Формо-зависимая цитотоксичность и клеточный захват золотых наночастиц, восстановленных экстрактом зеленого чая, в раковых клетках

Аннотация

В настоящем отчете три разных формы хитозан-каппированных золотых наночастиц (наносферы, нано звезды, наностержни) синтезировали для исследования влияния формы на цитотоксичность и клеточный захват в раковых клетках. Экстракт зеленого чая использовали как восстанавливающее агент для редукции золотых солей в золотые наносферы. Золотые нано звезды готовили из заранее приготовленного раствора наносфер как зародышевого раствора. Золотые наностержни синтезировали обычным методом. Все три типа золотых наночастиц показали характерные полосы поверхностного плазмонного резонанса при УФ-виз спектрофотометрии. В высокоразрешающих ТЭМ изображениях решеточные структуры четко наблюдались во всех трех формах, подтверждая кристаллическую природу наночастиц. Все три коллоидных раствора сохраняли коллоидную стабильность в различных растворах. Для оценки цитотоксичности проводили MTT анализ на четырех линиях раковых клеток. Цитотоксичность была наивысшей для наностержней, затем нано звезд и наконец наносфер. Клеточный захват золотых наночастиц в клетках человеческой гепатоцеллюлярной карциномы (HepG2) измеряли, результаты следовали порядку: наносферы > наностержни > нано звезды. Результаты текущего исследования могут помочь в дизайне формы золотых наночастиц для терапевтических применений как носителей лекарств в наномедицине.

Введение

Растения содержат естественные первичные и вторичные метаболиты: флавоноиды, сапонины, алкалоиды, стероиды, кумарины, таннины, фенолы, терпеноиды, углеводы, белки, аминокислоты. Недавно растения экстракты используют для синтеза наноматериалов, в частности металлических наночастиц: золота, серебра, титана оксида, меди, палладия, цинка оксида, платины [1]. Разнообразные фитохимики активно участвуют в конвертации металлических солей в металлические наночастицы как восстанавливающие агенты. Кроме того, растительные экстракты играют роль стабилизирующих агентов для поддержания коллоидной стабильности металлических наночастиц в растворе. Химические восстановители обычно токсичны для живых организмов. Напротив, использование растительных экстрактов в синтезе металлических наночастиц — зеленое, экологически чистое, устойчивое. Различные части растений — стебли, плоды, семена, листья, цветы — используют для синтеза металлических наночастиц [1, 2]. Обширные обзоры охватывают зеленый синтез золотых наночастиц (AuNPs) с использованием растительных экстрактов как восстановителей [2–4]. Эта зеленая стратегия выполняется в один шаг и в одной посудине. Процесс прост, удобен, дешев и экологичен. Размер, форма и топография AuNPs зависят от концентраций золотых солей и экстрактов, времени реакции, температуры, pH. Спектроскопические и микроскопические техники характеризуют AuNPs: УФ-виз спектрофотометрия, XRD, FT-IR, TEM, AFM, SEM, гидродинамические размеры и дзета-потенциал. Эти зеленые AuNPs применяют как катализаторы, антиоксиданты, антимикробные и противопухолевые агенты [5–8].

