Кинетика и специфичность поглощения внеклеточных пузырьков HEK293T с использованием визуализации проточной цитометрии

Введение

Исследования внеклеточных везикул - это развивающаяся область из-за терапевтической и диагностической полезности естественных и искусственно созданных внеклеточных везикул (EV). EV имеют диаметр от 50 до 1000 нм, производятся из всех типов клеток и обогащены трансмембранными белками, включая CD63, CD81 и CD9; липиды; белки; и ДНК, РНК, мРНК и микроРНК [1,2,3,4,5]. Содержание EV, особенно активной мРНК и miRNA, участвует в модуляции клеток-реципиентов посредством трансляции de novo и посттрансляционной регуляции клеток-мишеней [4, 6]. Понимание, а затем изменение кинетического поглощения и интернализации EV в конечном итоге приведет к оптимизированной доставке содержимого EV к клеткам-мишеням с достаточно высокими концентрациями, чтобы иметь терапевтический эффект.

Когда-то считавшиеся «клеточным мусором», ЭВ использовались в качестве альтернативы клеточной терапии из-за множества преимуществ, включая их биосовместимость, низкую иммуногенность и токсичность, способность к повторному дозированию, различные пути введения и возможность доставки лекарств. и генетическая терапия [3]. Наша группа ранее сообщала о положительном влиянии ЭВ, полученных из нервных стволовых клеток, при инсульте и черепно-мозговой травме. Как в моделях инсульта у мышей, так и у свиней, электромобили улучшали восстановление тканей и функциональное состояние после инсульта [3, 7, 8]. Мы также показали нейропротекторные свойства электромобилей с функциональными преимуществами на модели черепно-мозговой травмы грызунов [9]. Несмотря на эти наблюдаемые эффекты и будущий потенциал электромобилей, мало известно о специфичности и кинетике поглощения электромобилей, что может помешать внедрению терапевтических средств на основе электромобилей в клинику.

EV также были сконструированы как переносящие векторы и загружены терапевтическими агентами, включая генную терапию и химические соединения, в качестве альтернативы терапевтическим средствам наночастиц и векторам доставки [4, 10, 11, 12]. Клетки HEK293T широко используются в качестве клеток-продуцентов EV из-за присущей им быстрой пролиферации, высокого выхода EV и простоты генетических манипуляций [13,14,15,16,17]. EV HEK293T обеспечивали генную терапию, включая терапию miRNA для рака груди [12], и были использованы для доставки химиотерапевтических средств и терапевтических белковых конструкций в модели шванномы [18]. Подобно исследованиям синтетических наночастиц, оценивающим цитотоксичность in vitro, тесты токсичности МТТ показали низкую токсичность незагруженных ЭВ HEK293T и последующую высокую цитотоксичность при загрузке химиотерапевтическими средствами [10, 18,19,20,21]. В связи с широким использованием электромобилей HEK293T мы проанализировали их кинетику и специфичность в этом исследовании.

Селективное или специфическое поглощение относится к естественной способности EV воздействовать на определенные типы клеток. Имеется множество доказательств механизмов интернализации EV, но мало единого мнения о специфичности поглощения [22]. Часто ЭВ проявляют избирательное поглощение такими же реципиентными клетками, как и их родительские клетки, эпителиальные клетки усваивают больше ЭВ эпителиального происхождения, чем другие клетки-реципиенты [23, 24], а мезенхимальные стволовые клетки (МСК) усваивают значительно большее количество ЭВ, происходящих от МСК по сравнению с с другими клеточными линиями in vitro [24]. Однако другие исследования показали, что EV интернализуются всеми типами клеток и демонстрируют неизбирательное биораспределение при введении in vivo [22, 25]. Несмотря на огромный терапевтический потенциал и интерес к ЭВ, понимание специфичности поглощения ЭВ недостаточно. Лучше понимая специфичность поглощения EV, мы можем соответствующим образом выбирать клетки-продуценты EV, которые избирательно интернализуются интересующими реципиентными клетками, и, таким образом, улучшить терапевтическую применимость EV.

