Быстрый захват Escherichia coli в ультра-низких концентрациях с помощью положительно заряженных магнитных наночастиц

Аннотация

Быстрое, свободное от культуры обнаружение бактерий необходимо для своевременного контроля вспышек. Положительно заряженные магнитные наночастицы (NP⁺) используют естественный отрицательный заряд бактериальных клеток, обеспечивая эффективный захват Escherichia coli в концентрациях до 10 и 100 КОЕ/мл в течение одного часа. Эффективность захвата превышала 90% по подсчету колонийобразующих единиц (КОЕ). Передаточная электронная микроскопия (TEM) и оптическая визуализация подтвердили надежное связывание NP⁺ с бактериальными поверхностями, тогда как отрицательно заряженные частицы (NP⁻) показали пренебрежимую аффинность. Эти результаты демонстрируют, что электростатическое притяжение может обеспечить лиганд-независимую, широкоспектральную платформу бактериального захвата.

Предыстория

Инфекционные заболевания остаются приоритетом глобального здравоохранения, а водная бактериальная контаминация представляет значительный риск. E. coli, распространенный грам-отрицательный патоген, часто встречается в низких уровнях в зараженной воде и пище, затрудняя детекцию. Традиционные культурные методы затратны по времени, могут пропускать жизнеспособные, но некультивируемые (VBNC) клетки и задерживают критические вмешательства. Быстрые магнитные методы разделения предлагают быстрые, масштабируемые и автоматизируемые решения для удаления и детекции бактерий. Однако большинство магнитных систем полагаются на специфические лиганды, что может ограничивать охват захвата и требовать обширной оптимизации.

Внутренний отрицательный заряд бактериальных клеток, впервые задокументированный Беххольдом в 1904 г., лежит в основе электростатических взаимодействий с положительно заряженными наноматериалами. Недавняя работа (Cohen et al., 2011) показала, что отдельные клетки E. coli демонстрируют электрические спайки, подкрепляя роль мембранного потенциала в клеточно-поверхностных взаимодействиях. Используя это свойство, мы спроектировали полиэтиленимином (PEI)-функционализированные магнитные наночастицы для захвата бактерий в широком концентрационном диапазоне без зависимости от лигандов.

Материалы и методы

Наноматериалы

Реактивы из Shanghai Reagent Company и Sigma-Aldrich (США). Все растворы в Milli-Q деионизированной воде (18.2 МОм·см). Разветвленный PEI (Мв = 10 000, 99%) от Alfa Aesar.

Синтез наночастиц

Fe₃O₄ ядра синтезировали солвотермально при 200 °C 12 ч. Кремнеземистая оболочка через гидролиз TEOS, с последующим графтированием APTES-TRITC комплекса для флуоресценции. Отрицательно заряженные наночастицы (NP⁻) получали сохранением APTES поверхности; положительно заряженные (NP⁺) — покрытием NP⁻ PEI, дающим обильные поверхностные амины.

Характеризация наночастиц

TEM (300 кВ) подтвердило ядро-оболочку морфологию и ~450 нм диаметр. Динамическое световое рассеяние (DLS) дало гидродинамические диаметры 620 нм (NP⁺) и 700 нм (NP⁻). дзета-потенциал: −26.6 мВ для NP⁻ и +28.1 мВ для NP⁺ в нейтральном буфере, указывая на стабильную дисперсию, пригодную для бактериального захвата.

Подготовка бактерий

Штамм BL21 E. coli культивировали в LB среде при 37 °C, 200 об/мин 16 ч. После серийного разбавления и посева считали КОЕ. Клетки собирали центрифугированием, вымывали в ФСБ и ресуспендировали при ~1×10³ КОЕ/мл. Все манипуляции соответствовали БСЛ-2 протоколам.

Эксперимент по захвату бактерий

В 1 мл ФСБ суспензии 40 мкг NP⁺ или NP⁻ смешивали с бактериями и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Постоянный магнит притягивал NP-связанные клетки к стенке пробирки, после чего несвязанные клетки вымывали. Захваченные бактерии высвобождали снятием магнита и ресуспендировали для последующих анализов.