В лаборатории авторов использовали экстракты растений (Artemisia capillaris, Leonurus japonicus, Polygala tenuifolia, Caesalpinia sappan, Bupleurum falcatum, Garcinia mangostana) как восстановители для зеленого синтеза AuNPs и AgNPs [9–18]. Воздушная часть A. capillaris использовали для AgNPs и AuNPs [9, 15, 16]. Приготовленные AgNPs проявляли отличную антибактериальную активность против E. coli, Enterobacter cloacae, P. aeruginosa, Klebsiella aerogenes, K. oxytoca по сравнению с экстрактом alone [15]. Это указывало на синергетический эффект комбинации AgNPs и экстракта. Интересно, AgNPs, синтезированные с A. capillaris в присутствии цетилтриметиламмония бромида, показывали активность против метициллиноустойчивого S. aureus [16]. Более того, AuNPs с A. capillaris показывали каталитическую активность к реакции восстановления 4-нитрофенола [9]. L. japonicus экстракт для AgNPs с замечательным усилением антибактериальной активности [10]. Наблюдали, что активность против грамотрицательных бактерий выше, чем против грампозитивных. Корневой экстракт P. tenuifolia также для AuNPs и AgNPs [11, 17]. Улучшенная антикоагулянтная и антибактериальная активность наблюдались в AuNPs и AgNPs соответственно, синтезированных с P. tenuifolia. Наиболее интересно, AgNPs с C. sappan экстрактом показывали эффективную антибактериальную активность против МРСА [18]. Экстракт G. mangostana производил асимметричные гантелевидные AgNPs с апоптотическим эффектом [14].

Предыдущие отчеты изучали зеленый синтез AuNPs и AgNPs с использованием чайного листового экстракта [19–23]. Камал и соавт. сообщили об успешном синтезе 25 нм AgNPs [19]. В другом отчете сферические AgNPs 20–90 нм синтезировали чайным листовым экстрактом [20]. Синтезированные AgNPs показывали легкую антибактериальную активность против E. coli. Сферические AgNPs 3,42–4,06 нм также приготовили Лу и соавт. с чайным листовым экстрактом [21]. Васихаран и соавт. антибактериальные AgNPs с чайным листовым экстрактом [22]. Синтезированные AgNPs эффективны против патогенного Vibrio harveyi. Бегум и соавт. использовали черный чайный листовой экстракт для синтеза AuNPs и AgNPs [23]. До сих пор в основном сферические AgNPs синтезировали чайным листовым экстрактом.

В настоящем отчете хитозан использовали как каппирующий агент для AuNPs. Хитозан исследовали как носитель лекарств/генов благодаря высокой биосовместимости, низкой аллергенности, биоразлагаемости, низкой токсичности [24–26]. Хитозан происходит из хитина, обильного в экзоскелетах насекомых и ракообразных (крабы, лобстеры, креветки). Хитин — полисахарид из N-ацетил-D-глюкозамина, связанного β(1-4) гликозидными связями. Хитозан получают из хитина гетерогенным N-деацетилированием. Сам хитозан обладает антибактериальной, антигрибковой, противоопухолевой и антиоксидантной активностью [25]. Как каппирующий агент, хитозан непосредственно контактирует с AuNPs через электростерический механизм [26]. Хитозановые наночастицы влияют на механизм клеточного захвата A549 клетками без изменения цитотоксичности [24]. Степень деацетилирования хитозана более влиятельна, чем молекулярный вес, на клеточный захват и цитотоксичность [24].

Большинство исследований фокусировались на синтезе сферических AgNPs с чайным листовым экстрактом. Здесь экстракт зеленого чая использовали для синтеза золотых наносфер и нано звезд. Наносферы использовали как семена для seed-mediated синтеза нано звезд. Для сравнения наностержни синтезировали обычным конвенциональным методом [27]. Три разных формы AuNPs (наносферы, нано звезды, наностержни) каппировали хитозаном для повышения биосовместимости и коллоидной стабильности. Характеризовали УФ-виз спектрофотометрией, HR-TEM, FT-IR. Гидродинамические размеры DLS и дзета-потенциал измеряли до и после каппирования хитозаном. Коллоидную стабильность оценивали в солевых растворах, буфере, клеточной среде. Для цитотоксичности применяли MTT анализ к четырем раковым клеткам: AGS (человеческие желудочные аденокарциномы), HeLa (человеческие эпителиальные шейки матки аденокарциномы), HepG2 (человеческие гепатоцеллюлярные карциномы), HT29 (человеческие колиоректальные аденокарциномы). Клеточный захват AuNPs в HepG2 количественно измеряли ICP-OES и LA-ICP-MS.