Потенциальной причиной противоречивых результатов потребления ЭВ является отсутствие стандартизации платформ измерения, включая анализ эффектов дозы и времени. Недавно группа экспертов Международного общества внеклеточных везикул (ISEV) выпустила документ с изложением позиции, в котором подчеркивается необходимость анализа дозы и времени, а также других факторов, влияющих на поглощение EV [26]. Группа заявила, что «одна доза не подходит для всех» и что доза может повлиять на поглощение или селективность ЭВ [26]. Повышение доз HEK293T EV меняет картину биораспределения in vivo [27]. Профили поглощения сывороточных EV значительно изменялись в зависимости от дозы [28]. Кроме того, время совместной инкубации EV с реципиентными клетками от 15 минут до 48 часов [24, 29,30,31,32,33] может изменить измерения поглощения. Если исследователи электромобилей и промышленность будут применять поддающийся количественной оценке и надежный процесс для определения стандартной дозы и временных кривых, помогающих определить минимальную эффективную дозу, это может привести к более надежным и полезным исследованиям.

Ранее исследователи использовали стандартную проточную цитометрию вместе с различными формами малопроизводительной микроскопии, включая конфокальную микроскопию, для анализа поглощения EV [32,33,34]. Однако у этих технологий есть несколько ограничений. Конфокальная микроскопия может занять много времени и быть субъективной. Традиционные проточные цитометры были разработаны для измерения биологических частиц в клеточном диапазоне, не могут различать рой или совпадение ЭМ и имеют повышенный шум из-за срабатывания триггера [35,36,37,38]. Как отметила группа ISEV, растет понимание физических ограничений традиционной проточной цитометрии и подчеркивается потребность в специализированной проточной цитометрии с пределами обнаружения в диапазоне 100 нм [26, 38]. Проточная цитометрия с визуализацией (IFC) сочетает в себе высокопроизводительную количественную природу проточной цитометрии с технологией флуоресцентной визуализации, которая может разрешать по своей природе небольшие флуоресцентные частицы диаметром до 100 нм [38]. Возможности IFC приводят к снижению шума / фона, уменьшению роения и устройствам с заряженной связью для четкости изображения [37, 39]. Эти характеристики помогают в разработке стратегии стробирования для характеристики ЭМ и поглощения с визуальным подтверждением с высокой пропускной способностью в качестве точной и поддающейся количественной оценке платформы поглощения ЭМ [36, 37, 40].

В этом исследовании экспрессирующие CD63-eGFP клетки HEK293T были использованы в качестве линии донорских клеток для продукции EV из-за их обычного использования в терапевтических разработках. Изолированные флуоресцентные EV совместно культивировали с линиями клеток-реципиентов, включая нервные и эндотелиальные клетки. Поглощение было количественно оценено с использованием IFC, что привело к созданию стандартизированной платформы для измерения важных кинетических характеристик захвата и интернализации EV для клеточных систем in vitro. Кроме того, мы предоставляем данные о процессе количественной оценки поглощения флуоресцентного EV в различных условиях и культивируемых клеточных линиях для выяснения избирательного поглощения EV.

Материалы и методы

Культура клеток

Эмбриональные клетки почек человека (HEK293T) были приобретены в АТСС и культивированы в среде DMEM, содержащей 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина. Нервные стволовые клетки человека (hNSC), нервные клетки SH-SY5Y, эпителиальные клетки печени C3A, эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC) и нейроны культивировали в стандартных условиях при 37 ° C, 5% CO ₂ перед исследованиями поглощения внеклеточными везикулами.

Маркировка и изоляция электромобилей

Плазмидная ДНК CD63-eGFP была получена от Addgene (№ 62964). CD63-pEGFP C2 был подарком от Пола Луцио (плазмида Addgene № 62964). Клетки HEK293T культивировали до 70% конфлюэнтности в 10-сантиметровых чашках и 10 мкг плазмидной ДНК трансфицировали с использованием липофектамина 2000 в соответствии с инструкциями производителя. Через 24 часа после трансфекции среду заменяли на стандартную среду HEK293T, лишенную фетальной бычьей сыворотки, и собирали в течение 3 дней подряд. Как описано ранее [3], среду HEK293T фильтровали через фильтр 0,22 мкм и обогащали ультрафильтрацией с использованием центробежных фильтров Amicon с регенерированной целлюлозой 100 кДа и дважды промывали PBS ++. EV были сконцентрированы до 1 мл, и концентрация и распределение по размеру были измерены на Nanosight NS300 в соответствии с протоколом производителя (Malvern, UK). EV были выделены из различных сосудов для культивирования HEK293T, каждый сосуд считался отдельными биологическими репликами, с тремя техническими повторами в каждой биологической реплике (минимум девять образцов для каждого условия).

