Оптимизация потоковой цитометрии с визуализацией для количественной оценки кинетики и специфичности поглощения внеклеточных везикул HEK293T

Материалы и методы

Клеточные культуры

Клетки человеческой эмбриональной почки (HEK293T) приобретены в ATCC и культивировались в DMEM с 10% фетальной телячьей сывороткой, 100 ЕД/мл pénicillin и 100 мкг/мл стрептомицин. Человеческие нейронные стволовые клетки (hNSC), нейронные клетки SH-SY5Y, эпителиальные клетки печени C3A, эндотелиальные клетки пуповины человека (HUVEC) и нейроны культивировались в стандартных условиях при 37 °C, 5% CO₂ до анализов поглощения ВКВ.

Маркировка и изоляция ВКВ

Плазмида CD63-eGFP получена из Addgene (#62964). Клетки HEK293T культивировали до 70% конфлюенции в 10-см блюдцах, транфектовали 10 мкг плазмидной ДНК с помощью Lipofectamine 2000 по протоколу производителя. Через 24 часа после транфекции среду заменили на стандартную среду HEK293T без фетальной телячьей сыворотки и собирали в течение 3 последовательных дней. Как описано ранее [3], среду HEK293T фильтровали через 0,22-мкм фильтр и обогащали ультрафильтрацией с использованием центрифужных блоков Amicon с регенерированной целлюлозой 100 кДа, дважды промывая PBS++. ВКВ концентрировали до 1 мл, концентрацию и распределение размеров измеряли на Nanosight NS300 по протоколу производителя (Malvern, UK). ВКВ изолировали из разных сосудов культивирования HEK293T, каждый сосуд считался отдельным биологическим репликатом, с тремя техническими репликатами в каждом (минимум 9 образцов на условие).

Анализа поглощения

Реципиентные линии клеток посеяли при 60% конфлюенции в 6-колончатых пластинках на 24 ч в стандартных условиях при 37 °C. Стандартную среду заменили на безсывороточную (FBS-) перед коинкубацией с ВКВ. GFP-маркированные ВКВ добавляли к клеткам при варьирующихся дозах и временных точках. После коинкубации клетки ресуспендировали в 5% трипсине и концентрировали до ~1 млн клеток на 50 мкл для цитометрии. 37 °C — стандарт для экспериментов по поглощению ВКВ в наших анализах, так как это стандарт для клеточных культур и in vitro платформ поглощения [31, 41–44].

Ингбиторные анализы

Холодовой анализ

ВКВ коинкубировали с реципиентными клетками при 4 °C для эффективной «паузы» роста клеток и ингибирования активных процессов [45]. 4 °C ингибирует все активные формы поглощения ВКВ [31, 41–44].

Анализ с фиксацией

Реципиентные клетки фиксировали в 4% параформальдегиде на 30 мин на льду и промывали PBS непосредственно перед коинкубацией с ВКВ для ингибирования всех активных форм поглощения.

Приобретение данных на ImageStreamX

Приобретение выполняли на ImageStreamX Mark II Imaging Flow Cytometer (Luminex Corporation, Seattle, Washington) с программным обеспечением INSPIRE. Приобретали минимум 5000–10 000 клеточных событий. Каждый биологический образец реплицировали в трех технических репликатах и индивидуально приобретали на ISx. Ярко-польные изображения собирали на канале 1, боковое рассеяние (785 нм) — на канале 6. Зеленый флуоресцентный белок (GFP) возбуждали 488-нм аргоновым лазером при 200 мВт, флуоресценцию собирали на канале 2 (480–560 нм). Использовали увеличение 60× на всех образцах с низкой скоростью приобретения для высокой чувствительности.

Анализ в IDEAS

Анализ данных и изображений проводили в программе IDEAS (Luminex). Гейтинг-стратегия:

1. Фокус-гейт для исключения клеток, не попавших в поле фокуса, с использованием значения Gradient RMS.
2. Сфокусированные клетки гейтовали для исключения дублетов и дебри с использованием площади ярко-польного изображения vs соотношения сторон ярко-польного. Гейтованные данные использовали для создания гистограмм и генерации статистических референсов, измеряющих интенсивность флуоресценции (сумма всех пикселей изображения), максимальную интенсивность пикселя (интенсивность самых ярких пикселей) и количество точек (spot count) через внутренние алгоритмы для каждого образца. Признаки spot count генерировали с помощью применимых IDEAS Wizards. Spot count, средняя интенсивность и отношение максимального пикселя рассчитывались по формуле (Выходное значение с ВКВ / Выходное значение без ВКВ).