Материалы и методы

Материалы и инструментарий

Хлорауриновая кислота тригидрат (HAuCl₄·3H₂O), цетилтриметиламмоний бромид (CTAB), хитозан (из раковин креветок, ≥75% деацетилирован), MTT закупали у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, США). Остальные реагенты аналитического качества. УФ-виз спектры на Shimadzu UV-1800 или UV-2600 в кварцевой кювете. Гидродинамические размеры DLS и дзета-потенциал на NanoBrook 90Plus Zeta (Brookhaven Instruments). FT-IR на Varian 640 IR (Agilent Technologies) методом KBr таблетки. HR-TEM на JEM-3010 при 300 кВ (JEOL); образец на углерод-покрытой медной сетке (300 mesh, Ted Pella), сушили при 37 °C 24 ч. Ультразвук на WUC-A22H (Daihan Scientific). Центрифуга 5424R (Eppendorf) и FD8518 (IlshinBioBase) для центрифугирования и сублимации. Для клеточного захвата AuNPs: Optima 8300 ICP-OES (PerkinElmer) и J200 Tandem LA-ICP-MS (Applied Spectra).

Подготовка экстракта зеленого чая

Институт Хадонг зеленого чая (Хадонг, Гённам, Корея) любезно предоставил сушеные листья зеленого чая. Блендером приготовили порошок сушеных листьев. Экстракция: смешивали деионизированную воду (2 л) и порошок листьев (200 г). Экстракция 1 ч ультразвуком при комнатной температуре с тремя повторениями. Фильтровали через бумагу Whatman для удаления нерастворимых материалов. Затем центрифугировали (3000g, 18 °C, 25 мин), собирали supernatент. Супернатент шприц-фильтровали, фильтрат сублимировали. Сухосублимированный материал растворили в деионизированной воде для создания стокового раствора конечной концентрации 2% (м/об) для зеленого синтеза ниже.

Синтез золотых наносфер с использованием экстракта

Процесс синтеза наносфер иллюстрирован Рис. 1а. Использовали стоковый раствор предыдущего раздела. В стеклянной флаконе смешивали экстракт (конечная концентрация 0,03%) и хлорауриновую кислоту тригидрат (0,5 мМ), добавляли гидроксид натрия (1 мМ). Деионизированную воду доводили до конечного объема 2 мл. Инкубацию в суховой печи при 80 °C 2 ч. SPR наносфер мониторили УФ-виз спектрами 300–800 нм. Наносферы также использовали как семена для синтеза нано звезд в следующем разделе.

Синтез золотых нано звезд

Процесс нано звезд на Рис. 2а. Наносферы (50 мкл) из предыдущего раздела мешали (750 об/мин) магнитным бариком на горячей пластине при комнатной температуре. Хлорауриновая кислота (0,25 мМ, 5 мл) добавляли. Через 15 с одновременно добавляли два раствора: нитрат серебра (1 мМ, 50 мкл) и аскорбиновую кислоту (свежеприготовленную, 100 мМ, 25 мкл). Затем мешали 750 об/мин 5 мин. УФ-виз спектры 300–1100 нм.

Синтез золотых наностержней

Процесс наностержней на Рис. 3а. Для синтеза наностержней seed-mediated синтез по предыдущему отчету с незначительными модификациями [27]. Раствор роста: в 20 мл стеклянной флаконе хлорауриновая кислота (10 мМ, 500 мкл) и CTAB (100 мМ, 9,5 мл) смешивали. Раствор желтовато-коричневый. Добавляли аскорбиновую кислоту (100 мМ, 55 мкл), мешали до окраски из желтовато-коричневого в бесцветный. Нитрат серебра (10 мМ, 100 мкл) добавляли и встряхивали 10 с. Финальный раствор — раствор роста. Зародышевой раствор: в 20 мл флаконе хлорауриновая кислота (10 мМ, 250 мкл) и CTAB (100 мМ, 9,75 мл) смешивали. Затем ледяной свежеприготовленный борагидрид натрия (10 мМ, 600 мкл) добавляли и вихревали 2 мин. Раствор — зародышевой. Зародышевой раствор (12 мкл) смешивали с раствором роста. УФ-виз спектры 400–900 нм.

