Исследование токсичности наночастиц перовскита на эпителиальные клетки дыхательных путей

Введение

Манганит лантана-стронция (LSM) представляет собой наночастицу с кристаллической структурой на основе перовскита. Он принимает общую форму «ABO3», где лантан и стронций находятся в участке A, а марганец - в участке B. Это приводит к его общей формуле La _{1 - x} Sr _x MnO ₃ , где x обозначает уровни легирования стронцием, которые зависят от области применения наночастицы. LSM можно использовать в порошкообразной форме для отливки ленты, напыления воздухом / тепловым / плазменным напылением, а также для топливных элементов [1,2,3,4].

В недавних усилиях по сокращению загрязнения и созданию водородной экономики много исследований было сосредоточено на твердооксидных топливных элементах (ТОТЭ) [5, 6]. В свою очередь, перовскиты LSM привлекли внимание исследователей из-за их важной роли в ТОТЭ как одного из важнейших электродных материалов [4, 7]. Наночастицы LSM представляют собой сферические металлические частицы с высокой поверхностью, которые выглядят как коричневый или черный кристаллический порошок. Хотя были проведены многочисленные исследования механических и электрических свойств LSM [1, 3, 8, 9], очень мало исследований было сосредоточено на его биологических эффектах [10,11,12]. Многочисленные наночастицы продемонстрировали склонность к секреции и накоплению слизи, таким образом, они связаны с респираторными заболеваниями [13, 14]. Исследования наночастиц LSM показывают многообещающие идеи для биомедицинских приложений [15,16,17]. Недавно исследования LSM показали его потенциал в противораковой терапии [12, 18, 19]. При правильных процедурах синтеза и модификациях поверхности LSM может выступать в качестве контрастного вещества для МРТ и гипертермии, а также в качестве носителя лекарств [20,21,22]. Однако перед дальнейшим медицинским применением следует оценить возможность токсичности. Есть лишь ограниченные исследования токсического действия перовскита [10, 23], и до сих пор не сообщалось о значительном токсическом эффекте.

В этом исследовании мы исследовали токсичность наночастиц LSM при воздействии на первичные эпителиальные клетки трахеи, чтобы определить диапазон концентраций токсичности. Затем мы проанализировали продукцию активных форм кислорода (АФК) и повреждение митохондрий, а также реакцию секреции слизи с помощью флуоресцентной микроскопии [24]. Уровень прогрессирования апоптоза с наночастицами LSM или без них исследовали с помощью тестов на цитохром С и каспазу 3 [25].

Результаты и обсуждения

Характеристика НЧ и анализ жизнеспособности клеток

Токсичность наночастиц зависит от их физических свойств, таких как геометрия, распределение по размерам и площадь поверхности. Перед экспериментами по токсичности эти характеристики были проанализированы с использованием SEM. Наночастицы LSM продемонстрировали значительную шероховатость поверхности и были распределены в агрегатах различного размера, примерно от 35 нм до 200 нм в диаметре (рис. 1).

СЭМ-изображение физических характеристик LSM. Размер отдельных частиц составлял около 35 нм в диаметре, а размер агрегации LSM варьировался от 200 нм до нескольких мкм

Мы провели многочисленные эксперименты по токсичности на клетках дыхательных путей трахеи с различными НЧ в нашем предыдущем исследовании [26, 27], поэтому эта линия клеток была выбрана для этого биологического исследования. Для оценки общей токсичности LSM для клеток трахеи был проведен колориметрический анализ жизнеспособности клеток CCK8 [25, 27]. Как видно на рис. 2; Анализ жизнеспособности клеток показал резкое изменение популяции при концентрациях LSM от 50 до 100 мкг / мл. Однако при концентрациях LSM более 100 мкг / мл популяция сохранялась в относительно стабильном диапазоне, не показывая значительных изменений.

Жизнеспособность клеток трахеи после увеличения концентрации LSM показана здесь как Log [нг / мл]. Для измерения использовали колометрический анализ жизнеспособности клеток CCK8 и рассчитали его среднее значение на приращение концентрации. ( нет > 6)

Производство ROS и выпуска муцина

Продукция ROS провоцирует апоптоз, таким образом, способствует цитотоксичности наночастиц. Согласно рис. 3; Производство АФК, увеличение концентрации LSM не сильно влияет на производство АФК. Концентрация LSM 250 мкг / мл больше всего отличалась от контроля, но ее отклонение было незначительным, что указывает на то, что LSM не оказывает заметного влияния на продукцию ROS.

