Восстановление microRNA-499-5p защищает мышей с повреждением легких, вызванным сепсисом, посредством нацеливания на Sox6

Введение

Сепсис - это системное воспаление, возникающее в результате инфекции и вызывающее полиорганную дисфункцию, в том числе острый респираторный дистресс-синдром [1]. Он характеризуется глубокой гипотонией, прогрессирующей гипоксемией, повреждением тканей и воспалительными изменениями [2]. Легкие - наиболее критический и уязвимый орган при сепсисе, а острое повреждение легких (ОПЛ) - частое воспалительное заболевание, вызванное сепсисом [3]. Тяжесть вызванного сепсисом ОПН можно объяснить нарушением проницаемости альвеокапиллярной сети, что приводит к снижению поступления кислорода [4]. Апоптоз клеток легких является критическим фактором повреждения легких, вызванного сепсисом [5]. Патофизиология ОПЗ, вызванной сепсисом, неизвестна, поддерживающие меры и антибиотики являются единственными методами лечения, доступными для пациентов с сепсисом и ОПН, и их влияние на высокие показатели смертности от сепсиса ограничено [6].

МикроРНК (миРНК) представляют собой небольшие некодирующие сегменты эндогенно экспрессируемых РНК, состоящие примерно из 18–24 нуклеотидов, которые могут контролировать широкий спектр клеточных функций и связываться с целевыми областями определенного гена, чтобы контролировать их экспрессию посредством ингибирования или активации мРНК. перевод / транскрипция [7]. MiR-499-5p является недавно обнаруженным членом миРНК, кодируемых миозином [8]. В исследовании сообщается, что сывороточные уровни miR-499-5p могут использоваться для индикации органной недостаточности у пациентов с сепсисом [9]. Другое исследование показало, что экспрессия miR-499-5p участвует в индуцированном сепсисом апоптозе сердца [10]. Семейство высокоподвижных боксов (HMG) (SOX), связанных с областью определения пола Y (SRY), определяется набором генов, включая ДНК-связывающий домен класса HMG, чья идентичность последовательности с SRY превышает 50% [11] . Фактор транскрипции Sox6 является частью SRY-родственного семейства HMG-box и экспрессируется во многих тканях во время прогрессирования, где он играет критическую роль в переходе от пролиферирующих клеток-предшественников к функционально зрелым клеткам [12]. Есть исследование, в котором сообщается, что повышенный уровень Sox6 участвует в индуцированном сепсисом апоптозе сердца [10]. Исследования показали, что экспрессия Sox2 и экспрессия Sox4 повышены при мелкоклеточном раке легкого человека [13, 14]. Но взаимосвязь между Sox6 и повреждением легких, вызванным сепсисом, требует дальнейшего изучения. Таким образом, наше исследование должно было изучить защитный эффект miR-499-5p на мышей с повреждением легких, вызванным сепсисом, путем воздействия на Sox6.

Материалы и методы

Соответствие этическим стандартам

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Национального института здоровья. Протокол был одобрен Комитетом по этике экспериментов на животных городской больницы Вэйхай, Медицинского колледжа Челоо, Шаньдунского университета.

Экспериментальные животные

Здоровых самцов мышей BABL / c, не содержащих патогенов (возраст 6-8 недель, вес 18-22 г), были приобретены в центре экспериментальных животных Университета Шаньдун (Шаньдун, Китай). Температура окружающей среды составляла 24 ± 2 ° C с 12 циклами свет-темнота поочередно. Мышам давали свободный доступ к асептическому корму и стерильной воде. Эксперименты были начаты после адаптивного кормления в течение 7 дней.

