Водорастворимые ПЭГ-полимерные комплексы 4-тиазолидиноновых химиотерапевтиков усиливают про-апоптотическую активность против раковых клеток глиомы C6 крыс

Аннотация

Цель

Изучить, усиливает ли водная формулировка комплекса производных 4-тиазолидинона с ПЭГ-содержащим полимерным наноносчиком их про-апоптотическое действие по отношению к клеткам глиомы C6 крыс.

Методы

Механизмы антинеопластических эффектов производных 4-тиазолидинона исследовались in vitro на клетках глиомы C6 крыс. Оценивались живучесть клеток, цикл клетки, экспрессия Аннексина V и ДНК повреждение оценивалось кометным анализом ДНК. Использовалась новая водная формулировка производных 4-тиазолидинона, комплексированных с полимерным наноносчиком, для усиления про-апоптотического действия к клеткам C6.

Результаты

Изученные производные 4-тиазолидинона используют механизмы апоптоза для убийства клеток глиомы C6 крыс, подтвержденное FACS анализом этих клеток в пред-G1 стадии, появлением Аннексин V положительных клеток C6 и увеличением числа ДНК комет более высоких классов. Комплексация изученных соединений с ПЭГ-содержащим полимерным наноносчиком значительно увеличила про-апоптотические эффекты в клетках глиомы C6 крыс, измеренные всеми вышеупомянутыми методами.

Заключение

Комплексация производных 4-тиазолидинона с ПЭГ-содержащим полимерным наноносчиком наделила их водорастворимостью и усилила про-апоптотические эффекты в клетках глиомы C6 крыс.

Введение

Химиотерапия — основная модальность лечения многих опухолей, и химиотерапевтические препараты выбираются как последний вариант, особенно в случаях, когда рак уже распространился. Однако тяжелые негативные побочные эффекты снижают клиническую эффективность многих текущих антираковых препаратов. Поэтому существует постоянная и критическая необходимость в разработке альтернативных или синергетических антираковых препаратов с уменьшенными или минимальными побочными эффектами.

Низкая водорастворимость антираковых препаратов была распространенной и серьезной проблемой, препятствующей их разработке и клиническому применению, и многие высокоактивные и перспективные химиотерапевтические агенты были исключены из-за их низкой водорастворимости. ПАВ и ко-растворители используются в высоких концентрациях для растворения водонепроницаемых антираковых агентов; однако эти вещества также могут производить неблагоприятные побочные эффекты, тем самым ограничивая использование многих антираковых препаратов.

Большой вызов для разработки фармацевтических препаратов — устранить или хотя бы уменьшить негативные побочные эффекты высокоактивных препаратов, особенно антиопухолевых агентов, демонстрирующих общую токсичность в организме, что значительно ограничивает их использование. Эффективный способ преодоления этой проблемы — использование многофункционального наноносчика препарата, позволяющего токсичным антиопухолевым агентам связываться в месте их доставки к целевым клеткам в конкретных органах или тканях. Малый размер, контролируемая специфическая структура, большая площадь поверхности и форма наночастиц предоставляют им несколько преимуществ по сравнению с другими материалами. При использовании наночастиц возможно оптимизировать эффективность, минимизировать негативные побочные эффекты и улучшить раковую терапию. Таким образом, препараты, ранее провалившиеся из-за высокой общей токсичности, теперь получают вторую возможность для клинического использования благодаря их включению в систему доставки с улучшенной биодоступностью и контролируемым высвобождением. Такие комплексы препарат-носитель легче проникают через естественные барьеры вроде гематоэнцефалического барьера или мембран отдельных клеток. Большая площадь поверхности наночастиц позволяет им формировать комплексы с конкретными векторными биомолекулами, помогающими в доставке препарата к целевому органу, ведущими к значительному снижению или даже полному устранению негативных побочных эффектов, позволяющими увеличение минимальной эффективной дозы при единичном введении препарата, усилению эффективности действия препарата и дающими новый стимул для развития персонализированной фармакотерапии. Кроме того, наночастицы могут инкапсулировать молекулы, улучшающие растворимость, стабильность и абсорбцию определенных препаратов. Системы доставки препаратов могут обеспечивать длительное циркулирование препарата в крови, способность препарата накапливаться в ходе патофизиологического процесса и возможность эффективно переносить молекулу активного вещества в клетки и органеллы клеток. Наночастицы должны быть стабильными, сохранять свою химическую структуру на определенный период времени и в то же время быть способными к биоразложению.

Для оценки новых антираковых препаратов важно измерять их цитотоксическую активность и потенцию с использованием различных линий человеческих раковых клеток и экспериментальных опухолевых моделей in vivo. Химиотерапия часто терпит неудачу из-за дефицита в апоптотическом процессе, играющем ключевую роль в препарато-индуцированной смерти клеток, последовательной или результирующей из изменения туморогенеза.

Поскольку многие злокачественные клетки могут уклоняться от апоптотической смерти, рациональный подход должен использоваться в проектировании и разработке новых антираковых препаратов. Основные цели создания новых антираковых препаратов: (1) найти способы преодоления мутаций индивидуальных раковых клеток, влияющих на независимые механизмы действия препарата; и (2) спроектировать схемы химиотерапии, способные одновременно нацеливаться на независимые пути. Лучшее понимание отношения между генетикой рака и чувствительностью к лечению — ключевой вопрос для разработки новых эффективных антираковых препаратов.