Анализы поглощения

Реципиентные клеточные линии высевали при 60% конфлюэнтности в 6-луночный планшет в течение 24 часов в стандартных условиях культивирования при 37 ° C. Перед совместным культивированием внеклеточных везикул стандартную среду заменили на среду, не содержащую сыворотки плода крупного рогатого скота (FBS-). ЭВ, помеченные зеленым флуоресцентным белком (GFP), вводили в клетки в различных дозах и в различные моменты времени. После совместного культивирования клетки ресуспендировали в 5% трипсине и концентрировали примерно до одного миллиона клеток на 50 мкл для проточной цитометрии. Тридцать семь градусов Цельсия является стандартом для экспериментов по поглощению EV в наших анализах, поскольку он был стандартом, используемым как для клеточных культур, так и для платформ поглощения EV in vitro [31, 41,42,43,44].

Тесты на ингибирование

Холодный анализ

ЭВ совместно культивировали с реципиентными клетками при 4 ° C, чтобы эффективно «приостановить» рост клеточной культуры и ингибировать активные процессы [45]. Четыре градуса Цельсия подавляют все активные формы поглощения EV [31, 41,42,43,44].

Фиксированный анализ

Реципиентные клетки фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 30 минут на льду и промывали PBS непосредственно перед совместным культивированием с EV, чтобы ингибировать все активные формы поглощения EV.

Получение ImageStreamX

Сбор данных выполняли на проточном цитометре ImageStreamX Mark II Imaging (Luminex Corporation, Сиэтл, Вашингтон) с использованием программного обеспечения INSPIRE. Было зарегистрировано минимум 5000–10 000 клеточных событий. Каждый биологический образец был воспроизведен в трех технических повторных лунках и индивидуально получен на ISx. Изображения в светлом поле были получены на первом канале, а на шестом канале - при боковом рассеянии (785 нм). Зеленый флуоресцентный белок (GFP) возбуждали аргоновым лазером 488 нм при 200 мВт, и флуоресценцию собирали на втором канале (480-560 нм). Для каждого образца использовалось 60-кратное увеличение наряду с низкой скоростью сбора данных для высокой чувствительности.

Анализ ИДЕИ

Анализ данных и изображений проводился с использованием программного обеспечения IDEAS (Luminex). Стратегия стробирования следующая:

1. 1.

   Строб фокуса был определен для удаления ячеек, которые не были в поле фокуса, с использованием значения Gradient RMS.

2. 2.

   Сфокусированные клетки были закрыты для устранения дублетов и мусора с использованием яркого поля площади по сравнению с ярким полем с соотношением сторон. Стробированные данные использовались для создания гистограмм и статистических справок, измеряющих интенсивность флуоресценции (сумма всех пикселей в изображении), максимальную интенсивность пикселей (интенсивность самых ярких пикселей в изображении), а также значения подсчета пятен с помощью внутренних алгоритмов для каждого образца. Функции точечного подсчета были созданы с использованием соответствующих мастеров IDEAS. Количество точек, средняя интенсивность и максимальное соотношение пикселей рассчитываются по формуле (Выходное значение с EV / Выходное значение без EV).

Статистика

Все количественные данные были проанализированы с помощью GraphPad Prism 8.1.2 (Сан-Диего, Калифорния) и выполнены в трех экземплярах. Данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM). Статистическая значимость определялась с использованием непарного T тест или односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с множественным сравнением Тьюки или Даннета post hoc по сравнению с контролями, когда это необходимо. p <0,05 считалось значимым.

Результаты

Свойства внеклеточных везикул HEK293T с меткой CD63-eGFP

Для создания флуоресцентно меченых EV для анализа кинетики и поглощения внеклеточных везикул клетки HEK293T трансфицировали плазмидой, несущей слитый белок CD63-eGFP. CD63 представляет собой белок тетраспанин, обычно обогащенный мембраной экзосом, что делает его оптимальной мишенью для флуоресцентного мечения EV [46, 47]. Использованные среды собирали из культуры клеток HEK293T, и EV выделяли, как сообщалось ранее [8]. Мы сравнили размер и распределение EV, выделенных из клеток HEK293T, трансфицированных CD63-eGFP, с нетрансфицированными клетками HEK293T. Контрольные и трансфицированные CD63-eGFP EV HEK293T показали средний средний диаметр 110,28 нм и 103,616 нм соответственно, как измерено с помощью программного обеспечения для нанотрекинга (рис. 1a), что согласуется с указанными размерами EV HEK293T [13, 15, 27 , 48]. Нет значительных различий в среднем диаметре ( p =0,1615) и распределение ( p =0,4225) EV, выделенных из нетрансфицированных и трансфицированных CD63-eGFP клеток HEK293T. Маркировка eGFP не повлияла на размер электромобилей HEK293T (рис. 1b).

