Ультрачувствительный магнетоэластичный иммуносенсор для обнаружения ракембрионального антигена

Аннотация

Представлен беспроводной магнетоэластичный иммуносенсор, достигающий беспрецедентной чувствительности к ракембриональному антигену (РЭА). Оптимизировав размеры микрочипа через моделирование и эксперименты, а также используя усиление золотыми наночастицами (AuNP) и биосовместимый самоорганизующийся монослой (SAM), сенсор демонстрирует стабильный линейный отклик в логарифмическом диапазоне концентраций РЭА 0,1–100 нг/мл с пределом обнаружения 2,5 пг/мл. Конструкция устройства обеспечивает отличную воспроизводимость, стабильность и быстрый отклик, что делает его перспективным инструментом для ранней диагностики рака.

Введение

Злокачественные новообразования остаются главной причиной смертности во всем мире, а раннее обнаружение дает лучшие шансы на успешное лечение [1]. Туморные маркеры, такие как ракембриональный антиген (РЭА), становятся клинически значимыми, когда их уровень в сыворотке превышает базовые пороги [2]. РЭА — гликопротеин массой 180–200 кДа, обычно не обнаруживаемый (<5 нг/мл) у здоровых взрослых, но значительно возрастающий при колоректальном, желудочном, поджелудочном, легких и молочной железе раках [3–7]. Мониторинг его концентрации позволяет скрининг, диагностику и отслеживание ответа на лечение, с чувствительностью >80 % для обнаружения рецидивов [8]. Биосенсоры, преобразующие молекулярное распознавание в измеримые сигналы, предлагают быстрый, дешевый и высокоспецифический анализ. Иммуносенсоры — особенно с ферментативной, флуоресцентной или электрохимической регистрацией — показали выдающиеся результаты для низкоконцентрационных онкомаркеров [9–11]. Интеграция наночастиц (НЧ) усиливает трансдукцию сигнала за счет уникальных оптических, электронных или магнитных свойств [12–14]. Магнетоэластичные (МЭ) сенсоры, нечувствительные к температуре или pH среды, дают высокочувствительные механические отклики и идеально подходят для безмаркерного обнаружения [15]. В этом исследовании мы объединяем AuNP с МЭ-микрочипами для создания беспроводного ультрачувствительного иммуносенсора РЭА.

Результаты и обсуждение

Из-за лентообразной геометрии МЭ-микрочипа магнитная проницаемость максимальна вдоль его длины [16]. Первоначальные испытания выявили оптимальные размеры: ширина 1 мм и толщина 28 мкм [17]. Конечно-элементное моделирование уточнило длину чипа, показав максимальное относительное смещение — и теоретическую чувствительность — при 6 мм (рис. 1). Итоговые размеры чипа: 6 мм × 1 мм × 28 мкм. Рисунок 2 иллюстрирует архитектуру сенсора. Поверхность чипа сначала функционализировали цистеаминными SAM, создавая платформу для ковалентного присоединения антител к РЭА (РЭА-Аб). Затем вводили сывороточный альбумин грызуна (BSA) для снижения неспецифической адсорбции и стерического помехи. Атомно-силовая микроскопия (АСМ) подтвердила толщину SAM 120 нм (рис. 3a). Постепенное увеличение шероховатости на АСМ-изображениях (рис. 3b,c) подтвердило иммобилизацию антител и захват РЭА, высота комплексов ~200 нм. Концентрация антител критически влияет на чувствительность. Тестирование РЭА-Аб при 20, 50, 70 и 100 мкг/мл показало пиковый отклик при 50 мкг/мл; более высокие концентрации вызывали стерическое помехи и электростатическое отталкивание (рис. 4). Мониторинг частоты в реальном времени (рис. 5a) показал стабильный отклик через 40 мин, а сдвиг частоты линейно коррелировал с логарифмированными концентрациями РЭА (R² = 0,9688) в диапазоне 0,1–100 нг/мл (рис. 5b). Расчетный предел обнаружения 2,5 пг/мл превосходит ранее сообщаемые МЭ-платформы [18]. В целом, интеграция AuNP и BSA с МЭ-микрочипами дает беспроводной иммуносенсор, способный к ультрачувствительному, воспроизводимому обнаружению РЭА, с существенными преимуществами для неинвазивного скрининга рака.

Заключение

Разработан нано-МЭ иммуносенсор, обеспечивающий высокочувствительное обнаружение РЭА с пределом 2,5 пг/мл в широком динамическом диапазоне (0,1–100 нг/мл). Сочетание усиления AuNP и блокировки BSA повышает как чувствительность, так и стабильность. Учитывая специфичность, простоту использования и воспроизводимость, платформа перспективна для клинического внедрения в раннюю диагностику и мониторинг рака.

Методы

МЭ-микрочип продольно вибрирует под действием переменного магнитного поля. Резонансная частота f₀ определяется формулой:

\[\displaystyle f_0 = \frac{1}{2L}\sqrt{\frac{E}{\rho(1-\nu^2)}}\]

где E — модуль Юнга, ν — коэффициент Пуассона, ρ — плотность, L — длина чипа. При постоянных условиях среда сдвиг частоты Δf связывается с добавленной массой Δm через:

\[\displaystyle \frac{\Delta f}{\Delta m} = -\frac{f_0}{2M}\]

Таким образом, связывание целевых молекул снижает резонансную частоту пропорционально массе связанного РЭА. Меньшие размеры чипа снижают начальную массу M, повышая чувствительность. МЭ-сплав (Metglas 2826MB, Fe₄₀Ni₃₈Mo₄B₁₈) лазерно резали на чипы 6 мм × 1 мм × 28 мкм, очищали последовательно ацетоном, изопропанолом, этанолом и деионизированной водой, затем плазменно активировали. Наносили 100 нм хромированного подслоя, затем 40 нм покрытия AuNP. Чипы обрабатывали 40 мМ цистеамином в 99 % BSA PBS 12 ч при комнатной температуре, затем инкубировали с 50 мкг/мл РЭА-Аб, активированными 10 мг/мл EDC и 10 мг/мл NHS, 1 ч при 37 °C. Финальная блокировка 0,1 % BSA длилась 30 мин. Для измерений чип помещали в стеклянную трубку с катушкой, подключенную к векторному сетевому анализатору. Переменное магнитное поле возбуждало чип, резонансную частоту регистрировали каждые 5 мин в течение 40 мин при добавлении РЭА (0–100 нг/мл). После измерений чипы промывали PBS и образовывали АСМ.

Аббревиатуры

AFM:

Атомно-силовая микроскопия

AuNPs:

Золотые наночастицы

BSA:

Сывороточный альбумин грызуна

CEA:

Ракембриональный антиген

CEAAb:

Антитело к РЭА

EDC:

1-Этил-3-карбодиимид

Hz:

Частота

ME:

Магнетоэластичный

NHS:

N-гидроксисукцинимид

PBS:

Фосфатно-буферный раствор

SAM:

Самоорганизующийся монослой