В предшествующих исследованиях мы продемонстрировали, что синтетические производные 4-тиазолидинона (Les-3288, Les-3833 и Les-3882) вероятно используют другие механизмы действия, чем другие антинеопластические агенты, для убийства клеток крысиной глиомы C6 и человеческой глиобластомы U251 in vitro, в отличие от doxorubicina (Dox). Les-3288 не существенно влиял на уровень реактивных кислородных форм (РКФ) в обработанных клетках. Следует подчеркнуть, что эти мощные антиопухолевые агенты показывали меньшую общую токсичность в организме экспериментальных животных, как демонстрировали измеренные биохимические параметры их токсического действия в опухолевых клетках и животных, по сравнению с Dox. Таким образом, связывание антиопухолевого препарата с полимерным наноносчиком (ПНН) и применение препарата в форме стабильной водной системы доставки может снизить токсические эффекты в органах животных по сравнению с действием этих веществ в свободной форме.

Целью этой работы было изучение индукции апоптоза в клетках глиомы крыс линии C6 in vitro и in vivo водными формулировками комплексов производных 4-тиазолидинона с ПЭГ-содержащим ПНН и сравнение индукции апоптоза с использованием этих производств в свободной форме.

Материалы и методы

Антиопухолевые препараты

Гетероциклические производные 4-тиазолидинона (соединения Les-3288 и Les-3833, Рис.1) были синтезированы в Департаменте фармацевтической, органической и биоорганической химии Дanylо Halytsky Львовского национального медицинского университета, Украина, как описано ранее.

Полимерный наноносчик

ПНН для доставки препарата был синтезирован в Департаменте органической химии Львовского политехнического национального университета, Украина, используя методологию, описанную ранее. Синтез поли(VEP-co-GMA)-graft-PEG проводился через последующие этапы. Поли(VEP-co-GMA) синтезировали радикальной кополимеризацией 5-tert-бутилперокси-5-метил-1-гексен-3-ин (VEP, 0.41 г, 0.5 моль) (пероксидный мономер, синтезированный описанным методом) и глицидила метакрилата (GMA, 7.72 г, 12.2 моль) (Sigma-Aldrich, США) в этилацетате (7.9 мл) (Merck, Дармштадт, Германия) с использованием азоизобутиронитрила (AIBN, 0.129 г, 0.05 моль) (Merck, Дармштадт, Германия) как радикального инициатора. Полимеризация проводилась при 343 К до достижения максимального превращения 65%. Поли(VEP-co-GMA) использовался как основная цепь для присоединения боковых ПЭГ цепей через реакции добавления поли(этиленгликол) метил эфира (mPEG) с боковыми эпоксидными группами. Трифлуорид бора эфират (0.027 мл, 0.031 моль) (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, МО, США) добавляли к раствору кополимера (1.0 г) в диоксане (20 мл; Merck, Дармштадт, Германия) при 313 К и перемешивали 3 ч. mPEG (2.5 мг, 3.35 ммоль) (Sigma-Aldrich, США) растворяли в диоксане (15 мл) и раствор смешивали с раствором основного полимера и перемешивали 6 ч при 313 К. Нереагировавший mPEG удаляли диализными мешками с пористостью молекулярного веса 6-8 кДа (Sigma-Aldrich, США). Полученный гребенчатый поли(VEP-co-GMA)-graft-PEG сушили при комнатной температуре под вакуумом до постоянного веса. Структуры и некоторые характеристики ПНН представлены на Рис. 2 и были описаны ранее.

Для приготовления водных растворов ПНН 0.09 г ПНН растворяли в 0.9 мл DMSO. Этот раствор ПНН добавляли к 8.0 мл 0.9% раствора NaCl. Затем раствор перемешивали 0.5 ч и ультразвуковым образом обрабатывали 10 с. Водные дисперсии комплексов получали капальными добавлениями DMSO растворов 4-тиазолидинонов и ПНН в воду в следующем порядке: 0.045 г ПНН растворяли в 0.15 мл DMSO (Sigma-Aldrich, США), и 0.0015 г Les-3288 (или Les-3833) растворяли в 0.10 мл DMSO. Растворы ПНН и 4-тиазолидинонов смешивали и добавляли к 4.25 мл 1% водного раствора NaCl и ультразвуковым образом обрабатывали 10 с.

Этот поверхностно-активный ПНН содержит гидрофильные ПЭГ цепи, привитые к гидрофобной основной цепи. В водных растворах аmphифильный ПНН формирует мицеллоподобные структуры, способные растворять водонепроницаемые соединения (например, препараты) или эти соединения могут адсорбироваться на поверхности наночастиц, тем самым повышая их биосовместимость. Разработанная техника получения высокостабильных водных дисперсий 4-тиазолидиноновых химиотерапевтиков состоит в нуклеации наномасштабных частиц препарата, происходящей при переносе разбавленных DMSO растворов в выпадающий солевой раствор, содержащий полимерный ПАВ ПНН, обеспечивающий полимерное покрытие для поверхности наночастицы. В результате, благодаря агрегации и осадению, комплекс стабилизировался и дисперсия была предотвращена. Кроме того, наномасштабные комплексы производных 4-тиазолидинона защищены от возможных взаимодействий с окружающей биологической микросредой. Эта защита позволяет им оставаться дольше в организме без потери стабильности и накапливаться в целевой ткани или органе без вызова негативных побочных эффектов. Таким образом, такая модификация обеспечивает усиленную агрегационную и осадочную стабильность водных дисперсий наночастиц антиопухолевого соединения.