Хитозановое каппирование наносфер, нано звезд, наностержней

Хитозановое каппирование для повышения коллоидной стабильности и биосовместимости AuNPs. Хитозан растворяли в 1% уксусной кислоте, конечная концентрация 0,01%. Ультразвуком полностью растворяли хитозан; этот раствор — сток для каппирования. И наносферы, и нано звезды каппировали стоком хитозана (0,01%). Сток хитозана (30% об/об) смешивали с AuNP раствором (70% об/об). Смесь мешали 900 об/мин 2 ч для завершения каппирования. Для наностержней избыток CTAB использовали, поэтому центрифугировали (14000 об/мин, 15 мин, 25 °C) для удаления CTAB. Наностержни восстанавливали из осадка, каппирование хитозаном проводили как выше. Затем снимали УФ-виз спектры.

Оценка коллоидной стабильности

Коллоидная стабильность наночастиц важна для in vitro и in vivo применений. Три типа AuNPs с хитозановым каппированием и наносферы без каппирования оценивали в растворах: деионизированная вода, 5% BSA, 5% NaCl, PBS (pH 7,4), DMEM, полная среда (DMEM с 10% FBS). 1 мл каждого AuNP смешивали с тестовым раствором (0,5 мл). Инкубировали 25 °C 30 мин, снимали УФ-виз спектры.

Клеточная культура и цитотоксичность

Раковые линии клеток AGS, HeLa, HepG2, HT29 приобрели в Korean Cell Line Bank (Сеул, Корея). MTT анализ для оценки in vitro цитотоксичности AuNPs. DMEM с пируватом натрия. Среда: 10% FBS, 2 мМ L-глутамин, 1% пенициллин (100 ед/мл), стрептомицин (100 ед/мл). Клетки культивировали в 100-мм блюдцах, поддерживали ~70% конфлюэнтность. Перед культурой AuNPs трех форм подвергали вакуумной испарке для конечной Au концентрации 5 мМ. В 96-колодчатых пластинках посеяли клетки 5,0×10³ клеток/колодез, инкубировали 24 ч при 37 °C, 5% CO₂. Затем обрабатывали пятью концентрациями AuNPs (500, 250, 125, 62,5, 31,25 мкМ) и инкубировали еще 24 ч. Добавляли MTT реагент (5 мкл, 5% в деионизированной воде), инкубировали 3 ч при 37 °C, 5% CO₂. Абсорбцию измеряли при 570 нм мульти-детектором (Synergy HT, Bio Tek). Необработанные клетки — контроль.

Клеточный захват

Клеточный захват каждого типа AuNPs количественно измеряли HepG2 клетками. В 24-колодчатых пластинках посеяли 5,0×10⁴ клеток/колодез, инкубировали 24 ч. Затем обрабатывали 5 мкМ (конечная концентрация) каждого AuNP и инкубировали 24 ч. После инкубации удаляли раствор с избытком AuNPs, клетки трипсинизировали. Au концентрацию в трипсинизированных клетках количественно измеряли ICP-OES и LA-ICP-MS, получая концентрацию Au захвата в клетках. Контроль — 5 мкМ исходного коллоидного раствора каждого AuNP, также анализировали ICP-OES и LA-ICP-MS для Au концентрации.