Создание модели повреждения легких, вызванной сепсисом, путем лигирования слепой кишки и пункции (CLP) у мышей

Мышей случайным образом разделили на 2 группы:фиктивная группа ( n =8) и модельной группы. Мышей не кормили в течение 12 часов перед операцией, а затем вводили анестезию 1% пентобарбиталом натрия (70 мг / кг) путем внутрибрюшинной инъекции. Эффект от анестезии не наблюдался; было замечено дыхание и сердцебиение мышей. Голову и конечности мышей фиксировали в положении лежа на спине, подготавливали кожу живота и дезинфицировали йодофорными ватными тампонами. Мышам в модельной группе сделали продольный разрез (1,0 см) в среднем сегменте средней линии живота, открыли брюшную полость и извлекли слепую кишку из брюшной полости, избегая повреждения брыжеечных сосудов. Его лигировали шелковой нитью 1–0 на 1/2 конца слепой кишки, и слепую кишку прокалывали на контралатеральном крае брыжейки пункционной иглой № 16. Было выдавлено необходимое количество кишечного содержимого, вернули слепую кишку и зашили разрез. После вскрытия брюшной полости мышам в имитационной группе извлекали только слепую кишку, а затем слепую кишку возвращали обратно. Мышам после операции вводили подкожно 1 мл 0,9% раствора хлорида натрия, помещали в клетки и регулярно кормили.

Трансфекция in vivo

Перед моделированием мышей разделили на 7 групп ( n =8):модельная группа, группа агомира miR-499-5p, группа отрицательного контроля агомира (NC), группа малой интерферирующей РНК (si) -Sox6, группа si-NC, агомир miR-499-5p + Сверхэкспрессия (oe) -Sox6 группа и miR-499-5p agomir + oe-NC группа. За час до моделирования мышей лечили согласно группам. Мышей анестезировали 1% пентобарбиталом натрия путем внутрибрюшинной инъекции, затем фиксировали в положении лежа на спине с наклоном 45 °, а язык мышей перемещали на другую сторону рта для обеспечения проходимости их дыхательных путей. Переднюю часть кожи шеи мышей дезинфицировали и срезали, чтобы обнажить трахею. Комплекс для трансфекции (50 мкл) абсорбировали микропробоотборником (капали в соответствии с группой, такое же количество фосфатно-солевого буфера (PBS) капали в модельную группу), а затем медленно капали в трахею. После трансфекции мышей вращали вертикально, и трансфекционный комплекс полностью распределялся в легких [15]. Во время процесса трансфекции наблюдали дыхательные пути и сердцебиение мышей. Если происходила остановка дыхания и сердца, трансфекцию немедленно прекращали, и дыхательные пути не перекрывались. Трансфекцию продолжали, когда дыхание и сердцебиение мышей были стабильными. Агомир MiR-499-5p и его NC, а также соответствующие плазмиды Sox6 были куплены у Shanghai GenePharma Co., Ltd. (Шанхай, Китай). После трансфекции мышей разделяли по клеткам и кормили в течение 1 дня, а затем умерщвляли. Мышей анестезировали 1% пентобарбиталом натрия путем внутрибрюшинной инъекции, фиксировали в положении лежа на спине и затем подвергали эвтаназии путем венесекции брюшной аорты. Кожу мышей дезинфицировали местно, открывали грудную полость, перевязывали трахею и правый главный бронхи, отсоединяли правый главный бронх и удаляли правое легкое. Нижнюю долю правого легкого помещали в 10% нейтральный формалин для патологического исследования, среднюю долю быстро взвешивали для расчета сырого веса (W) и выпекали при 56 ℃, а сухой вес (D) рассчитывали через 72 часа. таким образом было рассчитано соотношение W / D. Правую верхнюю долю хранили в жидком азоте для обнаружения мРНК и белков. Левое легкое трижды промывали 0,4 мл физиологического раствора и собирали около 1 мл жидкости бронхоальвеолярного лаважа (ЖБАЛ), переносили в пробирку Эппендорфа (ЕР) объемом 1,5 мл и помещали на лед. BALF центрифугировали при 1500 об / мин в течение 5 минут и переносили в новую пробирку EP, затем хранили при -80 ℃ для выявления воспалительных факторов.

Кроме того, мышей разделили на 3 группы ( n =10 / группа):фиктивная группа, модельная группа и группа агомира miR-499-5p (50 мкл агомира miR-499-5p вводили в трахею за 1 ч до операции). Выживаемость контролировали каждые 12 ч, всего в течение 7 дней. Наблюдали за выживанием мышей в течение 7 дней и определяли токсичность miR-499-5p [16].