Размеры полимерных мицелл ПНН и комплексов ПНН с гетероциклическими 4-тиазолидинонами измеряли динамическим световым рассеянием (DLS) с использованием Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments GmbH, Штутгарт, Германия) и DynaPro NanoStar (Wyatt Technology, Санта-Барбара, СА, США) и фотонными корреляционными спектрами с использованием неинвазивной обратной рассеянной (NIBS) технологии при 25°C. Образцы для DLS измерений готовились как описано выше, и при необходимости разбавлялись бидистиллированной водой, pH 6.5–7.0. Три-пять измерений проводились для каждого образца (каждое измерение состояло из 5 циклов и диапазон между измерениями был 5 мин). Рис. 3 показывает распределение размеров мицеллоподобных структур ПНН и наночастиц комплексов ПНН с гетероциклическими 4-тиазолидинонами (Les-3833 и Les-3288) проанализированных DLS. Размеры и морфология ПНН мицелл а также ПНН-покрытых 4-тиазолидиноновых наночастиц изучались проницающей электронной микроскопией JEM-200А (JEOL, Япония) при ускоряющем напряжении 200 кВ. Образцы готовились как описано выше, и при необходимости разбавлялись бидистиллированной водой. Образцы готовились распылением испытуемого раствора на подложку ультразвуковым диспергатором УЗДН-1А (Укрросприбор Лтд., Украина), облегчающим равномерное покрытие подложки. Тонкая аморфная углеродная пленка, осажденная на медной сетке, использовалась как подложка. Размеры и морфология ПНН мицелл и комплексов с гетероциклическими 4-тиазолидинонами (Les-3288 и Les-3833) изученные методами DLS и TEM представлены на Рис. 3.

DLS и проницающая электронная микроскопия (TEM) исследования продемонстрировали, что размеры ПНН мицелл составляли 50 ± 25 нм, а наночастицы, образованные комплексами ПНН с гетероциклическими 4-тиазолидинонами Les-3833 и Les-3288, были 140 ± 25 нм и 155 ± 30 нм соответственно. Дисперсии комплексов ПНН с 4-тиазолидиноновыми производными высокостабильны и защищены от агрегации и осаждения адсорбированной ПНН оболочкой на поверхности тиазолидиноновой наночастицы. Как показано на Рис. 4, изменения размеров наночастиц, диспергированных в водной системе, пренебрежимы при многократных разбавлениях водой, а также после 6 месяцев старения водных систем комплексов ПНН с 4-тиазолидинонами.

Клеточная культура

Клетки глиомы крыс линии C6 получены из Коллекции клеточных культур Института молекулярной биологии и генетики, Национальной академии наук Украины (Киев, Украина). Клетки культивировали в модифицированном средне Дюльбекко для орла (DMEM, Sigma, США) с добавлением 10% фетового бычьего сывороточного белка (Sigma, США). Клетки выращивали в CO2-инкубаторе при 37°C, 5% CO2 и 95% влажности. Пересев клеток проводили в соотношении 1:5 раз в 2–3 дня.

Оценка цитотоксического действия изучаемых веществ

Клетки посеяли в 24-колодчатых пластинках концентрацией 100 000 клеток/мл в одной колодке. Изучаемые вещества добавляли при концентрациях 0.1, 0.5 и 1.0 мкМ после 24-часового периода адаптации, начавшегося после посева клеток. Подсчет клеток проводили регулярно в гемацитометрической камере с использованием красителя Трипан-блю (DV-T10282, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific Corp., Уолтем, МА, США) при конечной концентрации 0.01%, 2 мин после добавления к клеточной суспензии. Мертвые клетки захватывали этот краситель из-за повреждения их плазматической мембраны.

Потоковая цитометрия

Для изучения клеточного цикла и апоптоза, клетки C6 обрабатывали Les-3288, Les-3833 и их комплексами с ПНН, а также ПНН в свободной форме, промывали фосфатно-буферным салином (PBS, pH 7.4), центрифугировали при 1000 об/мин на 5 мин при 4°C и ресуспендировали в холодном PBS (2 млн клеток на 1 мл PBS). Затем клетки фиксировали добавлением аликвот 4 мл абсолютного этанола, охлажденного до -20°C, с мягким перемешиванием. Фиксированные образцы хранили при -20°C до использования (не дольше 1 недели). Для флуоресцентно-активированного 세포чного сортирования (FACS) анализа, клеточные образцы центрифугировали при 1000 об/мин на 5 мин при 4°C, супернатант удаляли и клеточный пеллет ресуспендировали в 1 мл PBS. Сто микролитров ДНАза-свободной РНКазы (Sigma, США) добавляли к этой суспензии, и образцы инкубировали при 37°C на 30 мин. Затем каждый образец дополняли 100 мкл Пропидиум иодида (PI) (Sigma, США, 1 мг/мл) и инкубировали при комнатной температуре на 10 мин. Наконец, образцы переносили в пластиковые фальконовские трубки, и клеточная суспензия мониторилась FACSCalibur потоковым цитометром (BD Biosciences, Маунтин Вью, СА, США) и Summit v3.1 программным обеспечением (Cytomation, Inc., Форт Коллинз, CO, США) для измерения параметров клеточного цикла и апоптоза.

