспалительный ответ в клетках H9c2. Более того, антиапоптотический эффект нагруженных ICA НЧ mPEG-ICA был лучше, чем у НЧ mPEG-ICA и ICA. Эти результаты показали, что наночастицы ICA могут защищать кардиомиоциты от воспалительного поражения.

Воспалительные цитокины являются ключевыми факторами, участвующими в развитии и прогрессировании сердечно-сосудистых заболеваний, и маркерами воспалительного ответа [42, 43]. Некоторые исследователи обнаружили, что TNF-α, IL-1β и IL-6 тесно связаны с сердечной функцией. Добавление этих воспалительных цитокинов к изолированным кардиомиоцитам приводило к нарушениям сердечной функции и способствовало потере кардиомиоцитов [44]. Наши результаты RT – qPCR показали, что загруженные ICA NP mPEG-ICA могут значительно ингибировать экспрессию мРНК TNF-α, IL-1β и IL-6. Таким образом, эти результаты предполагают, что защитные эффекты загруженных ICA НЧ mPEG-ICA могут проявляться посредством контроля воспалительных цитокинов.

Заключение

НЧ mPEG-ICA, нагруженные ICA, представляют собой новый тип наномедицины, успешно синтезированный с помощью нанотехнологий (сочетание химического синтеза и физического внедрения). Этот процесс не только превращает гидрофобное лекарственное средство ICA в водорастворимую наномедицину, но также успешно улучшает нагрузочную способность ICA. В слабокислом растворе высвобождение ICA из нагруженных ICA НЧ mPEG-ICA было больше, чем у нейтрального раствора, что указывает на то, что наночастицы имеют значение для лечения воспалительных сердечно-сосудистых заболеваний. Обработка наночастицами ICA эффективно защищает от LPS-индуцированного повреждения H9c2, повышает жизнеспособность клеток и ингибирует апоптоз клеток. Дальнейшие эксперименты показали, что новые НЧ mPEG-ICA, нагруженные ICA, могут высвобождать продукцию воспалительных цитокинов.

Доступность данных и материалов

Не применимо.

Сокращения

mPEG:

Монометиловый эфир полиэтиленгликоля

ICA:

Икариин

FT-IR:

Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье

ЯМР:

Спектроскопия ядерного магнитного резонанса

DLS:

Динамическое рассеяние света

ТЕМ:

Просвечивающий электронный микроскоп

TNF:

Фактор некроза опухоли

EPR:

Функции проницаемости и удерживания

SA:

Янтарный ангидрид

DMSO:

Дегидратированный диметилсульфоксид