Окрашивание гематоксилином – эозином (H&E) и оценка травм

Из тканей легких были приготовлены парафиновые срезы, окрашены H&E и исследованы под оптическим микроскопом. Повреждение легких оценивалось (альвеолярный застой, кровоизлияние, инфильтрация или агрегация нейтрофилов в альвеолярной полости или стенке сосуда, утолщение альвеолярной стенки и / или образование гиалиновой мембраны) с помощью патологической балльной системы для повреждения легких, выпущенной Американским торакальным обществом. 0 баллов указывает на отсутствие или очень легкие поражения; 1 балл указывал на легкие поражения; 2 балла указали на умеренные поражения; 3 балла указали на тяжелые поражения; 4 балла указали на очень тяжелые поражения. Суммарный балл по четырем пунктам представляет собой общий балл повреждения легкого [17].

Окрашивание и оценка по Массону

Из тканей легкого делали парафиновые срезы (4 мкм) и обрабатывали окрашиванием по Массону [18]. Коллагеновые волокна, слизь и хрящ были синими, цитоплазма, мышцы, целлюлоза и глия были красными, а ядра клеток были сине-черными. В полуколичественной системе оценок Эшкрофта [19] 0 баллов означало нормальное легкое; 1 балл указывает на легкое фиброзное утолщение альвеолярной или бронхиальной стенки; 3 балла указали на умеренное утолщение альвеолярной или бронхиолярной стенки без повреждения структуры легкого; 5 баллов указали на обострение фиброза, сопровождающееся повреждением структуры легких с образованием волокон или образований; 7 баллов указали на серьезное повреждение структуры легких и большие участки фиброза, образующие полосы или скопления волокон; 8 баллов указали на всю региональную фиброзную упаковку.

Окрашивание терминальной дезоксинуклеотидилтрансеразы, опосредованной дезоксиуридинтрифосфатом-биотином по нику (TUNEL)

Апоптоз легочных тканей тестировали с помощью набора TUNEL (Roche Diagnostics GmbH, Мангейм, Германия) и наблюдали с помощью оптического микроскопа. Апоптотические клетки в ядре окрашивались в коричневый цвет. Индекс апоптоза показывает процент TUNEL-положительных клеток [20].

Иммуногистохимия

Срезы легочной ткани депарафинизировали ксилолом, инкубировали с 3% перекисью водорода и блокировали козьей сывороткой. Затем каспаза-3 (ab13847, 1:500), каспаза-9 (ab32539, 1:250) и SOX6 (ab30455, 1:500, все от Abcam, MA, США) были использованы в качестве антител к иммуноокрашенным срезам. Оптический микроскоп (Leica Microsystems, Иллинойс, США) использовался для захвата изображений, которые затем анализировались с помощью программного обеспечения Image Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Роквилл, Массачусетс, США) [21].

Количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (RT-qPCR)

Набор OMEGA (Solarbio science &technology Co., Ltd., Пекин, Китай) был принят для экстракции общей РНК в тканях легких и определения концентрации РНК. Комплементарную ДНК (кДНК) составляли путем обратной транскрипции в соответствии с набором для синтеза первой цепи кДНК RevertAid (Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, США). Праймеры были разработаны Invitrogen (Карлсбад, Калифорния, США), как показано в таблице 1. Реакцию ПЦР проводили в соответствии с набором FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) (Roche). Количественный анализ эксперимента проводился с помощью 2 ^{- △△ Ct} метод. U6 был загрузочным контролем miR-499-5p, а GAPDH был внутренним параметром других генов [22].

Вестерн-блоттинг

Общий белок собирали с использованием лизисного буфера для анализа радиоиммунопреципитации для обработки тканей легких. Концентрацию общего белка определяли методом бицинхониновой кислоты. Образец белка (30 мкг) обрабатывали электрофорезом в 10% -ном додецилсульфат-полиакриламидном геле, переносили на поливинилиденфторидную мембрану, блокировали 5% -ным сухим обезжиренным молоком и реагировали с первичными антителами Sox6 (ab30455, 1:1000, Abcam), Caspase -3 (9661, 1:1000, Cell Signaling Technology, MA, США), Caspase-9 (9502, 1:1000, Cell Signaling Technology), фактор некроза опухоли-α (TNF-α, ab6671, 1:1000, Abcam ), интерлейкин-1β (IL-1β, 16806-1-AP, 1:500, Proteintech, США), IL-6 (ab6672, 1:1000, Abcam) и GAPDH (sc-32233, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Калифорния, США). Затем мембрану инкубировали со вторичным антителом (1:2000) и проявляли с помощью усиленной хемилюминесценции [23].