Измерение Аннексин V-положительных (апоптотических) клеток выполнялось с использованием FACS анализа. Клетки глиомы крыс C6 обрабатывали концентрациями 0.1 мг/мл, 0.5 мг/мл и 1 мг/мл ПНН, Les-3288, Les-3833 и их полимерных конъюгатов как указано под рисунками. В конце эксперимента клетки отсоединяли от дна чаши Трипсин-EDTA раствором, промывали дважды PBS и окрашивали Аннексин V-FITC с использованием Апоптоз Детекшн Кит (BD Biosciences, Сан-Хосе, СА, США), согласно инструкции производителя. Промытые клетки инкубировали 15 мин в Аннексин V связывающем буфере (BD Pharmingen), содержащем 1/50 объема FITC-конъюгированного Аннексин V раствора. Затем образцы разбавляли в два раза соответствующим объемом Аннексин V связывающего буфера и немедленно измеряли на FL1/FL2 (FITC-PI) канале потокового цитометра (Becton Dickinson, США). Аннексин V-одиночные положительные клетки классифицировали как апоптотические.

ДНК кометный анализ

ДНК кометный анализ проводился в щелочных условиях. Десять тысяч клеток смешивали в 75 мкл низкотемпературно плавкого агароса (0.5%) на образец. После смешивания образец пипетировали на слайд, предварительно покрытый 1.5% нормальным плавким агарозом. Образцы инкубировали при 4°C в течение 18 ч в лизирующем растворе (2.5 М NaCl, 100 мМ EDTA, 10 мМ Tris-база, 10% DMSO, 1% Triton X-100). Для разрешения размотки ДНК и выражения щелочно-лабильного повреждения, слайды инкубировали в щелочном растворе при комнатной температуре 20 мин (проводилось в темноте). Для электрофореза (~74 В/см на 30 мин) слайды переносили в горизонтальную камеру и добавляли 1x электрофоретческий буфер (0.3 М NaOH, 1 мМ EDTA, pH > 13). Слайды фиксировали в ледяном 100% метаноле и сушили. Слайды окрашивали 80 мкл 1× этидиум бромида (EtBr) на 5 мин, затем окунали в охлажденную дистиллированную воду для удаления излишков красителя. ДНК кометы визуализировали микроскопом (Carl Zeiss, Германия), и изображения анализировали программным обеспечением 'CASP' (Casplab-1.2.3b2 software, CASPlab, Вроцлав, Польша). Считали сто комет на образец. ДНК повреждение категоризировали на пять уровней генотоoksiчности согласно размеру хвоста кометы: 0 (0-5% повреждение), 1 (5-25%), 2 (25-45%), 3 (45-70%), 4 (более 70%). Индекс повреждения (DI) рассчитывали, как описано ранее.

ДНК интеркаляционный анализ с использованием метилгрин красителя

Соединения Les-3288 и Les-3833 исследовали на способность интеркалировать в ДНК молекулу использованием метилгрин анализа. ДНК молоти (10 мг/мл) инкубировали 1 ч при 37°C с 15 мкл метилгрин раствора (1 мг/мл в H2O). Соединения добавляли при 1 мкг/мл и инкубировали при 37°C в темноте на 2 ч. Общий конечный объем образцов был 1 мл. Абсорбция метилгрина измеряли при 630 нм после инкубации образца на 2 ч при 37°C, используя BioTek 76 883 много-канальный микрофотометр (BioTek, Винуски, ВТ, США). EtBr использовался как положительный контроль.

Анализ данных и статистика

Все эксперименты повторяли трижды с тремя параллелями в каждом варианте. Дисперсионный анализ (ANOVA) использовался для сравнения групп. Данные распределения клеток крысиной глиомы C6 в разных фазах клеточного цикла анализировали однофакторным ANOVA с последующим пост-хок множественным сравнением Тьюки. Все данные представлены как среднее ± SD. p-значение < 0.05 считалось статистически значимым.

Результаты

Цитотоксический эффект (тест исключения Трипан-блю) производных 4-тиазолидинона в свободной форме и в комплексе с полимерным наноносчиком

Результаты теста исключения Трипан-блю продемонстрировали, что водные формы комплексов Les-3288 и Les-3833 с ПНН имели усиленную токсичность по отношению к глиомным клеткам C6 (лечение 24 ч и 48 ч) по сравнению с цитотоксичностью, наблюдаемой от использования свободной формы этих соединений (Рис. 5 и 6). Наивысший цитотоксический эффект наблюдался при дозах 0.1 и 0.5 мкМ соединений Les-3288 и Les-3833 в их комплексах с ПНН, в то время как при наивысшей дозе (1.0 мкМ) этих соединений усиление комплексации с ПНН обнаруживалось только в случае Les-3288 на 24 ч (Рис. 5 и 6).

Комплексация соединений Les-3833 и Les-3288 с полимерным наноносчиком усиливает их про-апоптотическую активность in vitro по отношению к клеткам глиомы C6 крыс

Два альтернативных подхода использовались для оценки модуляторного эффекта ПНН на цитотоксический потенциал выбранных производных 4-тиазолидинона. Во-первых, анализ клеточного цикла проводился для исследования влияния препарат-ПНН комплексов на клеточный цикл. Дополнительно, двойное окрашивание Аннексин V/PI использовалось для различения точного типа клеточной смерти, индуцируемой этими нанокомпозитами.

Соединения Les-3288 и Les-3833 при низких дозах (0.1 мкг/мл и 0.5 мкг/мл) не производили видимого эффекта ни на прогрессию клеточного цикла, ни на индукцию апоптоза, как показано на Рис. 7 и Таблице 1. Однако комплексация обоих соединений с ПНН значительно увеличила число клеток в пред-G1 фазе (в 4 раза для Les-3288 и в 6 раз для Les-3833), что указывает на серьезный рост их про-апоптотического потенциала. Следует подчеркнуть, что ПНН в свободной форме не влиял на клеточный цикл или индукцию апоптоза; таким образом, наблюдаемое появление большой популяции пред-G1 клеток при лечении тиазолидинон-наноносчиком комплексами не может быть объяснено простым синергетическим эффектом ПНН и экспериментальных препаратов.