Продукция ROS клетками трахеи после увеличения концентрации LSM. Отношения продукции ROS для каждой обработки концентрации LSM были рассчитаны по сравнению с контрольной группой. ( нет > 100)

Из рис. 4; mucus bata, после 15-минутной обработки не наблюдалось значительного влияния на жизнеспособность клеток, а по мере увеличения концентрации LSM секреция муцина снижалась. Высвобождение муцина снижалось до 40%, когда клетки обрабатывали 500 мкг / мл LSM, и потенциально могло быть снижено еще больше при еще более высоких концентрациях LSM. Это сокращение говорит о том, что LSM ингибирует выделение слизи.

Секреция муцина возникает после 15-минутной обработки увеличивающихся концентраций LSM. Отношения были рассчитаны для каждой концентрации LSM путем сравнения ее с контрольной группой. Оценка секреции муцина на клеточной поверхности проводилась с помощью ELLA (ферментно-связанный лектиновый анализ). (*: n > 6, p <0,05)

Процессы повреждения митохондрий и апоптоза

Ранняя стадия апоптоза обычно представлена ​​повреждением митохондрий. Для анализа этого явления в качестве индикатора потенциала митохондриальной мембраны использовали краситель JC-1. Отношение интенсивности, индуцированное красителем JC-1, коррелирует с потерей целостности митохондрий, и, согласно фиг. 5, по мере увеличения концентрации LSM повреждение митохондрий значительно увеличивалось после обработки 100 мкг / мл LSM. Хотя результаты показывают, что повреждение митохондрий является значительным после обработки LSM 100 мкг / мл, каспаза 3 и цитохром C демонстрируют небольшое снижение, как подробно описано ниже. Этот результат предполагает, что LSM может вызывать повреждение митохондрий, но клетки по-прежнему обладают способностью оставаться на низком уровне при прогрессировании апоптоза и снижать экспрессию маркера апоптоза.

Результаты интенсивности флуоресценции индикаторного красителя JC-1 в четырех различных условиях обработки трахейной клетки для индикации целостности митохондрий. (*, **, ***: н > 100, p <0,05)

Апоптоз также можно измерить по экспрессии цитохрома С и каспазы 3. Как показано на фиг. 6а; В результате апоптоза цитохрома С наблюдалось умеренное снижение скорости апоптоза среди различных концентраций LSM и контрольной группы. Эту же тенденцию можно увидеть на рис. 6b; результат апоптоза каспазы 3, что указывает на очень минимальную токсичность из-за LSM. В целом, результаты повреждения митохондрий и апоптоза клеток трахеи дыхательных путей из-за LSM были очень низкими, что позволяет предположить, что LSM не оказывает значительного токсического действия на эпителиальные клетки трахеи.

Измерены результаты апоптоза с помощью a экспрессия цитохрома С, b экспрессия каспазы 3. Отношения были получены для обработки концентрации LSM по сравнению с контрольной группой (HBSS). (*: n > 100, P <0,05)

Выводы

Недавние исследования нанотоксичности привлекли большое внимание к токсическому действию НЧ из-за их широкого использования в промышленных и коммерческих продуктах. Основная проблема нанотоксичности связана с образованием АФК. Например, TiO ₂ НЧ рассматриваются как своего рода канцерогенный материал из-за большого количества генерируемых АФК, которые могут привести к гибели клеток и мутациям [28]. Существуют различные типы материалов и соединений, классифицируемых как перовскит, о которых в последние годы сообщалось о множестве различных применений. Это первое исследование по определению токсичности LSM для эпителиальных клеток дыхательных путей, которые являются одним из основных путей поглощения НЧ клетками. Это исследование было направлено на изучение влияния LSM на клетки трахеи с целью оценки его токсичности. Результаты показали, что LSM не оказывает значительного влияния на прогрессирование апоптоза, измеренное по экспрессии цитохрома C и каспазы 3, целостность митохондрий, измеряемую по флуоресценции JC-1, выживаемость клеток и продукцию ROS. Однако лечение показало подавляющий эффект на секрецию слизи, уменьшая выработку слизи по мере увеличения концентрации LSM. В конечном счете, благодаря результатам, полученным в этом исследовании, было обнаружено, что LSM нетоксичен по отношению к эпителиальным клеткам дыхательных путей, не вызывая значительных изменений в стадиях апоптоза, дополнительно снижая секрецию слизи, которая может поставить под угрозу жизнеспособность клеток. Это предполагает способность LSM влиять на очищение дыхательных путей от слизи. В нашем исследовании мы продемонстрировали потенциал токсичности для НЧ LSM, и результаты показывают, что потенциальный риск токсического эффекта относительно ниже, чем у других НЧ, которые использовались для промышленного и коммерческого применения. Однако необходимо провести дальнейшие исследования, чтобы определить, можно ли безопасно включать LSM в качестве активного ингредиента в коммерческие солнечные батареи и аккумуляторы энергии.