Результаты и обсуждение

УФ-виз спектры

УФ-виз спектры обычно снимают для подтверждения синтеза AuNPs. Характеристический SPR AuNPs наблюдается в видимом-ближнем ИК диапазоне. Каппирование AuNPs обычно вызывает батохромный (красный) или гипсохромный (синий) сдвиг. Также гипохромный сдвиг обычно сопровождает красные и синие сдвиги. На Рис. 1б УФ-виз спектры мониторили 300–800 нм. Наносферы показали характерный SPR 532 нм с глубоким бургундовым цветом. После хитозанового каппирования наносфер максимальный SPR красносдвинулся до 537 нм вместе с гипохромным сдвигом (Рис. 1б). Широкий диапазон SPR 600–800 нм с темно-синим раствором для нано звезд (Рис. 2б). Хитозановое каппирование нано звезд дало гипохромный сдвиг, абсорбция ниже, чем без каппирования (Рис. 2б). Наностержни показали два отдельных SPR: 514 нм и 815 нм, с образованием светло-розового раствора (Рис. 3б). Хитозановое каппирование наностержней вызвало синий сдвиг до 797 нм вместе с гипохромным сдвигом (Рис. 3б). Учитывая все результаты, каппирование AuNPs хитозаном меняло SPR длину волны и вызывало сдвиги. Тщательный осмотр УФ-виз спектров показал, что три типа AuNPs успешно каппированы хитозаном.

Гидродинамические размеры и дзета-потенциалы

Измеряли гидродинамические размеры и дзета-потенциалы; результаты в Таблице 1. Без хитозанового каппирования гидродинамические размеры наносфер и нано звезд — 28,4 и 97,8 нм. Гидродинамический размер наностержней не измеряли, так как он хорошо подстроен под сферические формы. С хитозановым каппированием гидродинамический размер увеличился до 190,7 нм для наносфер и 123,9 нм для нано звезд. Увеличение гидродинамического размера подтвердило каппирование. Изменение дзета-потенциалов также отразило каппирование на поверхности AuNPs. Хитозан — положительно заряженный полисахарид; каппирование хитозаном дало положительные дзета-потенциалы для всех трех типов AuNPs. Для наносфер дзета-потенциал изменился от −12,73 до 42,28 мВ. Для нано звезд — от −42,46 до 47,44 мВ. Для наностержней CTAB (катионный поверхностно-активный) использовали для синтеза, поэтому исходный дзета-потенциал 27,96 мВ без каппирования. Хитозановое каппирование наностержней увеличило дзета-потенциал до 33,23 мВ. Изменение дзета-потенциалов с отрицательных на положительные для наносфер и нано звезд четко указывало на успешное каппирование хитозаном. Более того, увеличение дзета-потенциала наностержней предполагает, что поверхность была каппирована хитозаном.

HR-TEM изображения

Микроскопия критична для наночастиц, давая информацию о размере и форме. Инструменты микроскопии дают детальную информацию: состояние дисперсии, 2D и 3D морфологию и топографию, относительную мягкость/твердость материалов. Наносферы измеряли 8,7 ± 1,7 нм, по среднему 75 случайно выбранных дискретных наночастиц на HR-TEM (Рис. 4). Наиболее частый размер 8–9 нм (29,3%), затем 9–10 нм (12,0%). С хитозановым каппированием форма наносфер сохранялась без изменения (Рис. 4c,d). Кристаллическая природа частиц четко указывала решетчатая структура на Рис. 4d. Расстояние между соседними решеточными плоскостями 0,24 нм (Рис. 4d). Более того, хитозановый слой также визуализирован, как показано красными стрелками на Рис. 4d. Нано звезды визуализированы HR-TEM (Рис. 5). Нано звезды 99,0 ± 47,0 нм, среднее 19 дискретных наночастиц. Решетчатая структура на увеличенном изображении (Рис. 5c). Расстояние между соседними решеточными плоскостями 0,24 нм (Рис. 5c). Красные стрелки на Рис. 5c указывают на хитозановый слой. Наностержни визуализированы Рис. 6. Средняя длина и ширина частиц 60,4 нм и 16,4 нм по измерениям 28 частиц. Соотношение сторон (длина/ширина) = 3,7. Решетчатая структура на Рис. 6c подтверждает кристаллическую структуру наностержней. Расстояние между соседними решеточными плоскостями 0,23 нм (Рис. 6c). Красные стрелки показывают хитозановый слой (Рис. 6c).