Для подтверждения, что наблюдаемый суб-G1 пик состоит из апоптотических клеток, анализировали результаты анализа двойного окрашивания Аннексин V/PI. Мы не наблюдали значительной экспозиции фосфатидилсерина (главного маркера ранней апоптоза, детектируемого FITC-конъюгированным Аннексин V) при лечении глиомы C6 низкими (0.1 и 0.5 мкг/мл) и высокими дозами Les-3288 (1.0 мкг/мл), предполагая, что это соединение слабый индуктор апоптоза. Вместо этого мы обнаружили увеличение некротической клеточной популяции (с 1.2% в контроле до 11.25% для Les-3288, 1.0 мкг/мл), что может указывать, что Les-3288 хотя бы частично вызывает некротическую смерть клеток. Однако комплексация Les-3288 с ПНН полностью изменила режим действия этого препарата. Было массовое увеличение чисел ранних апоптотических (Аннексин V(+)/PI(−)) и поздних апоптотических клеток (Аннексин V(+)/PI(+)), в то время как общее количество чисто некротических клеток оставалось на уровне контрольных (необработанных) клеток (Рис. 8a). Таким образом, связывание Les-3288 с ПНН не только сильно усиливает его про-апоптотическую активность по отношению к глиомным клеткам, но и снижает его потенциальный про-некротический механизм смерти клеток. Эти находки могут быть ключевыми для клинической практики, потому что про-некротические препараты не рекомендуются к использованию из-за массовой индукции воспаления, что неудобно для пациентов.

Удивительно, мы не наблюдали того же эффекта для комплекса Les-3833+ПНН. Фактически, про-апоптотическая активность комплекса Les-3833+ПНН была ниже по сравнению с Les-3288 в свободной форме на всех испытанных концентрациях (Рис. 8b). Такое резкое различие между обоими соединениями может быть объяснено специфичностью их химической структуры, и мы предполагаем, что в случае Les-3833 структура полимера должна быть оптимизирована для достижения лучших результатов.

Кометный анализ ДНК повреждения в клетках глиомы C6 крыс, вызванное производными 4-тиазолидинона в свободной форме и комплексированных с ПНН

Щелочной кометный анализ позволяет детектировать односторонние разрывы ДНК в щелочно-лабильных сайтах ДНК. Полученные результаты оценивали средним значением Оливинского хвостового момента (OTM). Наши данные показали, что лечение С6 крысиных глиомных клеток Les-3288, Les-3833 и ПНН (концентрация 0.5 мкг/мл) на 3 ч (Рис. 9 и 10) не вызывало значительного ДНК повреждения (OTM = 0.7299 ± 0.1276, OTM = 1.466 ± 0.3086, OTM = 0.5846 ± 0.1078 соответственно), по сравнению с необработанными клетками в контроле (OTM = 0.4541 ± 0.07273). Однако лечение клеток комплексом Les-3833 + ПНН (OTM = 2.3880 ± 0.2212) вызывало более значительное ДНК повреждение чем свободная форма Les-3833. Такого увеличения повреждения не наблюдалось для действия комплекса Les-3288+ПНН (Рис. 9 и 10).

Увеличение времени инкубации клеток до 6 ч (Рис. 11 и 12) вызывало большее ДНК повреждение во всех экспериментальных группах: Les-3288, Les-3288+ПНН, Les-3833, Les-3833+ПНН и Dox (положительный контроль). Однако эффекты комплексов Les-3288+ПНН и Les-3833+ПНН казались ниже, чем эффекты свободных форм Les-3288 и Les-3833. Следует отметить, что ДНК-повреждающий эффект комплексов обоих производных с ПНН был меньше такого эффекта от этих производных в свободной форме.

Результаты оценивали средним значением TailDNA%. Полученные данные показывают, что инкубация С6 крысиных глиобластомных клеток с веществами Les-3288, Les-3288+ПНН, Les-3833 и ПНН (все при концентрации 0.5 мкг/мл) в течение 3 ч (Рис. 13) не приводит к значительному ДНК повреждению (TailDNA% 4.157 ± 0.682; 3.530 ± 1.012; 8.807 ± 0.878; 3.298 ± 0.514 соответственно) по сравнению с контролем (TailDNA% = 3.638 ± 0.406), но лечение клеток комплексом Les-3833+ПНН (TailDNA% = 19.53 ± 1.48) вызывает более значительное повреждение ДНК чем свободная форма Les-3833. Увеличение времени инкубации до 6 ч (Рис. 14) во всех случаях приводит к большему повреждению ДНК. Снова, уровень TailDNA% детектируемый от действия комплексов обоих производных с ПНН был меньше уровня этого индикатора для действия этих производных в свободной форме.