Иммуноферментный анализ (ELISA)

Уровни IL-1β, IL-6 и TNF-α в ЖБАЛ определяли с помощью набора для ELISA (Boster, Hubei, China). Колориметрическое определение выполняли при 450 нм.

Обнаружение индексов окислительного стресса

Ткани легких в жидком азоте взвешивали и разбавляли в определенной пропорции физиологического раствора в условиях низкой температуры, затем гомогенизировали и центрифугировали при 4 ℃, 3000 об / мин в течение 20 минут при низкой температуре, и супернатант брали для определения. Активность миелопероксидазы (MPO) была протестирована с помощью набора для обнаружения MPO (NanJing JianCheng Bioengineering Institute, Нанкин, Китай), и были протестированы малоновый диальдегид (MDA), супероксиддисмутаза (SOD), глутатионпероксидаза (GSH-Px) и каталаза (CAT). наборами, предоставленными Институтом биоинженерии JianCheng.

Анализ двойного люциферазного репортерного гена

Sox6 может быть геном-мишенью для miR-499-5p, что было предсказано на биологическом веб-сайте (http://www.targetscan.org/vert_72/). Было четыре сайта связывания между miR-499-5p и 3'-нетранслируемой областью (UTR) мРНК Sox6. Векторы pmiR-RB-REPORT-Sox6 дикого типа (WT) и pmiR-RB-REPORT-Sox6 мутантного типа (MUT) были сконструированы Guangzhou RiboBio Co., Ltd. (Гуандун, Китай), и соответствующие репортерные плазмиды люциферазы были сконструированы. сгенерировано. Клетки ТС-1 (эпителиальные клетки легких мышей, 1 × 10 ⁵ клеток / лунку, Shanghai Yiyan Biological Technology Co., Ltd., Шанхай, Китай) высевали в 24-луночный планшет и трансфицировали агомиром miR-499-5p или агомир-NC, pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT или pmiR-RB-REPORT-Sox6 MUT через липофектамин2000. Для измерения активности люциферазы применялась система анализа двойного репортерного гена люциферазы (Promega, WI, США).

Статистический анализ

Все данные были проанализированы с помощью программного обеспечения SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA). Данные измерений были представлены как среднее ± стандартное отклонение. Сравнение двух групп проводилось t , сравнения между несколькими группами оценивали с помощью одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA), а апостериорный тест Тьюки использовали для попарного сравнения после анализа ANOVA. Кривая выживаемости построена по методу Каплана – Мейера. P значение <0,05 свидетельствует о статистически значимой разнице.

Результаты

Соотношение W / D и Sox6 увеличиваются, в то время как miR-499-5p снижается в тканях легких мышей с повреждением легких, вызванным сепсисом

Токсичность miR-499-5p тестировали на мышах для определения времени выживания мышей с сепсисом. Результаты показали (рис. 1а) выживаемость мышей в фиктивной группе в течение 7 дней составила 100%, а выживаемость мышей с сепсисом снизилась. Выживаемость мышей с сепсисом после лечения miR-499-5p увеличилась. Результаты соотношения W / D тканей легкого продемонстрировали, что (рис. 1b):по сравнению с фиктивной группой соотношение W / D было повышено в модельной группе ( P <0,05). По сравнению с группой агомира NC и группой si-NC соотношение W / D было снижено в группе агомира miR-499-5p и группе si-Sox6 (обе P <0,05). Отношение W / D было заметно повышено в группе miR-499-5p агомир + oe-Sox6 по сравнению с группой miR-499-5p агомир + oe-NC ( P <0,05).