FT-IR спектры

Зеленый чай содержит разнообразные первичные и вторичные метаболиты. Основные констуитуенты — полифенолы: эпигаллокatekoчин-3-галлат, (-)-эпикатехин-3-галлат, (-)-эпигаллокatekoчин, (-)-эпикатехин [28]. FT-IR спектры для получения информации о функциональных группах, участвующих в синтезе AuNPs. Сравнивали FT-IR спектр наносфер с спектром экстракта (Рис. 7). Основная функциональная группа, скорее всего участвующая в реакции восстановления Au солей — –OH. В экстракте –OH группы появлялись при 3255 см⁻¹ (Рис. 7а). При синтезе этот пик сдвигался к более высоким волновым числам 3300–3341 см⁻¹. Это показало, что –OH группы из полифенолов окисляются к C=O, восстанавливая Au соли в AuNPs. Заметно, появление C=O функциональных групп при 1716 см⁻¹ в наносферах четко подтвердило окисление –OH групп во время синтеза (Рис. 7б).

Оценка коллоидной стабильности в различных растворах

Коллоидная стабильность наночастиц важна для диагностических и терапевтических применений. Тестировали шесть растворов: (i) деионизированная вода, (ii) NaCl (5%), (iii) PBS (pH 7,4), (iv) BSA (5%), (v) DMEM, (vi) полная среда (DMEM с 10% FBS). После смешивания каждого AuNP с тестовым раствором снимали УФ-виз спектры; результаты в Таблице 2 и Рис. 8. Гипохромный сдвиг вместе с легким красным или синим сдвигом наблюдался для всех трех типов AuNPs (Рис. 8a,c,e). Форма спектров сохранялась, агрегации коллоидного раствора не наблюдалось (Рис. 8b,d,f). Это показало, что коллоидная стабильность хорошо сохраняется в упомянутых тестовых растворах.

В Таблице 2 гипохромный сдвиг выражен процентом сохраненной абсорбции, абсорбция исходного раствора = 100%. Во всех трех AuNPs коллоидная стабильность лучше всего сохранялась в полной среде, использованной для последующих экспериментов по цитотоксичности: наносферы (65,3%), нано звезды (93,4%), наностержни (80,2%). Белковый раствор BSA (5%) также давал разумную стабильность: наносферы (61,8%), нано звезды (70,2%), наностержни (72,0%). Эти результаты указывали, что белки, покрывающие наночастицы, имеют дополнительный благоприятный эффект на коллоидную стабильность AuNPs вместе с хитозановым каппированием. Коллоидная стабильность наносфер без хитозанового каппирования также оценивалась (Рис. 8g,h). Все растворы вызывали гипохромный сдвиг. Среди тестированных растворов только NaCl (5%) показывал большой красный сдвиг вместе с гипохромным сдвигом.

Цитотоксичность

MTT анализ для измерения цитотоксичности против четырех типов раковых клеток (Рис. 9): AGS, HeLa, HepG2, HT29. Цитотоксичность всех трех типов AuNPs зависела от Au концентрации. Среди четырех типов клеток наивысшая цитотоксичность наблюдалась для HepG2. Более того, наностержни показывали наивысшую токсичность против четырех типов клеток, затем нано звезды, и наконец наносферы. Конкретно, наностержни показывали очень высокую токсичность; поэтому цитотоксичность наностержней при низком диапазоне Au концентраций также оценивали (Рис. 9е). При концентрациях всего 8 мкМ Au наностержни показывали концентрационно-зависимую цитотоксичность. Против HepG2 клеток IC₅₀ составлял 127,1 мкМ Au для наносфер, 81,8 мкМ Au для нано звезд, 22,7 мкМ Au для наностержней. Таким образом, наностержни были наиболее цитотоксичными, затем нано звезды, наносферы — наименее цитотоксичными против HepG2.