Мы также использовали альтернативную пяти-категорийную систему классификации для классификации ДНК миграции и рассчитывали DI. Таблица 2 резюмирует проценты клеток глиомы C6 крыс для каждого уровня генотоoksiчности в течение 3 ч лечения. В контроле (необработанные клетки) обнаруживались более высокие проценты клеток в уровнях 0 (81.3%) и 1 (18.6%) по сравнению с этими уровнями в Les-3288 и ПНН-обработанных клетках. Комплексация Les-3288 с ПНН не привела к большому изменению в паттерне распределения ДНК комет. В противовес, Les-3833-обработанные клетки показывали более низкий процент клеток в 0 уровне (38.6%) и более высокий процент клеток в уровне 1 (60.0%), в то время как Les-3833 + ПНН-обработанные клетки демонстрировали значительно более низкий процент клеток в уровне 0 (8.0%) и гораздо более высокие проценты клеток с уровнями 1 (76.0%), 2 (13.3%) и 3 (2.6%). Интегративный индикатор ДНК повреждения (DI) в случае применения Les-3288 и его комплекса с ПНН не отличался значительно от контроля или свободного ПНН, в то время как DI от использования Les-3833 и его комплекса с ПНН был даже выше DI от использования Dox.

В этот временной интервал Les-3833 + ПНН-обработанные клетки демонстрировали более высокий процент клеток с уровнем 4 (5.3%) ДНК повреждения чем клетки, обработанные Les-3288 и другими экспериментальными соединениями, но проценты клеток в уровнях 2 и 3 были ниже (16.0% и 12.0% соответственно) чем от лечения другими соединениями (Таблица 2). Таблица 3 резюмирует проценты клеток глиомы C6 крыс с ДНК повреждением после 6 ч лечения. В общем, тенденция к появлению ДНК комет более высоких классов обнаруживалась при использовании комплексов Les-3833 и Les-3288, по сравнению со спектром классов ДНК комет, индуцируемых свободными формами этих агентов (Таблица 3). Однако интегративный индикатор ДНК повреждения (DI) рассчитанный для действия комплексов Les-3833 и Les-3288 был найден ниже такого индикатора для действия свободных форм этих агентов. Возможное объяснение может быть очень высоким уровнем DI при 6 ч действии изученных агентов, который даже выше уровня того индикатора, найденного для действия Dox (Таблица 3). Таким образом, мы наблюдаем временную зависимость ДНК повреждения, вызванного комплексами Les-3833 и Les-3288: при 3 ч лечения было увеличение DI в случае действия комплексов Les-3833 по сравнению с действием свободной формы Les-3833; однако при 6 ч лечения было снижение ДНК повреждения для действия комплексов обоих Les-3833 и Les-3288 по сравнению с таким повреждением, наблюдаемым для действия свободных форм этих агентов. Не было значительной временной зависимости для действия ПНН, в то время как значительное временно-зависимое увеличение (с 3 до 6 ч) DI было обнаружено для действия Dox (с 41.2 + 0.40 до 185.2 + 0.23).

ДНК интеркаляция производными 4-тиазолидинона — Les-3288 и Les-3833

Соединения Les-3288 и Les-3833 продемонстрировали определенную способность к интеркаляции ДНК молекул с примерно 15% и 10% соответственно замещением метилгрин красителя. EtBr, хорошо известный ДНК интеркалирующий агент, использовался как положительный контроль и показан замещать метилгрин краситель гораздо более эффективно (70%) (Рис. 15). Таким образом, Les-3288 и Les-3833 не способны эффективно интеркалировать между двумя комплементарными базами в двойной цепи ДНК.

Обсуждение

Существует две основные проблемы, препятствующие повышению эффективности лечения онкологических пациентов: (1) неадресованные действия многих антираковых препаратов, ведущие к общей токсичности и серьезным негативным побочным эффектам из-за повреждения нормальных тканей и органов; (2) быстрая (6-12 месяцев) разработка резистентности опухолевых клеток к применяемым антираковым препаратам, ведущая к потере эффективности действия препарата. Кроме того, существует третья техническая проблема плохой водорастворимости многих антираковых препаратов. Однако связывание этих препаратов с конкретными наномасштабными носителями может помочь решить проблему растворимости.

В этом исследовании мы адресовали первую и третью из вышеупомянутых проблем (a) выбором новых синтетических веществ (производных 4-тиазолидинона: Les-3288 и Les-3833), обладающих высокой антиопухолевой активностью и меньшей общей токсичностью в опухолевых животных и (b) применением новой платформы доставки препарата, обеспечивающей стабильные водные формы комплексов водонепроницаемых производных 4-тиазолидинона с ПЭГилированным полимером.

Производные 4-тиазолидинона — Les-3288 и Les-3833 — являются гетероциклическими соединениями с молекулярной массой 400-600 Да. Эти и другие связанные производные синтезировались в Львовском национальном медицинском университете (Украина), и большинство из них тестировались под Программой развития терапевтики в Национальном институте рака в Беттесде, МА (США). На основе этих оценок их антинеопластической активности наиболее перспективные вещества отбирались для дальнейшего изучения механизмов их цитотоксического действия и антиопухолевых эффектов. Les-3833 демонстрировал высокую токсичность по отношению к B16F10, WM793 и SK-Mel-28 меланома клеткам, и против человеческих раковых клеток легких A549, груди MCF-7, толстой кишки HCT116, яичников SKOV3 и лейкемических клеток (линии L1210, Jurkat, HL-60). Les-3288 и Les-3833 показывали высокую токсичность против млекопитающих глиомных клеток (линии C6, U251, U373).