Статистика

Все количественные данные анализировали в GraphPad Prism 8.1.2 (San Diego, California) в трипликатах. Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM). Статистическая значимость определяли с помощью непарного T-критерия или однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с пост-хок тестами Тьюки или Даннета по сравнению с контролем при необходимости. p < 0,05 считалось значимым.

Результаты

Свойства внеклеточных везикул HEK293T, маркированных CD63-eGFP

Для генерации флуоресцентно маркированных ВКВ для анализа кинетики и поглощения, клетки HEK293T транфектовали плазмидой, несущей фузионный белок CD63-eGFP. CD63 — тетраспанин, обычно обогащенный в мембране экзосом, что делает его оптимальной мишенью для флуоресцентной маркировки ВКВ [46, 47]. Использованную среду собирали из культуры HEK293T, ВКВ изолировали как описано ранее [8]. Сравнили размер и распределение ВКВ, изолированных от CD63-eGFP-транsfектированных и нетранsfектированных HEK293T. Контрольные и CD63-eGFP-транsfектированные ВКВ HEK293T демонстрировали среднюю медианную диаметр 110,28 нм и 103,616 нм соответственно, по данным нано-трекинга (Рис. 1а), что соответствует сообщаемым размерам ВКВ HEK293T [13, 15, 27, 48]. Значимых различий в медианном диаметре (p = 0,1615) и распределении (p = 0,4225) между нетранsfектированными и CD63-eGFP-транsfектированными ВКВ не обнаружено. Маркировка eGFP не меняла размер ВКВ HEK293T (Рис. 1б).

Провели IFC-анализ для определения ассоциации CD63-eGFP с ВКВ. В качестве флуоресцентного негативного контроля 1,34 мкМ бусины в буфере (Рис. 1в, верх) не имели флуоресценции при возбуждении 488 нм, но были видны в BF и SSC. Немаркированные ВКВ HEK293T были негативны в BF, GFP и SSC, что указывает на малый размер ниже порога BF и отсутствие флуоресценции (Рис. 1в, середина). Отсутствие в BF означает размер ВКВ <300 нм, что говорит о минимальном роевании. CD63-eGFP-маркированные ВКВ негативны в BF и позитивны в GFP-канале, подтверждая положительную флуоресценцию ВКВ HEK293T (Рис. 1в, низ). Позитивный сигнал в GFP-канале может указывать на отдельную ВКВ или группу флуоресцентных ВКВ. Совокупно результаты показывают, что изолированные ВКВ HEK293T имеют стандартный размер и профиль белковых маркеров, согласующийся с предыдущими отчетами об экзосомах HEK293T, и eGFP-маркировка не меняет размер ВКВ [5, 27].

Используя коммерчески доступный цитометрический метод для измерения общих маркеров ВКВ, определили общий тетраспаниновый профиль [5]. Изолированные ВКВ HEK293T из контроля и CD63-eGFP-экспрессирующих клеток были позитивны для стандартных маркеров ВКВ, включая CD9, CD63 и CD81, измеренные в относительных единицах флуоресценции (Рис. 1г). Как сообщалось ранее, CD29 также обнаружили на поверхности ВКВ HEK293T и CD63-eGFP-транsfектированных ВКВ HEK293T [5]. Эти результаты указывают, что методы изоляции и маркировки ВКВ HEK293T дают ВКВ с общими маркерами экзосом HEK293T.

Активное поглощение ВКВ HEK293T

Выполнили два ингибиторных анализа интернализации. ВКВ HEK293T коинкубировали с реципиентными клетками при 4 °C (холод) или с заранее фиксированными параформальдегидом реципиентными клетками (фиксированные). Оба процесса уменьшили присутствие eGFP-маркированных ВКВ в реципиентных клетках по сравнению с физиологическими условиями (Рис. 2а). Холодовой и фиксированный ингибиторные анализы снизили spot count (холод: p = 0,0127, фиксированный: p = 0,0078), интенсивность (холод: p = 0,0105, фиксированный: p = 0,0374) и максимальный пиксель (холод: p = 0,0159, фиксированный: p = 0,0149) флуоресцентных сигналов в реципиентных клетках без обработки, указывая на ингибирование поглощения ВКВ. Эти результаты свидетельствуют, что локализация eGFP и увеличение выходных параметров означают интернализацию ВКВ HEK293T для последующих анализов поглощения.