Характеристика EV HEK293T, меченных CD63-eGFP. EV были выделены из HEK293T (контроль) и HEK293T, экспрессирующих среду для культивирования клеток CD63-eGFP. а Типичное распределение размеров EV, записанное с помощью программного обеспечения для нанотрекинга. б Количественная оценка распределения среднего диаметра трансфицированных и нетрансфицированных EV HEK293T. c IFC-изображения гранул отрицательного контроля, контрольных электромобилей HEK293T и электромобилей с меткой CD63-eGFP. BF означает светлое поле, GFP означает зеленый флуоресцентный белок (возбуждающий лазер 488 нм), а SSC ​​означает боковое рассеяние. Положительный eGFP в канале GFP означает флуоресцентные ЭМ HEK293T. г Экспрессия поверхностных маркеров MACSPlex на основе проточной цитометрии для нетрансфицированных EV HEK293T и HEK293T CD63-eGFP EV. Оба источника EV являются положительными для CD29, CD9, CD63 и CD81, как измерено по относительной флуоресценции (обозначено X для положительного результата). Столбцы представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего; N =3; непарный Т-тест. н.с. означает p > 0,05

Анализ IFC был проведен, чтобы определить, был ли CD63-eGFP связан с EV. В качестве флуоресцентного отрицательного контроля гранулы 1,34 мкМ в буферном растворе (рис. 1c, вверху) не обладали флуоресценцией при воздействии длины волны возбуждения 488 нм, но были видны в ярком поле (BF) и боковом рассеянии (SSC). Немаркированные EV HEK293T были отрицательными в BF, GFP и SSC, что свидетельствует о небольшом размере ниже порога BF и отсутствии флуоресценции (рис. 1d, в середине). Отсутствие в BF означает размер EV менее 300 нм, что предполагает минимальное скопление электромобилей. Наконец, меченые CD63-eGFP EV являются отрицательными в BF и положительными в канале GFP, что означает положительную флуоресценцию EV HEK293T (рис. 1c, внизу). Положительный сигнал в канале GFP может указывать на одиночный EV или группу флуоресцентных EV. В совокупности эти результаты показывают, что изолированные EV HEK293T имеют стандартный размер и профили белковых маркеров, согласующиеся с предыдущими сообщениями об экзосомах HEK293T, а мечение eGFP не изменяет размер EV HEK293T [5, 27].

Используя коммерчески доступный метод проточной цитометрии для измерения общих маркеров EV, мы определили общий профиль тетраспанина EV [5]. Изолированные EV HEK293T из контрольных и экспрессирующих CD63-eGFP клеток HEK293T были положительными по стандартным маркерам EV, включая CD9, CD63 и CD81, как измерено в относительных единицах флуоресценции (рис. 1d). Как сообщалось ранее, CD29 также был обнаружен на поверхности EV HEK293T и EV HEK293T, трансфицированных CD63-eGFP [5]. Эти результаты показывают, что методы выделения и маркировки для HEK293T EV приводят к появлению EV с общими маркерами экзосом HEK293T.

Активное использование электромобилей HEK293T

Были выполнены два анализа ингибирующей интернализации. EV HEK293T совместно культивировали с реципиентными клетками при 4 ° C (холод) или с реципиентными клетками, предварительно фиксированными параформальдегидом (фиксированные). Обработки снижали присутствие меченных eGFP EV в клетках-реципиентах по сравнению с клетками-реципиентами, совместно культивированными с EV в физиологических условиях (рис. 2a). Анализы на холода и фиксированное ингибирование уменьшили количество пятен (холодный: p =0,0127, фиксированное: p =0,0078), интенсивность (холодная: p =0,0105, фиксированное: p =0,0374) и максимальный пиксель (холодный: p =0,0159, фиксированное: p =0,0149) сигналов флуоресценции в реципиентных клетках без обработки, что указывает на ингибирование поглощения EV. Эти результаты означают, что локализация eGFP и увеличение выходных параметров означают, что EV HEK293T интернализуются для следующих анализов поглощения.

