Нанчастицы лантан-стронций манганита: токсичность для эпителия дыхательных путей и влияние на секрецию слизи

Аннотация

Исследования токсичности нанчастиц интенсифицировались, поскольку эти материалы становятся повсеместны в повседневных продуктах. Некоторые нанчастицы могут стимулировать секрецию слизи, потенциально вредя целостности дыхательных путей. Лантан-стронций манит (LSM) — перисловитная нанчастица, широко используемая в твердооксидных топливных элементах (SOFC) благодаря своей высокой электрической проводимости, надежной электрохимической активности для реакции восстановления O₂, термической стабильности и долгосрочной производительности. Однако ограниченные данные существуют о биологических эффектах LSM. В этом исследовании первичные трахеальные эпителиальные клетки экспонировали LSM концентрациями до 500 мкг/мл. Результаты указали только умеренные эффекты на живучесть клеток, производство реактивных форм кислорода (РФК), выброс цитхрома C и экспрессацию каспазы-3. В то время как маркеры апоптоза оставались в значительной степени неизменными, LSM значительно ингибировал секрецию слизи доза-зависимым образом. Таким образом, хотя LSM показывает низкую цитотоксичность по отношению к клеткам дыхательных путей, его способность снижать продукцию слизи может компрометировать клиренс дыхательных путей.

Введение

Лантан-стронций манит (LSM) обладает перисловитной кристаллической структурой с общей формулой La₁₋ₓSrₓMnO₃, где x отражает уровень стронциевого допинга. Этот материал можно обрабатывать в порошок для ленточной литья, воздушно/термической/плазменной распыли и топливно-элементных приложений. Высокая удельная площадь поверхности и электрохимическая производительность LSM делают его ведущим кандидатом электрода для SOFC, которые являются центральными для الناشющей водородной экономики. Несмотря на обширные исследования механических и электрических свойств LSM, его биологические взаимодействия остаются недостаточно изученными. Многие нанчастицы известны тем, что повышают секрецию слизи и способствуют респираторным расстройствам. Новые данные предполагают, что LSM может также служить носителем лекарств или контрастным агентом для визуализации, но его потенциальная токсичность должна быть прояснена перед любым биомедицинским развертыванием. Это исследование оценивает цитотоксический профиль LSM в первичных трахеальных эпителиальных клетках, оценивая генерацию РФК, митохондриальную целостность, апоптоз и секрецию слизи.

Результаты и обсуждение

Характеризация нанчастиц и живучесть клеток

Поверхностная морфология изучалась сканирующей электронной микроскопией (SEM). LSM нанчастицы демонстрировали грубую поверхность и агрегировались в кластеры от ~35 нм до >200 нм (Рис. 1). Живучесть клеток измеряли CCK-8 анализом. Живучесть резко падала между 50 и 100 мкг/мл, но затем стабилизировалась, оставаясь стабильной при более высоких концентрациях (Рис. 2).

Производство РОС и выброс муцина

Уровни РОС kvantифицировали с использованием CM-H₂DCFDA флуоресценции. Увеличение концентрации LSM незначительно не повышало РОС; точка 250 мкг/мл показала наибольшее отклонение, но оставалась статистически незначимой (Рис. 3). Секреция муцина, измеренная фермент-связанным лектиновым анализом (ELLA), прогрессивно снижалась с увеличением доз LSM, падая до ~40% от контроля при 500 мкг/мл (Рис. 4).

Митохондриальная целостность и апоптоз

JC-1 окраска выявила митохондриальную деполяризацию при концентрациях ≥100 мкг/мл (Рис. 5). Несмотря на это, выброс цитхрома C и активация каспазы-3 показали лишь незначительные снижения, указывая на ограниченную индукцию апоптоза (Рис. 6).

Заключение

Эта первая оценка токсичности LSM в эпителиальных клетках дыхательных путей демонстрирует пренебрежимую цитотоксичность и апоптоз, но выраженную ингибицию секреции слизи. В то время как генерация РОС и митохондриальный ущерб были минимальными, сниженное высвобождение слизи может нарушать клиренс дыхательных путей и требует тщательной оценки для будущих применений в энергетических и биомедицинских областях.

Материалы и методы

Культура первичных трахеальных клеток

Первичные бовины трахеальные эпителиальные клетки изолировали по установленным протоколам, культивировали в сывороточной свободной среде (SFM), добавленной ЭРФ 1-53 и бовиным гипофизарным экстрактом (BPE), и поддерживали на коллагено-покрытых пластинках при 37 °C, 5% CO₂. Плотность клеток мониторили трипан-синим исключением.

Подготовка клеток и анализ живучести

Клетки посеяли в коллагено-покрытые 96-колодчатые пластинки (5×10⁴ клеток/колодка) для анализов живучести и в 4-колодчатые пластинки (5×10⁵ клеток/колодка) для кальция, РОС и митохондриальных исследований. После 24-часовой инкубации среду заменяли на PBS, затем на LSM суспензии. Живучесть клеток kvantифицировали CCK-8 анализом (WST-8 конверсия в формазан) и выражали в процентах от необработанного контроля.

Нанчастицы лантан-стронций манганита

LSM (La₀.₁₅Sr₀.₈₅MnO₃, 35 нм, 99,5%) ультразвуково обрабатывали и тестировали при 500, 250, 100 и 50 мкг/мл. Концентрации подбирали для соответствия типичным воздействиям TiO₂ нанчастиц, сообщенным в литературе.

Сканирующая электронная микроскопия

Частицы капляли на кремниевые подложки, сушили на воздухе и образовывали Zeiss Gemini SEM для подтверждения распределения размеров.

Анализ реактивных форм кислорода

Производство РОС оценивали CM-H₂DCFDA флуоресценцией после 15-минутного воздействия LSM. Интенсивность флуоресценции сравнивали с необработанными контролями.

Измерение митохондриального ущерба

JC-1 краситель использовали для оценки митохондриального мембранного потенциала; красные/зеленые флуоресцентные соотношения измеряли флуоресцентной микроскопией с 10-минутными интервалами.

Секреция муцина и ELLA

После 15-минутного воздействия LSM, supernatantes собирали, центрифугировали и анализировали на муцин через ELLA с использованием WGA-HRP и TMB субстрата. Абсорбцию считывали при 450 нм.

Анализ маркеров апоптоза

Клеточные лизаты готовили RIPA буфером и пробовали на цитхром C и активную каспазу-3 протоколами ELISA. Вторичные HRP-сопряженные антитела облегчали детекцию.

Статистический анализ

Данные представлены как среднее ± SD из минимум трех независимых экспериментов. Однофакторный ANOVA определял значимость (p < 0,05).

Аббревиатуры

BPE

Бовиний гипофизарный экстракт

ELISA

Иммуноферментный анализ

LSM

Лантан-стронций манит

ROS

Реактивные формы кислорода

SFM

Сывороточно-свободная среда

SOFCs

Твердооксидные топливные элементы