Соотношение W / D и Sox6 увеличиваются, в то время как miR-499-5p снижается в тканях легких мышей с повреждением легких, вызванным сепсисом. а Кривая выживаемости мышей по Каплану – Мейеру. б Соотношение W / D легочной ткани в каждой группе. c Экспрессия miR-499-5p в тканях легких мышей. г Экспрессия мРНК Sox6 в тканях легких мышей. е Полоса белка Sox6 по данным вестерн-блоттинга. е Экспрессия белка Sox6 в тканях легких мышей. г Sox6 иммуногистохимия тканей легких мышей. (а) P <0,05 по сравнению с фиктивной группой. (б) P <0,05 по сравнению с группой агомира NC. (c) P <0,05 по сравнению с группой si-NC. (d) P <0,05 по сравнению с группой miR-499-5p агомир + oe-NC. Данные измерений были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение, и данные были оценены с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Тьюки

Экспрессия MiR-499-5p и Sox6 была обнаружена, и мы обнаружили, что (рис. 1c-f):в отличие от фиктивной группы, miR-499-5p снижалась, а Sox6 повышалась в модельной группе (оба P <0,05). По сравнению с группой агомира NC, miR-499-5p повышена, а Sox6 снижена в группе агомира miR-499-5p (обе P <0,05). По сравнению с группой si-NC, Sox6 подавлен в группе si-Sox6 ( P <0,05). По сравнению с группой miR-499-5p агомир + oe-NC, Sox6 резко повышен в группе miR-499-5p agomir + oe-Sox6 ( P <0,05).

Содержание белка Sox6 в тканях легких мышей с сепсисом определяли иммуногистохимическим методом (рис. 1g). Было замечено, что по сравнению с фиктивной группой экспрессия белка Sox6 была увеличена в модельной группе ( P <0,05); по сравнению с группой агомира NC и группой si-NC, более низкая экспрессия белка Sox6 была исследована в группе агомира miR-499-5p и группе si-Sox6 (обе P <0,05); относительно группы miR-499-5p агомир + oe-NC, экспрессия белка Sox6 была усилена в группе miR-499-5p agomir + oe-Sox6 ( P <0,05).

Восстановленный miR-499-5p или истощение Sox6 облегчает патологию тканей легких, снижает показатель травмы легких, коллагеновые волокна и степень легочного фиброза при травме легких, вызванной сепсисом Мыши

Результаты окрашивания HE показали, что (рис. 2а):в имитационной группе структура легочной ткани была интактной, альвеолярная перегородка в основном проявлялась без отека или воспаления, а альвеолярная полость была чистой. В модели агомир NC, si-NC и miR-499-5p агомир + oe-Sox6 группы, экссудация, отек и кровоизлияние наблюдались в большей части альвеолярной полости легочных тканей, а массивная инфильтрация воспалительных клеток обнаруживалась в интерстициальной ткани легких. В группах агомира miR-499-5p, si-Sox6 и miR-499-5p агомира + oe-NC поражение тканей легких было снижено по сравнению с модельной группой.

Восстановленный miR-499-5p или истощенный Sox6 облегчает патологию тканей легкого, снижает количество повреждений легких, количество коллагеновых волокон и степень легочного фиброза у мышей с повреждением легких, вызванным сепсисом. а Результаты окрашивания HE в тканях легких мышей. б Оценка повреждения легочной ткани у мышей в каждой группе. c Окрашивание легочной ткани по Массону у мышей. г Оценка легочного фиброза у мышей в каждой группе. (а) P <0,05 по сравнению с фиктивной группой. (б) P <0,05 по сравнению с группой агомира NC. (c) P <0,05 по сравнению с группой si-NC. (d) P <0,05 по сравнению с группой miR-499-5p агомир + oe-NC. Данные измерений были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение, и данные были оценены с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Тьюки

Оценка повреждения легких у мышей и полуколичественные результаты оценки по шкале Эшкрофта показали, что (рис. 2b, d):по отношению к фиктивной группе оценка повреждения легких и степень легочного фиброза были явно повышены в модельной группе ( P <0,05). По сравнению с группой агомира NC и группой si-NC, оценка повреждения легких и степень легочного фиброза были снижены в группе агомира miR-499-5p и группе si-Sox6 (обе P <0,05). В отличие от группы miR-499-5p агомир + oe-NC, оценка повреждения легких и степень легочного фиброза были заметно повышены в группе miR-499-5p агомир + oe-Sox6 ( P <0,05).