Анализы ингибирования интернализации EV. Клетки HEK293T совместно культивировали с EV HEK293T в различных условиях. Контроль (37 ° C) относится к совместному культивированию в физиологической среде 37 ° C. Холод означает совместное культивирование в среде с температурой 4 ° C. Фиксированное ингибирование относится к анализу, в котором клетки-реципиенты фиксировали PFA перед совместным культивированием. а Репрезентативные изображения IFC реципиентных клеток. Столбец 1, BF, означает светлое поле. Столбец 2, GFP, означает зеленый флуоресцентный белок (возбуждающий лазер 488 нм), а столбец 3 означает слияние BF и GFP. Контроль показывает положительный GFP, представляющий интернализацию EV. б - г Количественная оценка анализов ингибирования по сравнению с контролями по количеству пятен, средней интенсивности флуоресценции и максимальному количеству пикселей. Столбцы представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего; N =3; за односторонним дисперсионным анализом проводили апостериорный тест Тьюки по сравнению с контролем. * p <0,05; *** p <0,01

Дозозависимое поглощение HEK293T EV

Чтобы разработать стандартную кривую дозы для платформы IFC, EV HEK293T совместно культивировали с реципиентными клетками HEK293T при возрастающих дозах в диапазоне от 0 до 20000 EV на клетку при 37 ° C. Репрезентативные изображения IFC демонстрируют визуальное увеличение флуоресценции eGFP с повышенными дозами EV (рис. 3a). Наименьшее количество EV, которое можно было обнаружить, составляло 6000 EV на совместно культивированную клетку HEK293T. На этом уровне точечный подсчет ( p =0,0012), интенсивность ( p =0,0075) и максимальный пиксель ( p =0,0005) измерения были значительно больше, чем у реципиентных клеток без EV (рис. 3b – d). Таким образом, дозы 6000 ЭВ HEK293T - это низкий порог поглощения в наших экспериментальных условиях. Аналогичным образом, дозы в 10 000 и 20 000 ЭМ имели более высокое количество пятен (10 000: p =0,0009; 20 000: p <0,0001), интенсивность (10,000: p <0,0001; 20 000: p <0,0001) и максимальный пиксель (10,000: p <0,0001; 20 000: p <0,0001) по сравнению с ячейками без электромобилей. При сравнении более высоких доз нет значительных различий в количестве пятен (6000 против 10 000: p =0,999, 10 000 против 20 000: p =0,0927), интенсивность (6000 против 10 000: p =0,8482, 10 000 против 20 000: p =0,999) и максимальное количество пикселей (6000 против 10 000: p =0,6056, 10 000 против 20 000: p =0,5281) от 6000 до 10 000, а также 10 000 против 20 000. Точно так же, сравнивая 6000 и 20 000, нет статистической разницы в количестве пятен ( p =0,0787) и интенсивности ( p =0,8083). Существует значительная разница в максимальном количестве пикселей между 6000 и 20 000 ( p =0,0140). В целом кривая доходности демонстрирует значительную дозовую зависимость по всем параметрам (пятно, интенсивность, максимальный пиксель, p <0,0001). Эти результаты показывают, что поглощение HEK293T EV зависит от дозы с минимальным порогом 6000 EV HEK293T на клетку.

Поглощение HEK293T EV имеет дозовый эффект с минимальным порогом 6000 EV. Клетки HEK293T совместно культивировали с HEK293T EVS в возрастающих дозах от 0 до 20000 на клетку. а Репрезентативные изображения IFC реципиентных клеток с соответствующими дозами EV. Локализация GFP означает внедрение HEK293T EV. б - г Количественная оценка дозовых анализов по сравнению с контролями и каждой группой посредством подсчета пятен, средней интенсивности флуоресценции и максимального соотношения пикселей. Столбцы представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего; N =3; Затем последовал односторонний дисперсионный анализ ANOVA с апостериорным тестом Тьюки. * p <0,05; *** p <0,01

