64Cu-маркированные нанозонды AGuIX: PET-направленная радиотерапия и радиосенсибилизация у мышей с опухолями HepG2

Аннотация

Радиотерапия печеночного рака ограничена низкой толерантностью печени к ионизирующему излучению, делая радиосенсибилизаторы необходимыми для снижения требуемых доз. Наночастицы AGuIX — ультра-малые гадолиниево-основанные переносчики — уникально подходят для доставки радиоизотопов или флюорофоров для SPECT, PET, флуоресцентной визуализации и мультимодальной визуализации, в то время как их высокий атомный номер также придает опухолевые сенсибилизационные свойства. Понимание их биораспределения и фармакокинетики критично для оценки удержания в опухоли во время радиотерапии. В этом исследовании мы эффективно маркировали AGuIX ⁶⁴Cu через его встроенный хелатор DOTA. Данные биораспределения показали выраженное накопление ⁶⁴Cu-AGуIX в ксеногрантах HepG2 у голых мышей, указывая на его перспективность как тераностического зонда для образ-ориентированной радиотерапии гепатоцеллюлярного карциномы (HCC). Трансмиссионная электронная микроскопия подтвердила внутриклеточное поглощение наночастиц HepG2. Радиационные эксперименты показали значительное снижение захвата ¹⁸F-FDG в опухолях, облученных через 1 ч после введения AGuIX, предоставляя доказательство концепции, что AGuIX функционирует как PET-видимый радиосенсибилизатор для радиотерапии печеночного рака.

Введение

Гепатоцеллюлярная карцинома (HCC) входит в число наиболее распространенных злокачественных новообразований мира: 782 500 новых случаев и 745 500 смертей зафиксировано в 2012 г., из которых 70-90% — HCC. Большинство пациентов обращаются на поздней стадии, ограничивая куративные варианты 20-25% случаев. Следовательно, радиотерапия стала ключевым компонентом мультидисциплинарного управления HCC. Однако нормальная ткань печени ограничивает эскалацию дозы, так как радиационно-индуцированная болезнь печени (RILD) несет серьезный риск. Радиосенсибилизаторы, преференциально накапливающиеся в опухолевой ткани, могут увеличить гибель опухолевых клеток при более низких дозах, тем самым снижая токсичность для здоровой ткани.

AGuIX, новая гадолиниева наночастица (~5 нм диаметром), впервые описанная в 2013 г., быстро клирируется почками и может быть функционализована радиоактивными или флуоресцентными метками для SPECT, PET, МРТ или флуоресцентной визуализации. Высокое содержание гадолиния наделяет AGuIX опухолевыми сенсибилизационными способностями, продемонстрированными in vitro на различных клеточных линиях с коэффициентами усиления сенсибилизации (SER) от 1,1 до 2,5. Поскольку AGuIX показывает низкий печеночный фон, но высокое накопление в опухоли — благодаря эффекту усиленного проникновения и удержания (EPR) — он привлекателен для радиосенсибилизации HCC.

Несмотря на обширные до клинические работы по AGuIX для МРТ-направленной радиотерапии, его фармакокинетика остается неполностью охарактеризованной. Точные данные биораспределения необходимы для оптимизации схем дозирования и предсказания терапевтических окон. Позитронный эмиттер ⁶⁴Cu (T₁/₂ = 12,4 ч) предлагает временную гибкость для визуализации как быстрых, так и медленно клирирующихся агентов. Здесь мы сообщаем о первом in vivo биораспределении и PET-визуализации ⁶⁴Cu-маркированного AGuIX в голых мышах с опухолями HepG2 и оцениваем его радиосенсибилизирующий эффект с помощью ¹⁸F-FDG PET/CT.

Методы

Общая информация

Наночастицы AGuIX (суб-5 нм, обезвоженные, сферические) получены от Nano-H (Лион, Франция) и регидрированы в стерильной DEPC-обработанной воде. Клетки человеческого HCC HepG2 (ATCC) культивировали в MEM с 10% FCS. Изотоп ⁶⁴Cu получен из Висконсинского университета. Самцы BALB/c атхимических голых мышей (6 недель, 16-18 г) использовались, все протоколы одобрены Комитетом по уходу за животными ВУ Вирджинии.

Трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ)

AGuIX (0,5 мМ) инкубировали с клетками HepG2 1 ч, затем промывали 0,1 М PBS и центрифугировали. Клеточные пеллеты фиксировали в 4% формальдегиде и 1% глютаральдегиде для ТЭМ визуализации.

⁶⁴Cu Радиомаркировка

AGuIX (10 мкмоль) смешивали с 100 мкл 0,5 М NH₄OAc (pH 5,5) и инкубировали 5 мин. 1-3 мКл ⁶⁴CuCl₂ (0,1 N HCl) добавляли, и смесь нагревали при 37 °C 1 ч. Продукт очищали 3 кДа Amicon фильтрацией. Радиохимическая чистота подтверждалась iTLC (20 мМ лимонная кислота) и последовательно превышала 98%. Удельная активность варьировала 3-10 МБк·мкмоль⁻¹, с итоговыми выходами 50-100 МБк на синтез.

Модели опухолей

Клетки HepG2 (5×10⁶) взвешивали в 0,1 мл HBSS и инъецировали подкожно в правый бок каждой голой мыши. Опухоли становились пальпируемыми через ~2 недели.

Биораспределение ⁶⁴Cu-AGuIX

Десять мышей (5 самцов, 4 самки) получили внутрибрюшинные инъекции ~0,9 МБк ⁶⁴Cu-AGuIX (0,2 мл). В 9, 21 и 40 ч после инъекции мышей эвтаназировали, и органы (сердце, мышца, легень, почка, селезенка, печень, опухоль) извлекали, взвешивали и считали в γ-счетчике. Данные выражали в % введенной дозы на грамм (% ID/г).

Микро-PET визуализация

Каждая мышь с опухолью получала 22,2 МБк ⁶⁴Cu-AGuIX внутрибрюшинно. PET сканирование приобретали в 9 ч и 21 ч под изофлурановой анестезией, используя систему SuperArgus (Sedecal, Испания).

Облучение и ¹⁸F-FDG PET/CT

Двенадцать мышей разделили на три группы (n=4). Базовая PET визуализация выполнялась через 30 мин после венообразного введения 16,4±4,7 МБк ¹⁸F-FDG. Группы получали либо физраствор, либо 1 мг, либо 10 мг AGuIX внутрибрюшинно за 1 ч до облучения. Облучение доставляли при 250 кВ, 8 мА, 2-мм Al фильтр (1,2 Гр·мин⁻¹) в сумме 6 Гр; протокол повторяли на следующий день. Через 24 ч после второй дозы выполняли второе ¹⁸F-FDG PET сканирование (11,1±1,0 МБк). Стандартизированные значения захвата (SUV_max) измеряли в опухолях и нормализовывали к печеночному SUV_ave для получения T/L отношений.

Статистический анализ

Все эксперименты выполняли в трипликате. Данные представлены как среднее ± SE. Значимость оценивали двусторонними непарными t-тестами или однофакторным ANOVA (p < 0,05 значимо).

Результаты и обсуждение

В то время как контрастное МРТ может детектировать AGuIX, PET предлагает превосходную чувствительность и количественную точность, позволяя детектировать наномолярные концентрации, ниже порога МРТ. Здесь мы демонстрируем, что ⁶⁴Cu-маркированный AGuIX обеспечивает четкое очерчивание опухоли и продолжительное удержание в ксеногрантах HepG2, поддерживая его использование для PET-направленной радиотерапии.

ТЭМ исследование

Инкубация клеток HepG2 с 0,5 мМ AGuIX в течение 1 ч привела к цитоплазматическому захвату, визуализированному при ×6500 и ×52000 увеличении (Рисунок 1). Наночастицы сохраняли хорошо диспергированную морфологию, указывая на клеточную стабильность и совместимость.