Результаты окрашивания по Массону показали, что (рис. 2c):в имитационной группе ткани легких мышей содержали небольшое количество синих коллагеновых волокон. В модели агомир NC, si-NC и miR-499-5p агомир + oe-Sox6 группы коллагеновых волокон были увеличены. В группе агомира miR-499-5p, группе si-Sox6 и группе miR-499-5p агомир + oe-NC количество коллагеновых волокон было уменьшено по сравнению с группой модели.

Восстановленный miR-499-5p или истощенный Sox6 снижает экспрессию белков TUNEL, каспазы-3 и каспазы-9 в тканях легких у мышей с повреждением легких, вызванным сепсисом

Результаты вестерн-блоттинга, окрашивания TUNEL и иммуногистохимии показали, что (рис. 3a – f):нормальное ядро ​​было синим, а ядро ​​апоптоза было коричневым в разных оттенках. По сравнению с фиктивной группой, TUNEL-положительные клетки, экспрессия белков каспазы-3 и каспазы-9 были увеличены в модельной группе (все P <0,05). По сравнению с группами агомира NC и si-NC, TUNEL-положительные клетки, экспрессия белков каспазы-3 и каспазы-9 были снижены в агомире miR-499-5p и группах si-Sox6 (все P <0,05). По сравнению с группой miR-499-5p агомир + oe-NC, TUNEL-положительные клетки, экспрессия белков каспазы-3 и каспазы-9 были повышены в группе miR-499-5p агомир + oe-Sox6 (все P <0,05).

Восстановленный miR-499-5p или истощенный Sox6 снижает TUNEL-положительные клетки, экспрессию белков каспазы-3 и каспазы-9 в тканях легких мышей с повреждением легких, вызванным сепсисом. а TUNEL-положительные клетки в тканях легких мышей. б Количество TUNEL-положительных клеток в тканях легких мышей. c Иммуногистохимия каспазы-3 и каспазы-9 в легочной ткани мышей; г Среднее значение OD каспазы-3 и каспазы-9 в легочной ткани мышей. е Полосы белков каспазы-3 и каспазы-9 в тканях легких мышей. е Экспрессия белков каспазы-3 и каспазы-9 в тканях легких мышей в каждой группе. (а) P <0,05 по сравнению с фиктивной группой. (б) P <0,05 по сравнению с группой агомира NC. (c) P <0,05 по сравнению с группой si-NC. (d) P <0,05 по сравнению с группой miR-499-5p агомир + oe-NC. Данные измерений были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение, и данные были оценены с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Тьюки

Восстановленный miR-499-5p или истощенный Sox6 Снижает содержание TNF-α, IL-1β и IL-6 в ЖБАЛ и тканях легких при травмах легких, вызванных сепсисом Мыши

Результаты ELISA и вестерн-блоттинга показали, что (рис. 4a – g):содержание TNF-α, IL-1β и IL-6 было увеличено в модельной группе по сравнению с фиктивной группой (все P <0,05). По сравнению с группами агомира NC и si-NC, содержание TNF-α, IL-1β и IL-6 было снижено в группах miR-499-5p и агомира si-Sox6 (все P <0,05). По сравнению с группой miR-499-5p агомир + oe-NC, содержание TNF-α, IL-1β и IL-6 было повышено в группе miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (все P <0,05).