Ранее мы нашли, что Les-3288 и Les-3833 были наиболее токсичными среди других изученных 4-тиазолидиноновых производных по отношению к крысиным глиомным клеткам C6 и человеческим глиобластомным U251 клеткам, хотя их применение для лечения клеток было очень сложным из-за их абсолютной нерастворимости в воде. Только использование DMSO с дополнительным нагревом было эффективным для приготовления растворимой формы производных (см. раздел "Материалы и методы"). Таким образом, было разумно искать способ улучшения доставки этих производных к целевым клеткам, и мы использовали синтетический ПНН для решения этой задачи. Комплексация изученных производных 4-тиазолидинона с примененным ПНН также усилила эффективность их антинеопластического действия. Механизмы про-апоптотического действия этих соединений демонстрировались вестерн-блот и FACS анализами. Следует отметить, что в здоровых экспериментальных животных Les-3288 и Les-3833 производят гораздо меньше негативных побочных эффектов таких как кардиотоксичность, гепатотоксичность и нефротоксичность чем широко используемый антираковый химиотерапевтический агент Dox.

В предшествующем исследовании мы показали, что Les-3288 не индуцировал РКФ производство во время своего про-апоптотического действия in vitro и эффектов в экспериментальных лабораторных животных, в то время как действие Les-3833 привело к такому производству; однако оно было меньше чем Dox. РКФ считаются главными эффекторами негативных побочных эффектов антираковых препаратов, особенно Dox. Таким образом, соединения Les-3288 и Les-3833 могут быть перспективными антираковыми препаратами, потому что они обладают антиопухолевой активностью, но не демонстрируют общую токсичность на уровне, характерном для эффективных антираковых лекарств таких как Dox.

Большое препятствие для продвижения Les-3288 и Les-3833 как антираковых препаратов — их плохая водорастворимость. Эта проблема также существует для других антираковых лекарств, таких как таксолы. Для паклитаксела эта проблема была решена использованием специального масла для приготовления медицинской формуляции. Однако специфические платформы доставки считаются более перспективными для создания "умных" препаратов, обладающих эффективным действием в организме. Специфические функциональные полимерные ПАВ с блочной, гребенчатой и блочно/ветвистой архитектурами, включая ПЭГ-содержащие, а также производные водные формы были разработаны и предложены для применения как носители для доставки Dox и металлического химиотерапевтического агента KP-1019 в Департаменте органической химии Львовского политехнического национального университета.

Поскольку производные 4-тиазолидинона являются водонепроницаемыми соединениями, DMSO использовался для приготовления их водорастворимых форм. Для избежания негативных последствий использования токсичного растворителя как DMSO, мы комплексировали эти производные с вышеупомянутым ПНН. Высокодисперсные и стабильные наномасштабные водные дисперсии этих веществ были получены и применены для лечения крысиных глиомных клеток C6.

Использование комплексов 4-тиазолидиноновых производных с ПНН привело к снижению общей токсичности этих соединений в экспериментальных животных. Ранее мы нашли, что когда экспериментальные антиопухолевые агенты (Les-3288, Les-3833, Les-3882) применялись в комплексе с синтетическим полимерным носителем, их действие сопровождалось гораздо меньшими изменениями в биохимических параметрах в сыворотке крови, характерных для кардиотоксичности, гепатотоксичности и нефротоксичности, по сравнению с теми для Dox. Таким образом, комплексация этих антиопухолевых агентов с ПНН и их применение в форме водорастворимых стабильных систем доставки снижает их токсические эффекты в экспериментальных животных по сравнению с действием этих веществ в свободной форме. Несколько систем доставки паклитаксела были предложены включая полимерные наночастицы, липидные формуляции, полимерные конъюгаты, неорганические наночастицы, углеродные нанотрубки, нанокристаллы и циклодекстриновые наночастицы.

Таким образом, комплексация Les-3288 с ПНН значительно увеличила про-апоптотическую активность этого экспериментального препарата, позволяя продвинуть его к доклиническим исследованиям на животных опухолевых моделях. Комплексация Les-3833 с тем же типом наноносчика была менее эффективной, и поэтому должен использоваться другой тип полимера.

Разработанные водные формы комплексов, а также свободные производные применялись для лечения крысиных глиомных клеток C6. Было найдено, что эти водные формы комплексов ПНН с 4-тиазолидиноновыми производными — Les-3288 и Les-3833 — усилили про-апоптотическое действие этих соединений. В другом исследовании мы продемонстрировали, что индукция апоптоза Les-3288 не сопровождалась РКФ индукцией, в противовес действию Dox и Les-3833. Таким образом, высокая антиопухолевая активность Les-3288 вместе с его низкой общей токсичностью при нацеливании на злокачественность в NK/Ly лимфоманосеих мышах BALB/C предполагает большой потенциал для этого экспериментального антиракового соединения. Представленные данные также предсказывают потенциальную полезность соединений Les-3288 и Les-3833 комплексированных с ПНН для лечения глиомы.

Клеточное деление, дифференциация и смерть — основные физиологические процессы, регулирующие тканевую гомеостаз в многоклеточных организмах. Нарушение геномной целостности и нарушенная регуляция клеточной смерти могут оба вести к неконтролируемому клеточному росту. Скомпрометированный процесс клеточной смерти может также способствовать геномной нестабильности. Становится ясно, что дисрегуляция клеточного цикла и процессов клеточной смерти играет ключевую роль в развитии основных расстройств таких как рак, сердечно-сосудистые заболевания, инфекция, воспаление и нейродегенеративные заболевания.

Мы нашли, что некоторые из 4-тиазолидиноновых производных, а именно Les-3288 и Les-3833, были даже более эффективными чем Dox в индукции апоптоза в крысиных C6 глиомных и человеческих U251 глиобластомных клетках in vitro. Следует отметить, что опухоли мозга относятся к злокачественностям, наиболее устойчивым к применяемым химиотерапиям, и выживаемость пациентов с этими опухолями крайне низка.