Материалы и методы

Культура первичных клеток трахеи

Первичные эпителиальные клетки трахеи выделяли из нормального бронхиального эпителия крупного рогатого скота в соответствии с ранее опубликованными протоколами [26]. Клетки выращивали и поддерживали в бессывороточной среде (SFM) с добавлением преквалифицированного человеческого рекомбинантного эпидермального фактора роста 1–53 (EGF 1–53) и экстракта бычьего гипофиза (BPE) (Thermo Fisher). Первичные клетки трахеи культивировали в 15-сантиметровых планшетах Falcon, предварительно покрытых коллагеном (), и инкубировали в увлажненном инкубаторе при 37 ° C, 5% CO ₂ . Подсчет клеток выполняли с использованием исключения трипанового синего (Sigma) и гемоцитометра Bright-Line. Клетки прошли, когда слияние достигло 80%.

Подготовка ячейки

Клетки были засеяны 5 × 10 ⁴ клеток на лунку в покрытом коллагеном 96-луночном планшете (75% конфлюэнтности) для анализа жизнеспособности клеток, 5 × 10 ⁵ клеток на лунку в покрытом коллагеном 4-луночном планшете (75% конфлюэнтности) для Ca ²⁺ сигнализация, анализ АФК и митохондрий. После посева клетки инкубировали в течение 24 ч в SFM с добавлением преквалифицированного человеческого рекомбинантного EGF 1–53 и BPE (Thermo Fisher). Через 24 ч инкубации среду удаляли из клеток и дважды промывали культуру физиологическим раствором с фосфатным буфером. Промывка PBS была заменена наночастицами, обработанными ультразвуком в Ca ²⁺ содержащие Хэнкса или Са ^{2 +} -бесплатно Хэнкс.

Анализ жизнеспособности клеток

Фотоколориметрическое определение цитотоксичности оценивали с использованием красителя CCK-8 (Dojindo Laboratories, Токио, Япония) [27, 25]. CCK-8, будучи нерадиоактивным, предлагает колориметрическое определение процента жизнеспособных клеток, подвергшихся воздействию различных концентраций NP. Этот набор для анализа измеряет метаболическую активность дегидрогеназ в жизнеспособных клетках по превращению соли тетразолия WST-8 в водорастворимый формазан. Его получали добавлением CCK-8 в HBSS в разведении 1:10. Клетки промывали HBSS и загружали по 100 мкл красителя в каждую лунку. Затем клетки инкубировали при 37 ° C, 5% CO ₂ инкубатор на 6 ч. Оптическую плотность измеряли с использованием планшет-ридера Thermo Multiscan EX (планшет-ридер Thermo Multiskan EX, VWR, Калифорния, США) при оптической плотности 450 нм (эталон 650 нм). Среднее значение было рассчитано на основе трех отдельных наборов данных для каждой концентрации, включая необработанный контроль, из трех независимых экспериментов и выражено в виде процентной доли от необработанного контроля.

Жизнеспособность клеток рассчитывалась по \ (\ frac {OD_ {450 \ mathrm {treatment}} - {OD} _ {650 \ mathrm {treatment}}} {O {D} _ {450 \ mathrm {control}} - O {D} _ {650 \ mathrm {control}}} \ ast 100 \% \).