Дозозависимое поглощение ВКВ HEK293T

Для разработки стандартной дозовой кривой на платформе IFC, ВКВ HEK293T коинкубировали с реципиентными клетками HEK293T при возрастающих дозах от 0 до 20 000 ВКВ на клетку при 37 °C. Репрезентативные IFC-изображения показывали визуальный рост eGFP-флуоресценции с увеличением дозы (Рис. 3а). Минимальное детектируемое число ВКВ составляло 6000 на клетку. На этом уровне spot count (p = 0,0012), интенсивность (p = 0,0075) и максимальный пиксель (p = 0,0005) были значительно выше, чем в клетках без ВКВ (Рис. 3б–г). Таким образом, доза 6000 ВКВ HEK293T — нижний порог поглощения в наших условиях. Дозы 10 000 и 20 000 также показали более высокие значения spot count (10 000: p = 0,0009; 20 000: p < 0,0001), интенсивности (10 000: p < 0,0001; 20 000: p < 0,0001) и максимального пикселя (10 000: p < 0,0001; 20 000: p < 0,0001) по сравнению с контролем. Сравнение между более высокими дозами не выявило значимых различий в spot count (6000 vs 10 000: p = 0,999; 10 000 vs 20 000: p = 0,0927), интенсивности (6000 vs 10 000: p = 0,8482; 10 000 vs 20 000: p = 0,999) и максимальном пикселе (6000 vs 10 000: p = 0,6056; 10 000 vs 20 000: p = 0,5281). Между 6000 и 20 000 статистической разницы в spot count (p = 0,0787) и интенсивности (p = 0,8083) нет, но есть значимая разница в максимальном пикселе (p = 0,0140). В целом, кривая выхода показывает значимую дозозависимость во всех параметрах (spot, интенсивность, макс. пиксель, p < 0,0001). Результаты указывают, что поглощение ВКВ HEK293T дозозависимо с минимальным порогом 6000 ВКВ на клетку.

Временная динамика поглощения ВКВ HEK293T

Используя 6000 ВКВ на клетку, коинкубировали ВКВ HEK293T с клетками HEK293T на увеличивающихся интервалах времени от 5 мин до 24 ч. Длительность экспозиции ВКВ играла ключевую роль в количестве видимой флуоресценции в реципиентных клетках, снижаясь после 12 ч (Рис. 4а). Изначально 30 мин коинкубации показали значительный рост spot count (p = 0,0081), указывая на возможную тенденцию к поглощению, но не в других параметрах (интенсивность: p = 0,3073, макс. пиксель: p = 0,0952) (Рис. 4б–г). При 2 ч коинкубации зафиксировали значительно более высокий spot count (p = 0,0028), интенсивность (p = 0,0420) и макс. пиксель (p = 0,0006) по сравнению с контролем. При 4 ч все параметры превышали контроль (spot count: p = 0,0003, интенсивность: p < 0,0001, макс. пиксель: p < 0,0001). Интенсивность и макс. пиксель оставались выше контроля при 4, 12 и 24 ч. Различий между 4 и 12 ч по всем параметрам не было (spot: p = 0,999, интенсивность: p = 0,5797; макс. пиксель: p = 0,2489). Однако интенсивность (p = 0,0191) и макс. пиксель (p = 0,0027) снизились между 12 и 24 ч (Рис. 4в,г). Аналогично дозовой кривой, поглощение ВКВ HEK293T временно-зависимо с последовательным поглощением при 4 ч инкубации и пиком при 12 ч. Совокупно, доза 6000 ВКВ на посеянную клетку и коинкубация 4 ч стандартизированы для последующих анализов поглощения.

Сравнительное поглощение ВКВ HEK293T множественными линиями клеток

Гипотеза о селективном поглощении ВКВ, где ВКВ предпочтительно поглощаются клетками своего происхождения, проверяли с помощью IFC. ВКВ HEK293T коинкубировали с клетками HEK293T или другими линиями: эпителиальными (C3A печеночные клетки), эндотелиальными (HUVEC) и нейронными (SH-SY5Y глиобластомные клетки). eGFP-флуоресценция была более обильной в клетках HEK293T по сравнению с другими типами (Рис. 5а). По сравнению с C3A и HUVEC, клетки HEK293T имели значительно более высокую флуоресцентную интенсивность (C3A: p = 0,0321; HUVEC: p = 0,0055) (Рис. 5в) при коинкубации с ВКВ HEK293T. Кроме того, клетки HEK293T имели более высокий макс. пиксель (C3A: p = 0,0221; HUVEC: p = 0,0079; SH-SY5Y: p = 0,0486) (Рис. 5г) по сравнению со всеми остальными реципиентными линиями (Рис. 5б). Что касается интенсивности, клетки SH-SY5Y были значительно выше HUVEC при коинкубации с ВКВ HEK293T (p = 0,0304). Эти результаты подтверждают селективное поглощение ВКВ HEK293T клетками HEK293T по сравнению с другими линиями in vitro.