HEK293T EV Temporal Uptake

Используя 6000 EV на клетку, EV HEK293T совместно культивировали с клетками HEK293T для увеличения промежутков времени до IFC, в диапазоне от 5 минут до 24 часов. Продолжительность воздействия ЭВ играла ключевую роль в количестве видимой флуоресценции в реципиентных клетках, снижаясь через 12 часов (рис. 4а). Первоначально 30 минут совместного культивирования показали значительное увеличение количества пятен ( p =0,0081), что указывает на возможную тенденцию к увеличению потребления EV, но не по другим параметрам поглощения (интенсивность: p =0,3073, макс. Пиксель: p =0,0952) (рис. 4б – г). Через 2 часа совместного культивирования значительно большее количество пятен ( p =0,0028), интенсивность ( p =0,0420) и максимальный пиксель ( p =0,0006) по сравнению с реципиентными клетками без EV. Опять же, через 4 часа совместного культивирования все параметры были выше, чем в контроле (количество пятен: p =0,0003, интенсивность: p <0,0001, макс. Пиксель: p <0,0001). Интенсивность и максимальное количество пикселей по-прежнему были выше, чем в контроле, через 4, 12 и 24 часа совместного культивирования. Не было различий в каких-либо параметрах поглощения между 4 и 12 часами совместного культивирования (точка: p =0,999, интенсивность: p =0,5797; максимальный пиксель: p =0,2489). Однако интенсивность ( p =0,0191) и максимальный пиксель ( p =0,0027) уменьшилось между 12 и 24 часами совместного культивирования (рис. 4 c, d). Подобно кривой дозы, поглощение HEK293T EV зависит от времени с постоянным поглощением EV через 4 часа инкубации и пиком через 12 часов. В совокупности доза 6000 EV на засеянную клетку и совместное культивирование в течение 4 часов были стандартизированы для следующих анализов поглощения.

Поглощение HEK293T EV зависит от времени. Клетки HEK293T совместно культивировали с 6000 EV HEK293T / клетку в течение увеличивающегося периода времени. а Репрезентативные изображения IFC реципиентных клеток, соответственно. Локализация GFP означает повышенное потребление HEK293T EV. б - г Количественная оценка анализов динамики по сравнению с контролями и каждой группой посредством подсчета пятен, средней интенсивности флуоресценции и максимального соотношения пикселей. Столбцы представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего; N =3; Затем последовал односторонний дисперсионный анализ ANOVA с апостериорным тестом Тьюки. * p <0,05; *** p <0,01

Сравнительный охват электромобилей HEK293T несколькими линиями сотовой связи

Гипотеза о том, что поглощение EV является избирательным процессом, при котором EV преимущественно поглощаются клетками их собственного происхождения, была проверена с использованием IFC. EV HEK293T совместно культивировали с клетками HEK293T или другими клеточными линиями:эпителиальными (клетки печени C3A), эндотелиальными (эндотелиальные клетки пупочной вены человека) и нервными (клетки глиобластомы SH-SY5Y). Флуоресценция eGFP более выражена в клетках HEK293T по сравнению с другими типами клеток (рис. 5а). По сравнению с C3A и HUVEC клетки HEK293T имели значительно более высокую интенсивность флуоресценции (C3A: p =0,0321; HUVEC: p =0,0055) (рис. 5c) при совместном культивировании с ЭВ HEK293T. Кроме того, ячейки HEK293T имели более высокий максимальный пиксель (C3A: p =0,0221; HUVEC: p =0,0079; SH-SY5Y: p =0,0486) (рис. 5г) по сравнению со всеми другими линиями клеток-реципиентов (рис. 5б). Что касается интенсивности, то клетки SH-SY5Y были значительно выше, чем клетки HUVEC при совместном культивировании с EV HEK293T ( p =0,0304). Эти результаты подтверждают избирательное поглощение HEK293T EV клетками HEK293T по сравнению с другими линиями клеток in vitro.