Показано, что комплексация с этим ПНН усилила про-апоптотическое действие 4-тиазолидиноновых производных (Les-3288 и Les-3833). В другом исследовании мы продемонстрировали, что индукция апоптоза Les-3288 не сопровождалась РКФ индукцией, в противовес действию Dox и частично противовес действию Les-3833. Эти данные могли объяснить более низкую общую токсичность Les-3288 по сравнению с Dox.

Результаты FACS анализа согласуются с предложением, что усиление про-апоптотического действия изученных 4-тиазолидиноновых производных вызвано их комплексацией с новым ПНН. Такая комплексация Les-3288 и Les-3833 увеличила отношение пред-G1 клеток в популяции обработанных крысиных глиомных клеток C6, уменьшила отношение G1 клеток и увеличила действие G2/M клеток. Эти данные предполагают усиление как цитотоксического действия (апоптоз), так и цутостатического действия (блок в G2/M фазе клеточного цикла) изученных производных комплексированных с ПНН. В общем, механизм апоптоза убийства глиомных клеток комплексом Les-3288 + ПНН и комплексом Les-3833 + ПНН был демонстрирован результатами FACS анализа появления Аннексин V одиночных положительных крысиных глиомных клеток C6.

Участие механизмов апоптоза в действии изученных 4-тиазолидиноновых производных также подтверждалось результатами ДНК кометного анализа. Было найдено, что комплексация Les-3833 с ПНН привела к снижению (по сравнению со свободным Les-3833) отношения крысиных глиомных клеток C6 в "0" ДНК кометах и одновременному увеличению отношения "1", "2" и "3" комет (3-ч лечение клеток). При 6 ч лечения комплексом Les-3833+ПНН было большое увеличение (по сравнению со свободным Les-3833) отношения "1" комет, увеличение отношения клеток с наиболее выраженным ДНК повреждением ("4" кометы) и снижение отношений "2" и "3" комет. Следует отметить, что ДНК-повреждающие эффекты Les-3288 и Les-3833 измеренные при 6 ч были выше таких эффектов комплексов этих производных с ПНН (см. Таблицу 3). Возможное объяснение здесь может быть очень высоким уровнем DI при 6 ч действии изученных агентов, который даже выше уровня того индикатора, найденного для действия Dox (Таблица 3). Не было временной зависимости в действии ПНН, в то время как значительное временно-зависимое увеличение (с 3 до 6 ч) (с 41.2 + 0.40 до 185.2 + 0.23) DI было детектировано для действия Dox.

Таким образом, комплексация 4-тиазолидиноновых производных — Les-3288 и Les-3833 — с ПНН усилила цитотоксический эффект этих соединений по отношению к крысиным глиомным клеткам C6, и этот эффект был достигнут через механизмы апоптоза включая ДНК повреждение наблюдаемое как ДНК кометы в электрофоретных клетках.

Мы использовали ДНК интеркаляционный тест для исследования прямого нацеливания ДНК 4-тиазолидиноновыми производными и раскрыли только слабое замещение метилгрин красителя (15% и 10% замещения для Les-3288 и Les-3833 соответственно), интеркалированного в ДНК лосося, по сравнению с замещением EtBr, использованным как положительный контроль (70%).

Таким образом, проведение цитотоксических экспериментов in vitro с 4-тиазолидиноновыми производными — Les-3288 и Les-3833 — было более удобным благодаря использованию водных форм 4-тиазолидиноновых производных — Les-3288 и Les-3833 — комплексированных с новым ПНН. Кроме того, мы продемонстрировали, что новые синтетические 4-тиазолидиноновые производные (Les-3833 и Les-3288) обладали лечебными эффектами in vivo по отношению к NK/Ly лимфоме, привитой BALB/C мышам, и те эффекты были сопоставимы с такими эффектами Dox. В то же время действие этих производных приводило к гораздо меньшим негативным побочным эффектам, измеренным как изменения в числе эритроцитов, нейтрофилов и лимфоцитов в крови животных и активности аспартатовой и аланиновой аминотрансфераз в их сыворотке крови, по сравнению с действием Dox.

Заключения

Комплексация Les-3288 и Les-3833 с ПЭГ-содержащим ПНН усилила их цитотоксическое действие по отношению к крысиным глиомным клеткам C6. Цитотоксическое действие реализовывалось апоптотическими механизмами и подтверждалось FACS анализом как присутствие пред-G1 фракции в крысиных глиомных клетках C6 и Аннексин V-одиночных положительных клеток. ДНК кометный анализ раскрыл односторонние разрывы в ядерной ДНК обработанных глиомных клеток C6, что вероятно не было вызвано интеркаляцией изученных соединений в ДНК молекулу. Les-3288 и Les-3833, стабилизированные амфифильным ПЭГ-содержащим ПНН, привели к водным формам и обеспечили усиление их антиопухолевого эффекта in vitro по сравнению со свободной формой препаратов.

Аббревиатуры

DMSO:

Диметилсульфоксид

Dox:

Доксорубицин

EtBr:

Этидиум бромид

FACS:

Флуоресцентно-активированное клеточное сортирование

ROS:

Реактивные кислородные формы

PBS:

Фосфатно-буферный салин

PEG:

Полиэтиленгликоль

PI:

Пропидиум иодид

PNC:

Полимерный наноносчик

SEM:

Сканирующая электронная микроскопия

TEM:

Проницающая электронная микроскопия

VEP:

2-Трет-бутилперокси-2-метил-5-гексен-3-ин