Статус дифференцировки нейронных клеток и интернализация ВКВ HEK293T

Поскольку ВКВ имплицированы для терапевтических и доставки целей, нацеленных на неврологические заболевания, человеческие нейронные стволовые клетки (hNSC) и зрелые человеческие нейроны использовали как реципиентные линии для изучения роли статуса дифференцировки реципиентной клетки в селективном поглощении ВКВ. Репрезентативные IFC-изображения показали визуальные доказательства поглощения в обоих типах клеток, но с наибольшей локализацией eGFP в hNSC (Рис. 6а). hNSC, коинкубированные с ВКВ HEK293T, имели более высокий spot count (p = 0,0082) и макс. пиксель (p = 0,0083) по сравнению с зрелыми нейронами. Вместе эти результаты указывают, что статус дифференцировки нейронных клеток влияет на поглощение ВКВ HEK293T.

Обсуждение

Процесс стандартизации in vitro поглощения ВКВ

Группа международных экспертов по ВКВ подчеркнула необходимость эффективного определения минимальной эффективной дозы ВКВ для анализов поглощения, и здесь мы разработали систему, которую может эффективно принять сообщество [26]. Суствуют проблемы при анализе поглощения ВКВ. Например, как мы и другие наблюдали, результаты могут отличаться, если менять дозу ВКВ и время экспозиции [26]. Мы рассмотрели дозу и концентрацию ВКВ HEK293T как кинетическую переменную. Кроме того, in vitro минимальная эффективная доза может более единообразно предсказывать in vivo биодистрибуцию ВКВ и использоваться для разработки более последовательных in vivo дозировочных параметров для терапий и доставки на основе ВКВ. В in vivo исследовании биодистрибуции ВКВ в мышах увеличение дозы ВКВ HEK293T привело к смещению относительной распределения ВКВ в органах [27]. Аналогично результатам предыдущего in vitro исследования с ВКВ рака мочевого пузыря [39], ВКВ HEK293T демонстрировали сильную дозозависимость с минимальной эффективной дозой 6000 ВКВ в нашем исследовании. Мы первыми использовали частицы на клетку как чувствительное дозовое измерение in vitro, что лучше коррелирует с in vivo моделями, использующими частицы на массу тела. Наши данные также указывали на предел насыщения дозы после 6000 ВКВ, потенциально информируя будущие in vivo дозировочные исследования о том, что более высокие дозы могут иметь ограниченную пользу.

Еще одна конфаунд-переменная измерения поглощения ВКВ — потенциальные временные эффекты. В нашей системе мы обнаружили сильную временную зависимость с поглощением уже при 2 ч с потенциальным снижением между 12 и 24 ч. Аналогично нашим данным, временная зависимость сообщалась в нескольких исследованиях с клетками рака мочевого пузыря, опухолевыми клетками и другими с поглощением от 15 мин до 24 ч [29–33, 39, 43, 49]. Как видно с ВКВ HEK293T, более низкие значения при 24 ч коинкубации могут быть результатом деления клеток или рециклинга/деградации ВКВ, интеризированных на ранних временных точках [50]. Конкретно, так как показано, что ВКВ интеризируются, затем разрушаются или высвобождаются после 24 ч, более длительные инкубации могут давать неточные показания интернализации [31, 50]. Наше исследование первым использовало IFC для предоставления визуального и количественного доказательства временно-зависимой кривой выхода поглощения ВКВ HEK293T.

Как предполагает позиционная статья ISEV, выбор маркера ВКВ может влиять на поглощение, что требует менее деструктивных техник, таких как GFP-маркировка, использованная в нашем исследовании. Конкретно, 72% исследователей, участвовавших в опросе, заявляют, что эксперименты с липидными красителями ненадежны без правильных контролов [26]. Красители ВКВ не надежно коррелируют с содержимым малых ВКВ и могут даже увеличивать размер везикул. Загрязнение ошибочно маркированных липопротеинов и белкового содержимого, а также агрегация красителей способствовали ложноположительным результатам [51, 52]. Поэтому мы сфьюзили CD63 с eGFP для маркировки ВКВ HEK293T. Аналогично другим отчетам о белковой маркировке, ВКВ HEK293T были GFP-позитивны без наблюдаемых различий в диаметре и сохраняли стандартный состав поверхностных белков ВКВ [38, 46]. Несмотря на это, важно отметить, что маркировка ВКВ специфическими белками может ограничить отслеживание только несколькими подтипами ВКВ, экспрессирующими соответствующие маркеры. Другие потенциальные ограничения: интенсивность флуоресценции зависит от уровня экспрессии белка, эффективности маркировки мембраны ВКВ и силы возбуждающего источника света [53]. Однако IFC чувствителен, детектирует низкую флуоресцентную интенсивность с точной визуализацией CD63-GFP частиц в диапазоне 100 нм [38, 54].