Эффективность захвата бактерий наночастицами при разных концентрациях

Эффективность захвата квантифицировали посевом полного раствора и подсчетом КОЕ. Эксперименты в диапазоне 5–100 мкг/мл NP⁺ или NP⁻ с бактериальной нагрузкой 2×10² КОЕ/мл.

Способность наночастиц захватывать бактерии в низких концентрациях

Для оценки ультранизкоуровневой производительности 40 мкг NP⁺ или NP⁻ инкубировали с 1 мл ФСБ, содержащим 10 или 100 КОЕ/мл E. coli. Эффективности захвата снова определяли пересчетом КОЕ.

Статистический анализ

Данные как среднее ± SD. Двухфакторный дисперсионный анализ с пост-хок тестом (GraphPad Prism) определял значимость при p < 0.05.

Результаты

Характеризация магнитных наночастиц

Схема на рис. 1 иллюстрирует поэтапную фабрикацию NP⁻ и NP⁺. TEM подтверждает равномерное SiO₂ покрытие (~60 нм) вокруг ~450 нм Fe₃O₄ ядра. DLS показывает узкие распределения размеров; дзета-потенциал подтверждает успешную поверхностную функционализацию (рис. 2).

Способность магнитных наночастиц захватывать E. coli

Рисунок 3 описывает рабочий процесс захвата: инкубация NP-бактерии, магнитное притяжение, промывка, высвобождение. NP⁺ быстро обогащали E. coli, тогда как NP⁻ показывали пренебрежимое связывание (рис. 3).

Оптическая визуализация (рис. 4) показывает NP⁻ как монодисперсные, а NP⁺ — агрегированные, отражая различные режимы взаимодействия. Флуоресцентная микроскопия подтверждает ко-локализацию TRITC-маркированных NP⁺ с DAPI-окрашенными E. coli (рис. 5a). TEM раскрывает обширные кластеры NP⁺ на бактериальных клеточных стенках (рис. 5b), подчеркивая сильную электростатическую аффинность.

Детекция низких концентраций E. coli

Увеличение дозы NP⁺ от 5 до 100 мкг/мл давало дозозависимую эффективность захвата (рис. 6). При 40 мкг/мл NP⁺ достигали 81% эффективности (p < 0.001), тогда как NP⁻ захватывали только 12% даже при 100 мкг/мл.

В ультра-низких нагрузках (10 и 100 КОЕ/мл) NP⁺ последовательно восстанавливали >90% клеток (рис. 7), тогда как NP⁻ восстанавливали <4%. Результаты валидируют превосходную электростатическую способность захвата NP⁺.

Обсуждение

Грам-отрицательные и грам-положительные бактерии демонстрируют сильное электростатическое притяжение к положительно заряженным поверхностям. PEI-функционализированные NP⁺ предлагают обильные аминовые группы, дающие +28.1 мВ заряд поверхности, способствующий быстрому связыванию даже при <10² КОЕ/мл. Это исследование демонстрирует простой одногасовой протокол, захватывающий E. coli при 10 КОЕ/мл — далеко ниже детекционных пределов конвенциональных обогащающих методов.

Зарядозависимые эффективности захвата были очевидны: NP⁺ до 81% при 40 мкг/мл, в то время как NP⁻ оставались неэффективными. TEM подтвердил крупные агрегаты NP⁺ на бактериальных поверхностях, предполагая, что размер и заряд поверхности синергетически усиливают захват.

Хотя грам-положительные и грам-отрицательные клетки отличаются структурно, обе поддерживают чистый отрицательный заряд поверхности при физиологическом pH из-за липополисахаридов или техоевых кислот. Более крупные NP⁺ (>600 нм) обеспечивают «губка-эффект» — большая площадь поверхности облегчает более обширные электростатические взаимодействия, тогда как более мелкие частицы могут быть ограничены сниженным покрытием поверхности. Таким образом, наш дизайн приоритизирует эффективность захвата над антимикробной активностью.

Заключение

PEI-покрытые магнитные наночастицы предлагают быстрый, лиганд-независимый метод захвата и анализа E. coli в ультра-низких концентраций. Подход дает высокое восстановление (>90%) в течение одного часа, а захваченные бактерии легко визуализируются оптической и TEM микроскопией. Платформа адаптируема к широкому спектру бактериальных патогенов, обеспечивая быструю диагностику и деконтаминацию в клинических и экологических условиях.