ЭМ HEK293T демонстрируют предпочтение поглощения по сравнению с клетками HEK293T. EV HEK293T совместно культивировали с клетками HEK293T, эпителиальными клетками C3A, эндотелиальными клетками пупочной вены человека (HUVEC) и нервными клетками SY5Y. а Репрезентативные изображения IFC реципиентных клеток, совместно культивируемых с EV HEK293T. б - г Количественная оценка анализов предпочтения поглощения EV по сравнению с контролями и друг с другом посредством подсчета пятен, средней интенсивности флуоресценции и максимального соотношения пикселей. Столбцы представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего; N =3; Затем последовал односторонний дисперсионный анализ ANOVA с апостериорным тестом Тьюки. * p <0,05; *** p <0,01

Статус дифференциации нейронных клеток и интернализация HEK293T EV

Поскольку ЭВ были задействованы в терапевтических целях и в целях доставки, направленных на невральные заболевания, нейронные стволовые клетки человека (hNSC) и зрелые нейроны человека использовались в качестве линий клеток-реципиентов в нашей системе, чтобы проверить, играет ли статус дифференцировки клетки-реципиента роль в избирательном захвате. электромобилей. Репрезентативные изображения из IFC демонстрируют визуальное свидетельство поглощения обоими типами клеток, но с наибольшей локализацией eGFP в hNSCs (рис. 6a). hNSC, культивируемые совместно с ЭВ HEK293T, имеют более высокое количество пятен ( p =0,0082) и максимальный пиксель ( p =0,0083) по сравнению со зрелыми нейронами. Вместе эти результаты предполагают, что статус дифференцировки нервных клеток влияет на поглощение ЭВ HEK293T.

Статус нейральной дифференцировки влияет на поглощение HEK293T EV. EV HEK293T совместно культивировали со зрелыми нейронами человека и нервными стволовыми клетками человека. а Репрезентативные изображения IFC реципиентных клеток, совместно культивируемых с EV HEK293T. б - г Количественная оценка анализов предпочтения поглощения EV по сравнению с контролями и друг с другом посредством подсчета пятен, средней интенсивности флуоресценции и максимального соотношения пикселей. Столбцы представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего; N =3; непарный T контрольная работа. * p <0,05; *** p <0,01 по сравнению с 0 EV (контроль)

Обсуждение

Процесс стандартизации потребления электромобилей in vitro

Группа международных экспертов по ЭМ подчеркнула необходимость эффективного определения минимальной эффективной дозы ЭМ для анализов поглощения, и здесь мы разработали систему, которая может быть эффективно адаптирована в полевых условиях [26]. При анализе использования электромобилей возникают проблемы. Например, как мы и другие наблюдали, результаты могут отличаться, если изменяются доза ЭМ и время воздействия [26]. Мы рассмотрели дозу и концентрацию HEK293T EV как кинетическую переменную. Кроме того, минимальная эффективная доза in vitro может более единообразно прогнозировать биораспределение in vivo EV и использоваться для разработки более согласованных параметров дозирования in vivo терапевтических средств и доставки EV. В исследовании биораспределения EV у мышей in vivo увеличение дозы HEK293T привело к сдвигу относительного распределения EV в органах [27]. Подобно результатам предыдущего исследования in vitro с использованием ЭМ рака мочевого пузыря [39], ЭМ HEK293T продемонстрировали сильную дозовую зависимость с минимальной эффективной дозой в 6000 ЭМ в нашем исследовании. Мы первыми использовали количество частиц на клетку в качестве чувствительного измерения дозы in vitro, которое лучше коррелирует с моделями in vivo с использованием частиц на массу тела. Наши данные также указывают на предел насыщения дозы после 6000 EV, что потенциально может дать информацию для будущих исследований диапазона доз in vivo, указывая на то, что более высокие дозы могут иметь ограниченные преимущества.

Еще одна сбивающая с толку переменная при измерении потребления EV - это потенциальные временные эффекты на потребление EV. В нашей системе мы обнаружили сильную зависимость от времени с поглощением уже через 2 часа с потенциальным снижением между 12 и 24 часами. Подобно нашим выводам, временная зависимость описывалась в нескольких исследованиях с использованием раковых клеток мочевого пузыря, опухолевых клеток и других с поглощением уже от 15 минут до 24 часов [29,30,31,32,33, 39, 43, 49]. Как видно на примере EV HEK293T, более низкие значения через 24 часа совместного культивирования могут быть результатом деления клеток или рециркуляции / деградации EV, интернализированных в ранние моменты времени [50]. В частности, поскольку было показано, что ЭВ интернализуются, затем разрушаются или интернализуются, а затем высвобождаются через 24 часа, более длительные инкубации могут приводить к неточным показаниям интернализации [31, 50]. Наше исследование является первым, в котором IFC используется для получения визуальных и количественных свидетельств зависящей от времени кривой доходности потребления HEK293T EV.