Сообщалось, что цитотоксичность AuNPs влияют размер, форма, заряд поверхности [29, 30]. Фави и соавт. исследовали цитотоксичность Au наносфер (61 нм) и Au нано звезд (34 нм) против двух типов клеток (человеческие фибробласты кожи и эндотелиальные клетки жировой подушки крысы) [31]. В обоих типах клеток летальная концентрация наблюдалась при 40 мкг/мл для наносфер и 400 мкг/мл для нано звезд. Их результаты предполагали, что наносферы более цитотоксичны, чем нано звезды, предполагая, что размер, форма, поверхностная химия наиболее вероятно влияют на цитотоксичность AuNPs. Возняк и соавт. сообщали о цитотоксичности AuNPs разнообразных форм против HeLa и HEK293T (человеческие эмбриональные почечные клетки): наносферы (~10 нм), наноцветы (~370 нм), наностержни (~41 нм), нанопризмы (~160 нм), нано звезды (~240 нм) [30]. Интересно, наносферы и наностержни были более цитотоксичны, чем наноцветы, нанопризмы, нано звезды. Авторы объяснили, что малый размер наночастиц и процесс агрегации были главными движущими силами цитотоксичности наносфер и наностержней. Многие исследования адресуют размерный эффект AuNPs на цитотоксичность [32, 33]. По мере уменьшения AuNPs их захват клетками увеличивается. Более высокий захват приводит к более высокой концентрации AuNPs в клетке, что ведет к более высокой цитотоксичности. Однако низкая концентрация AuNPs в клетке также показывает высокую цитотоксичность [34]. Концентрация AuNPs в клетке влияет на цитотоксичность; однако жизненно важно учитывать и понимать характеристики AuNPs. Цитотоксичность AuNPs двух форм (наносферы 43 нм, наностержни 38×17 нм) оценивалась в эпителиальных клетках Тарантолой и соавт. [35]. Наносферы определили более цитотоксичными, чем наностержни. Более того, наносферы индуцировали дисфункцию эпителиальных клеточных мембран, измеренную электрическим подложением импедансного сенсирования [35]. Как обсуждалось, многие исследования исследуют цитотоксичность разных форм AuNPs в различных клетках. Хотя формы AuNPs могут оставаться теми же, многие факторы все еще влияют на цитотоксичность. При оценке цитотоксичности следует учитывать размер, форму, физикохимические поверхностные свойства, концентрацию, время воздействия, тип клетки [34, 36–38]. Помимо характеристик AuNPs, цитотоксические механизмы: разрушение клеточной мембраны, оксидативный стресс, разрушение цитosкелета, потеря митохондриальной функции также важны [38, 39]. В настоящее время аутофагия и лизосомальная дисфункция становятся объяснениями цитотоксичности наноматериалов [40]. В лизосомах наноматериалы индуцируют цитотоксичность лизосомально-железо-опосредованным оксидативным стрессом и выделением катепсинов и других лизосомальных гидролаз, вызывая митохондриальную дисфункцию и гибель клетки. В текущем отчете наностержни были наиболее цитотоксичны против четырех типов раковых клеток. Следовательно, будущая работа будет изучать детальные механизмы цитотоксичности.