Восстановленный miR-499-5p или истощенный Sox6 снижает содержание TNF-α, IL-1β и IL-6 в BALF и тканях легких мышей с повреждением легких, вызванным сепсисом. а Содержание TNF-α в ЖБАЛ мышей каждой группы. б Содержание ИЛ-1β в ЖБАЛ мышей каждой группы. c Содержание ИЛ-6 в ЖБАЛ мышей каждой группы. г полосы белка TNF-α, IL-1β и IL-6 в тканях легких мышей в каждой группе. е экспрессия белка TNF-α в тканях легких мышей в каждой группе. е экспрессия белка IL-1β в тканях легких мышей в каждой группе. G экспрессия белка IL-6 в тканях легких мышей в каждой группе. (а) P <0,05 по сравнению с фиктивной группой. (б) P <0,05 по сравнению с группой агомира NC. (c) P <0,05 по сравнению с группой si-NC. (d) P <0,05 по сравнению с группой miR-499-5p агомир + oe-NC. Данные измерений были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение, и данные были оценены с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Тьюки

Восстановленный miR-499-5p или истощенный Sox6 повышает активность SOD, CAT и GSH-Px, а также снижает содержание MDA и MPO в тканях легких, вызванных сепсисом Мыши с травмой легких

Результаты определения индексов окислительного стресса показали, что (рис. 5a – e):по сравнению с фиктивной группой активность SOD, CAT и GSH-Px снижалась, в то время как содержание MDA и MPO повышалось в модельной группе (все P <0,05). По сравнению с агомиром NC и группами si-NC активность SOD, CAT и GSH-Px увеличилась, в то время как содержание MDA и MPO снизилось в агомире miR-499-5p и группах si-Sox6 (все P <0,05). По сравнению с группой miR-499-5p агомир + oe-NC активность SOD, CAT и GSH-Px подавлялась, в то время как содержание MDA и MPO увеличивалось в группе miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (все P <0,05).

Восстановленный miR-499-5p или истощенный Sox6 повышает активность SOD, CAT и GSH-Px, а также снижает содержание MDA и MPO в тканях легких мышей с повреждением легких, вызванным сепсисом. а Активность СОД в тканях легких мышей. б Содержание МДА в легочной ткани мышей. c Активность GSH-Px в тканях легких мышей. г Активность CAT в тканях легких каждой группы мышей. е Содержание МПО в тканях легких мышей. (а) P <0,05 по сравнению с фиктивной группой. (б) P <0,05 по сравнению с группой агомира NC. (c) P <0,05 по сравнению с группой si-NC. (d) P <0,05 по сравнению с группой miR-499-5p агомир + oe-NC. Данные измерений были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение, и данные были оценены с помощью однофакторного дисперсионного анализа с последующим апостериорным тестом Тьюки

miR-499-5p напрямую нацелен на Sox6

Мы предсказали через сайт биоинформатики TargetScan, что существуют целевые сайты связывания между miR-499-5p и SOX4 / 6. Используя RT-qPCR, было обнаружено, что по сравнению с фиктивной группой, экспрессия SOX2 / 4/6 увеличилась в модельной группе, а экспрессия SOX6 увеличилась больше всего (все P <0,05); по сравнению с группой агомира NC, группа агомира miR-499-5p не продемонстрировала изменений в экспрессии SOX2, но показала снижение экспрессии SOX4, в основном снижение SOX6 (дополнительный файл 1:рис. S1a, b). Таким образом, мы окончательно выбрали SOX6 в качестве гена-мишени для miR-499-5p. Веб-сайт биологического прогнозирования (http://www.targetscan.org/vert_72/) показал, что miR-499-5p может нацеливаться на Sox6 (рис. 6a). Анализ двойного репортерного гена люциферазы продемонстрировал, что (рис. 6b) по сравнению с контрольной группой активность люциферазы была явно разрушена после того, как вектор pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT и агомир miR-499-5p были котрансфицированы в клетки TC-1 ( P <0,05), тогда как активность люциферазы не показала отчетливой разницы после того, как агомир miR-499-5p котрансфицировал вектором pmiR-RB-REPORT-Sox6 MUT или агомир-NC, котрансфицированный вектором pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT ( P > 0,05), предполагая, что miR-499-5p может напрямую связываться с Sox6 3'UTR WT, а затем ингибировать активность люциферазы.

miR-499-5p напрямую нацелен на Sox6. а Целевые отношения между miR-499-5p и Sox6 предсказаны биологическим сайтом. б Результаты проверки двойного анализа репортерного гена люциферазы. * P <0,05 по сравнению с группой мимических NC. Данные измерений были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение, а сравнения между двумя группами проводились по t тест