Как предполагается в позиционном документе ISEV, выбор метки EV может повлиять на поглощение, что потребует менее разрушительных методов, таких как методы маркировки GFP, используемые в нашем исследовании. В частности, 72% исследователей, участвовавших в опросе, утверждают, что эксперименты с липидными красителями ненадежны, если не используются надлежащие меры контроля [26]. Красители EV не коррелируют с достоверной корреляцией с небольшим содержанием EV и могут даже увеличивать размер пузырьков. Загрязнение липопротеинов с неправильной меткой и содержанием белка, а также агрегация красителя способствовали ложноположительным результатам [51, 52]. Therefore, we fused CD63 with an eGFP to label the HEK293T EVs. Similar to other reports of protein tagging, HEK293T EVs were GFP positive with no observed differences in diameter and maintained standard EV surface protein composition [38, 46]. Despite this, it is important to note that labeling EVs with specific EV proteins may limit the tracking to only a few subtypes of EVs expressing the respective markers. Other potential limitations may be that the fluorescence intensity is dependent on protein expression level, the efficiency of EV membrane labeling, and excitation strength of the light source [53]. However, IFC is sensitive, detecting low fluorescence intensity with accurate visualization of CD63-GFP particles at the 100-nm range [38, 54].

Selective Uptake

EVs display proteins and other signals that may confer selective uptake [22, 23, 55]. Since the first step of EV biogenesis is the invagination of the plasma membrane, the EV membrane contains similar proteins, receptors, adhesion molecules, and integrins when compared with the donor cell membrane [22, 24, 55]. The lipid composition and tetraspanin proteins on EV membranes regulated by donor cells may contribute to EV tropisms with recipient cells [23, 34, 56]. MSC EVs selectively transported contents into MSCs, despite closer proximity to monocytes [24]. In contrast, others report that natural EVs were taken up equally by any cell type, regardless of EV origin [11, 22, 25, 57] when utilizing imaging or functional knockdown assays. Using the IFC platform, we found that HEK293T extracellular vesicles are taken up at greater quantities by HEK293T cells than other reported cell lines, thus suggesting an inherent EV uptake specificity. Through this outcome and the versatility of IFC, EV sources can be appropriately selected and analyzed for targeting specific recipient cells. To our knowledge, this is the first study utilizing imaging flow cytometry to analyze the specificity of HEK293T EVs.

In addition to self-selectivity, differentiation status of recipient cells has been hypothesized to play a role in uptake of EVs [32, 58, 59]. As our group and others have shown, EVs have therapeutic effects in the central nervous system and are known to modulate cell functions in neuronal development and adults [3, 7,8,9, 60]. Here for the first time, differentiation status of neurons affected EV uptake, where human neural stem cells had significantly greater uptake of HEK293T EVs compared to mature neurons. Immature hNSCs more actively internalize exogenous EVs than quiescent mature neurons. Since hNSCs are highly proliferative cells in culture, they may nonspecifically internalize nutrients and EVs. Similarly, immature dendritic cells internalized EVs at higher levels than mature dendritic cells [32, 59]. However, another study with myeloid precursor cells found that the mature dendritic cells and macrophages internalized more EVs than immature dendritic cells and monocytes [58]. The observed differences can be attributed to the phagocytic activity of further differentiated myeloid cells. Due to the in vitro evidence supporting selective uptake, HEK293T EVs can be used to modulate undifferentiated neurons in future therapeutic applications.

Выводы

In summary, we have further developed a quantitative and high-throughput platform for quantifying HEK293T EV uptake kinetics. This platform can be extended to other donor EVs and recipient cell types and assays for liposomes and synthetic nanoparticle delivery vectors. Significantly, we found that HEK293T EV uptake is a selective process, with specificity towards HEK293T cells. The IFC assays developed here can be used to better define parameters used in in vivo dose escalation and biodistribution studies and provide instrumental information for a predictive model of EV uptake outcomes in vivo.

Доступность данных и материалов

The datasets generated and/or analyzed during the current study are available from the corresponding author on reasonable request.

Сокращения

EV:

Extracellular vesicles

HEK293T:

Human embryonic kidney cell line

IFC:

Imaging flow cytometry

hNSC:

Human neural stem cell

GFP:

Green fluorescent protein

BF:

Яркое поле

SSC:

Side scatter

ISEV:

International Society of Extracellular Vesicles