Наночастицы лантана, стронция, манганита

Лантан стронций манганит (La _0,15 Sr _0,85 MnO ₃ ) (LSM) наночастицы (35 нм, 99,5%) (Nanostructured &Amorphous Materials Inc.) использовались в этом исследовании. Все образцы НЧ перед использованием обрабатывали ультразвуком. Используемые концентрации составляли 500 мкг / мл, 250 мкг / мл, 100 мкг / мл и 50 мкг / мл. Диапазон используемых концентраций определялся с учетом концентраций TiO ₂ . НЧ, обнаруженные в предыдущих отчетах (Dowding et al. 2014; Dowding et al. 2012; Gurr et al. 2005; Hirst et al. 2009; Niu et al. 2011). НЧ LSM восстанавливали раствором Хэнкса (Invitrogen, CA, USA) перед индивидуальным тестированием и обрабатывали ультразвуком в течение приблизительно 5 минут непосредственно перед использованием.

Сканирующий электронный микроскоп

НЧ LSM готовили с концентрацией 5 мкг / мл и отливали по каплям на чистую силиконовую пластину и сушили на воздухе для удаления остаточной воды. Размер наночастиц был независимо подтвержден с помощью сканирующего электронного микроскопа (Gemini SEM, Zeiss).

Производство внутриклеточных активных форм кислорода

Продукцию активных форм кислорода (АФК) оценивали с помощью флуоресцентной микроскопии с использованием окисления красителя CM-H2DCFDA (Invitrogen, CA, USA) [24]. Клетки (1 × 105 клеток / лунку) культивировали в течение 24 ч перед промывкой раствором PBS. Образцы окрашивали, нанося загрузочный буфер, содержащий 2 мкМ восстановленного красителя CM-H2DCFDA в среде, на 30 мин. Окрашенные образцы трижды промывали PBS и оставляли на 5 минут для восстановления клеточных эстераз, чтобы гидролизовать AM или ацетатные группы и сделать краситель чувствительным к окислению. Буфер Хенкса, содержащий НЧ LSM в концентрациях от 0 до 500 мкг / мл в 50 мкг / мл, затем инкубировали с клетками в течение 15 мин при 37 ° C с последующей промывкой PBS. Флуоресцентные изображения ROS, генерируемые в клетках, были захвачены и проанализированы путем расчета отношения увеличения интенсивности флуоресценции между различными обработками и контрольными группами.

Измерение повреждения митохондрий

Внутренний трансмембранный потенциал митохондрий оценивали с использованием полихроматического 5,5 ', 6,6'-тетрахлор-1,1', 3,3'-тетраэтилбензимидоазолилкарбоцианио иодида (JC-1 Sigma) [25]. JC-1 представляет собой липофильный флуоресцентный катион, который может быть включен в митохондриальную мембрану, где он зависит от агрегатов состояния мембранного потенциала. Агрегация изменяет флуоресцентные свойства JC-1, переходя от зеленой к красной флуоресценции. Неповрежденные митохондриальные мембраны, окрашенные JC-1, демонстрируют ярко выраженную красную флуоресценцию митохондрий, которую можно обнаружить с помощью флуоресцентной микроскопии. Нарушение потенциала митохондриальной мембраны приводит к последующему снижению зеленой флуоресценции и увеличению красной флуоресценции. Перед стимуляцией НЧ клетки дважды промывали PBS и инкубировали с окрашивающим реагентом JC-1 (1:1000) в среде при 37 ° C в течение 30 мин с последующей промывкой PBS и обработкой клеток. Потенциал митохондриальной мембраны определяли с помощью флуоресцентной микроскопии с интервалами времени 10 мин.

Измерение [Ca ²⁺ ] _c

Все эксперименты проводились в темноте. Клетки загружали красителем Rhod-2 AM (1 мкМ) ( K _d =570 нМ, λ _Ex =552 нм, а λ _Em =581 нм) (Invitrogen, CA, USA) в течение 45 мин. Затем клетки дважды промывали PBS перед инкубацией с буфером Хенкса и обрабатывали НЧ подходящей концентрации. Все Ca ²⁺ эксперименты по передаче сигналов проводились в терморегулируемом состоянии при 37 ° C, установленном на микроскопе Nikon (Nikon Eclipse TE2000-U, Токио, Япония) [24, 25, 27] (Chen et al. 2011).