Локализация AGuIX внутри клеток HepG2. a. ТЭМ изображения (×6500) изображающие захват. b. Увеличенный вид (×52000) показывающий цитоплазматическое распределение.

Радиомаркировка

Одностадийное хелатирование ⁶⁴Cu к AGuIX через встроенный DOTA достигло >98% радиохимического выхода. Полученная удельная активность 3-10 МБк·мкмоль⁻¹, с итоговой активностью продукта 50-100 МБк на синтез.

Исследования биораспределения

После внутрибрюшинной инъекции ⁶⁴Cu-AGuIX демонстрировал надежное опухолевое накопление (7,82±1,50, 8,43±6,23, 6,84±1,40 % ID/г в 9, 21 и 40 ч соответственно). Не-мишеневые органы удерживали <1% ID/г, подтверждая быструю клиренс. Почечное накопление было заметно ниже (~5% ID/г) чем при внутривенном введении, вероятно, из-за непрерывного брюшинного абсорбции. Эти данные поддерживают использование ⁶⁴Cu-AGuIX как количественного инструмента для направления дозирования радиосенсибилизатора.

Биораспределение ⁶⁴Cu-AGuIX у мышей с опухолями (% ID/г в 9, 21 и 40 ч). Среднее ± SD, n=3.

Микро-PET визуализация

Четкий опухолевой сигнал наблюдался в 9 ч, с еще более высоким контрастом в 21 ч по мере снижения фоновой активности (Рисунок 3). Данные корробируют выводы биораспределения и демонстрируют практическую применимость PET-направленного планирования лечения.

Микро-PET изображения мышей с опухолями. Верхняя панель (корональный вид) и нижняя (поперечный) в 9 ч и 21 ч после инъекции. Опухоль обозначена красной стрелкой.

¹⁸F-FDG PET/CT оценка облученных ксеногрантов

Все облученные мыши показывали сниженное опухолевое захват ¹⁸F-FDG. Отношения SUV_max (B/A) были 1,03±0,03 (физраствор), 1,04±0,04 (1 мг AGuIX) и 1,24±0,02 (10 мг AGuIX). Группа 10 мг показала статистически значимое увеличение опухолевого-к-перечному отношению захвата по сравнению с 1 мг и физраствором (p < 0,001), подтверждая доза-зависимую радиосенсибилизацию. Разницы между 1 мг AGuIX и физраствором не наблюдалось, указывая, что более высокие дозы требуются для клинической выгоды.

Pre- и post-облучение ¹⁸F-FDG PET изображения для физраствора (слева), 1 мг AGuIX (середина) и 10 мг AGuIX (справа). Изображения имеют идентичные цветовые шкалы.

Количественный анализ: T/L (B) — опухоль к печени SUV_ave до облучения; T/L (A) — после облучения; T/L (B/A) — отношение двух. Показаны группы 1 мг и 10 мг AGuIX.

Хотя почечное накопление радиомаркированного AGuIX может быть высоким после внутривенного введения, внутрибрюшинная доставка снижает это воздействие, обеспечивая длительное опухолевое удержание с минимальным почечным экспозированием. Будущие дозиметрические исследования прояснят органо-специфическую радиационную толерантность и поддержат клиническую трансляцию.

Заключение

Мы успешно радиомаркировали AGuIX с ⁶⁴Cu, достигнув >98% чистоты и существенного опухолевого накопления, сохраняющегося >40 ч в ксеногрантах HepG2. PET визуализация демонстрирует четкое очерчивание опухоли и предоставляет количественный реаддаут для планирования лечения. Радиосенсибилизационные исследования с ¹⁸F-FDG PET подтверждают, что 10 мг внутрибрюшинная доза AGuIX усиливает терапевтический эффект 6 Гр радиотерапии в моделях HCC. Эти находки подтверждают AGuIX как двухфункциональный тераностический нанозонд для образ-ориентированной радиотерапии и подчеркивают необходимость комплексной дозиметрии перед клиническим применением.