Селективное поглощение

ВКВ демонстрируют белки и другие сигналы, которые могут обеспечивать селективное поглощение [22, 23, 55]. Поскольку первый этап биогенеза ВКВ — инвагинация плазматической мембраны, мембрана ВКВ содержит похожие белки, рецепторы, адгезионные молекулы и интегрины по сравнению с мембраной донорской клетки [22, 24, 55]. Липидный состав и тетраспанновые белки на мембранах ВКВ, регулируемые донорскими клетками, могут способствовать тропизму ВКВ к реципиентным клеткам [23, 34, 56]. ВКВ МСК селективно транспортировали содержимое в МСК, несмотря на большую близость к моноцитам [24]. В противовес, другие сообщают, что натуральные ВКВ поглощались равномерно любым типом клеток независимо от происхождения ВКВ [11, 22, 25, 57] при использовании визуализации или функциональных нокаут-анализов. Используя платформу IFC, мы обнаружили, что внеклеточные везикулы HEK293T поглощаются в больших количествах клетками HEK293T, чем другими линиями, что указывает на врожденную специфичность поглощения ВКВ. Благодаря этому результату и универсальности IFC, источники ВКВ могут быть соответствующим образом выбраны и проанализированы для таргетирования конкретных реципиентных клеток. На наш взгляд, это первое исследование, использующее потоковую цитометрию с визуализацией для анализа специфичности ВКВ HEK293T.

Помимо автоселективности, статус дифференцировки реципиентных клеток гипоттически играл роль в поглощении ВКВ [32, 58, 59]. Как показали наша группа и другие, ВКВ имеют терапевтические эффекты в ЦНС и модулируют клеточные функции в неврональном развитии и у взрослых [3, 7–9, 60]. Здесь впервые показано, что статус дифференцировки нейронов влияет на поглощение ВКВ: человеческие нейронные стволовые клетки имели значительно большее поглощение ВКВ HEK293T по сравнению с зрелыми нейронами. Недифференцированные hNSC активнее интеризируют экзогенные ВКВ, чем квиесцентные зрелые нейроны. Поскольку hNSC — высокопролиферативные клетки в культуре, они могут неспецифически интеризировать нутриенты и ВКВ. Аналогично, незрелые дендритные клетки интеризировали ВКВ на более высоких уровнях, чем зрелые дендритные клетки [32, 59]. Однако другое исследование с миелоидными предшественниками обнаружило, что зрелые дендритные клетки и макрофаги поглощали больше ВКВ, чем незрелые дендритные клетки и моноциты [58]. Наблюдаемые различия могут быть отнесены к фагоцитарной активности более дифференцированных миелоидных клеток. Ввиду in vitro доказательств селективного поглощения, ВКВ HEK293T могут использоваться для модуляции недифференцированных нейронов в будущих терапевтических применениях.

Заключение

В резюме, мы дополнительно разработали количественную и высокопропускную платформу для квантификации кинетики поглощения ВКВ HEK293T. Эта платформа может быть расширена на другие донорские ВКВ и реципиентные типы клеток, а также на анализы липосом и синтетических наночастиц-векторов доставки. Значительно, мы обнаружили, что поглощение ВКВ HEK293T является селективным процессом со специфичностью к клеткам HEK293T. IFC-анализы, разработанные здесь, могут использоваться для лучшего определения параметров, применяемых в in vivo дозировочных эскалации и исследованиях биодистрибуции, и предоставляют инструментальную информацию для предсказательной модели результатов поглощения ВКВ in vivo.

Доступность данных и материалов

Наборы данных, сгенерированные и/или проанализированные в текущем исследовании, доступны у корреспондирующего автора по обоснованному запросу.

Аббревиатуры

ВКВ:

Внеклеточные везикулы

HEK293T:

Клеточная линия человеческой эмбриональной почки

IFC:

Потоковая цитометрия с визуализацией

hNSC:

Человеческие нейронные стволовые клетки

GFP:

Зеленый флуоресцентный белок

BF:

Ярко-польное изображение

SSC:

Боковое рассеяние

ISEV:

Международное общество внеклеточных везикул