Секреция муцина и ELLA

Клетки засевали в количестве 1 × 10 ⁶ . клеток на лунку в 6-луночном планшете и культивировали в течение 24 часов. Затем первичные клетки трахеи промывали PBS и стимулировали в течение 15 мин соответствующими концентрациями LSM NP (500 мкг / мл, 250 мкг / мл и 100 мкг / мл), приготовленными в PBS. Супернатант, содержащий секретированный муцин, собирали и ненадолго центрифугировали при 8000 об / мин для удаления остаточных НЧ. Затем супернатант инкубировали в 96-луночном планшете (Nunc MaxiSorp, VWR, CA, USA) в течение ночи при 4 ° C. После этого 96-луночный планшет промывали PBST (PBS + 0,05% Tween-20) и затем блокировали 1% BSA. 96-луночный планшет снова промывали PBST и инкубировали с лектином (агглютинин зародышей пшеницы, WGA) (Sigma-Aldrich, Миссури, США), конъюгированным с пероксидазой хрена (HRP; 5 мг / мл) (Sigma-Aldrich, MO, США), при 37 ° С в течение 1 ч. Субстрат, 3,3 ', 5,5'-тетраметилбензидин (TMB; Sigma-Aldrich, Миссури, США), добавляли в каждую лунку при комнатной температуре, а затем H ₂ SO ₄ (Sigma-Aldrich, Миссури, США) для прекращения реакции. Оптическая плотность была измерена при 450 нм (Chen et al. 2011; Kemp et al. 2004).

Подготовка к иммуноферментному анализу (ELISA)

Клетки засевали плотностью 1 × 10 ⁶ . плотности клеток в 6-луночном планшете и культивировали в течение 24 часов. Затем клетки трахеи промывали PBS. Клетки стимулировали в течение 2 ч соответствующими концентрациями НЧ LSM (0–500 мкг / мл), приготовленными в PBS. Клеточный лизинг проводили с помощью реагента клеточного лизата Peirce RIPA, и лизат собирали и переносили в микроцентрифужную пробирку. Образцы центрифугировали при ~ 14 000 × g в течение 15 мин для осаждения клеточного дебриса и НЧ. Затем супернатант инкубировали в 96-луночном планшете в течение ночи при 4 ° C. После этого 96-луночный планшет промывали PBST (PBS + 0,05% Tween-20) и затем блокировали 1% BSA. 96-луночный планшет снова промывали PBST и инкубировали с кроличьими анти-каспазой 3, антителом в активной форме (Millipore, поликлональное антитело) и мышиным антицитохромом C (Invitrogen, моноклональное антитело) при комнатной температуре в течение 2 часов. Затем используйте вторичные антитела (конъюгированные против кроличьей и антимышиной пероксидазы хрена, HRP, Millipore) и следуйте той же процедуре, что и ELLA, для измерения интенсивности поглощения [25].

Анализ изображений

Анализ изображений проводился с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа Nikon Eclipse TE2000-U. Каждая фотография была сделана с увеличением × 10 и проанализирована с использованием Simple PCI (Compix Inc., Imaging Systems, Sewickle, PA, USA). Данные, показанные для концентраций кальция в цитозоле, представлены флуоресценцией Rhod-2. Изображения снимались каждые 0,5 с и автоматически преобразовывались в оттенки серого для анализа. Простой PCI предоставил интенсивности пикселей (среднее значение серого) выбранных областей, каждая со средней флуоресценцией на кадр для 200 ячеек в течение 100 с (~ 200 кадров) сразу после стимуляции наночастицами. Данные, показанные для иммунофлуоресцентного окрашивания, представляют экспрессию белка после 1-2 ч обработки графена. Все эксперименты проводились и подтверждались независимо не менее трех раз.

Статистический анализ

Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Каждый эксперимент проводился независимо не менее трех раз. Статистическая значимость была определена с помощью одностороннего анализа ANOVA с p значения <0,05 (GraphPad Prism 4.0, GraphPad Software, Inc., Сан-Диего, Калифорния, США).

Сокращения

BPE:

Экстракт гипофиза крупного рогатого скота

ELISA:

Иммуноферментный анализ

LSM:

Лантан стронций манганит

ROS:

Активные формы кислорода

SFM:

Бессывороточная среда

SOFC:

Солнечные окисленные топливные элементы