Клеточный захват HepG2 клетками

HepG2 клетки показали наивысшую цитотоксичность среди четырех типов раковых клеток; соответственно, выбрали этот тип для оценки клеточного захвата. Два инструмента, ICP-OES и LA-ICP-MS, количественно анализировали Au концентрацию в клетках, результаты на Рис. 10. Au концентрация 5 мкМ использовали для оценки клеточного захвата, так как при этой концентрации не наблюдалась токсичность среди четырех типов раковых клеток. Захват был наивысшим для наносфер (58,0%), затем наностержней (52,7%) и нано звезд (41,5%). Как указано ранее, цитотоксичность зависела от формы частиц (наностержни > нано звезды > наносферы). Однако порядок клеточного захвата (наносферы > наностержни > нано звезды) не совпадал с порядком цитотоксичности. Клеточный захват наносфер был наивысшим; однако цитотоксичность этих частиц была наименьшей. Эти результаты предполагают, что высокий клеточный захват не всегда индуцирует высокую цитотоксичность. Как упоминалось ранее, разнообразные факторы: размер, форма, физикохимические поверхностные свойства, концентрация, время воздействия, тип клетки важны для влияния на цитотоксичность.

Различные степени захвата трех типов AuNPs (41,5–58,0%) возможно зависят от конкуренции между обертыванием (как мембрана окружает наночастицу) под термодинамической движущей силой и кинетикой диффузии рецепторов [41, 42]. Читрани и Чан сравнили клеточный захват трансферрином-каппированных Au наносфер и Au наностержней HeLa клетками [42]. При одинаковом размере (диаметр наносферы = ширина наностержня) наносферы показывали более высокий захват, чем наностержни. Это согласуется с нашими наблюдениями более высокого захвата наносфер по сравнению с наностержнями. Для захвата наностержней ширина важнее длины, и увеличение соотношения сторон уменьшает скорость захвата [42]. Размер нано звезд 99,0 ± 47,0 нм делает их крупнейшими частицами среди трех типов AuNPs. Для крупных наночастиц (>50 нм) медленная кинетика диффузии рецепторов приводит к коротким временам обертывания [42]. Таким образом, клеточный захват крупных наночастиц низок, т.е. нано звезды в текущем отчете. Хитозан использовали для каппирования AuNPs для повышения коллоидной стабильности и биосовместимости. Хитозановое каппирование также может играть роль в клеточном захвате AuNPs взаимодействуя с рецепторами на поверхности клетки. Детальное механистическое изучение необходимо для прояснения этого вопроса.

Заключение

Продолжающееся развитие нанотехнологий требует тщательного дизайна формы и размера наночастиц для успешных применений, включая носители лекарств или транспортные средства для биологически активных соединений, таких как противоопухолевые агенты. Экстракт зеленого чая использовали как зеленый восстановитель для синтеза Au наносфер и нано звезд. Интересно, цитотоксичность наностержней была выше, чем наносфер и нано звезд, в то время как наносферы показывали наименьшую цитотоксичность против четырех типов раковых клеток. Клеточный захват HepG2 клетками, скорее всего, зависел от формы и размера; наносферы показывали наивысший захват, тогда как нано звезды — наименьший. Оптимизация размера и формы вместе с поверхностной модификацией и функционализацией приведет к разработке наночастиц для будущего использования в наномедицине.

Аббревиатуры

AFM

Атомно-силовая микроскопия

AgNPs

Серебряные наночастицы

AGS

Человеческие желудочные аденокарциномы

AuNPs

Золотые наночастицы

CTAB

Цетилтриметиламмоний бромид

DLS

Динамическое рассеяние света

DMEM

Модифицированное среднее Дюльбекко

FBS

Фетальная бычья сыворотка

FT-IR

Фурье-преобразование инфракрасной спектроскопии

HeLa

Человеческие эпителиальные шейки матки аденокарциномы

HepG2

Человеческие гепатоцеллюлярные карциномы

HR-TEM

Высокоразрешающая проходная электронная микроскопия

HT29

Человеческие колиоректальные аденокарциномы

ICP-OES

Индуктивно связанная плазма оптическая эмиссионная спектроскопия

LA-ICP-MS

Лазерная абляция индуктивно связанная плазма масс-спектрометрия

SEM

Расканирующая электронная микроскопия

SPR

Поверхностный плазмонный резонанс