МикроРНК-499-5p восстанавливает функцию легких при сепсис-индуцированной поврежденности, нацеливаясь на Sox6

Аннотация

Фон

Известно, что микроРНК (miR) участвуют в сепсисе; поэтому мы стремились обсудить защитный эффект miR-499-5p, нацеливаясь на Sox6 (sex-determining region Y-related high-mobility-group box 6), на сепсис-индуцированную поврежденность легких у мышей.

Методы

Модель сепсис-индуцированной поврежденности легких была создана путем связки и прокола слепой кишки. Тестировали соотношение влажного/сухого веса (W/D), экспрессию miR-499-5p, Sox6, Каспазы-3 и Каспазы-9 в тканях легких мышей. Определяли оценку поврежденности легких, коллагеновые волокна и степень легочной фиброзе. Далее измеряли а폽тоз клеток в тканях легких. Содержание воспалительных факторов и индексы оксидативного стресса в бальвеолярной о 씻очной жидкости (BALF) и тканях легких детектировали с помощью assays потери и приобретения функции. Целевое отношение между miR-499-5p и Sox6 было верифицировано.

Результаты

Соотношение W/D и Sox6 были повышены, в то время как miR-499-5p было снижено в тканях легких мышей с сепсис-индуцированной поврежденностью легких. Восстановленная miR-499-5p или истощенная Sox6 облегчали патологию тканей легких, снижали оценку поврежденности легких, коллагеновые волокна, степень легочной фиброзе, TUNEL-позитивные клетки, экспрессию белков Каспазы-3 и Каспазы-9, а также содержание воспалительных факторов в BALF и тканях легких и оксидативный стресс-ответ в тканях легких мышей с сепсис-индуцированной поврежденностью легких. miR-499-5p нацеливалась на Sox6.

Заключение

Высокая экспрессия miR-499-5p может аттенуировать а폽тоз клеток в тканях легких и ингибировать воспаление при сепсис-индуцированной поврежденности легких мышей через истощение Sox6, и она является потенциальным кандидатом-маркером и терапевтической мишенью для сепсис-индуцированной поврежденности легких.

Введение

Сепсис — это системное воспаление, возникающее в результате инфекции и вызывающее множественные органные дисфункции, включая острый респираторный дистресс-синдром [1]. Характеризуется глубокой гипотензией, прогрессирующей гипоксемией, повреждением тканей и воспалительными изменениями [2]. Легкие — самый критичный и уязвимый орган при сепсисе, и острая поврежденность легких (ALI) — частая сепсис-индуцированная воспалительная болезнь [3]. Тяжесть сепсис-индуцированной ALI может быть приписана нарушению проницаемости альвеоло-капиллярной сети, приводящей к снижению кислородоснабжения [4]. А폽тоз легочных клеток является критическим фактором поврежденности легких, индуцированной сепсисом [5]. Патфизиология сепсис-индуцированной ALI неизвестна, поддерживающие меры и антибиотики — единственные доступные методы лечения у пациентов с сепсисом и ALI, и их влияние на высокую смертность от сепсиса ограничено [6].

МикроРНК (miRNA) — это небольшие некодирующие сегменты эндогенно экспрессируемых РНК, состоящие примерно из 18–24 нуклеотидов, которые могут контролировать широкий спектр клеточных функций и связываться с целевыми участками определенного гена для контроля их экспрессии через ингибирование или активацию трансляции/транскрипции мРНК [7]. MiR-499-5p — недавно открытый член миоzin-кодирующих miRNA [8]. Исследование сообщило, что уровни miR-499-5p в сыворотке могут использоваться для индикации органной недостаточности у пациентов с сепсисом [9]. Другое исследование выявило, что экспрессия miR-499-5p участвует в сепсис-индуцированном сердечном а폽тозе [10]. Семейство sex-determining region Y (SRY)-related high-mobility box (HMG) (SOX) определяется набором генов, включающих HMG-класс ДНК-связывающий домен, чья последовательная идентичность с SRY превышает 50% [11]. Транскрипционный фактор Sox6 является частью семейства SRY-related HMG-box и экспрессируется в множественных тканях в ходе прогрессии, где играет критическую роль в переходе от пролиферирующих прогенерных клеток к функционально зрелым клеткам [12]. Существует исследование, сообщающее, что повышенный Sox6 причастен к сепсис-индуцированному сердечному а폽тозу [10]. Исследования показали, что экспрессия Sox2 и Sox4 повышена в человеческом мелкоклеточном раке легких [13, 14]. Но отношение между Sox6 и сепсис-индуцированной поврежденностью легких требует дальнейшего изучения. Таким образом, наше исследование направлено на изучение защитного эффекта miR-499-5p на сепсис-индуцированную поврежденность легких у мышей путем нацеливания на Sox6.

Материалы и методы

Соответствие этическим стандартам

Все эксперименты на животных соответствовали Руководству по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения. Протокол был разрешен Комитетом по этике животных экспериментов Вайхайской городской больницы, Колледжа медицины Чэлу, Университета Шандун.

Экспериментальные животные

Здоровые самцы специфически-беспатогенного класса BABL/c мыши (возраст 6–8 недель, вес 18–22 г) приобрели в экспериментальном животноводческом центре Университета Шандун (Шандун, Китай). Среда поддерживалась при 24 ± 2 °C с 12-часовым циклом свет/тьма. Мышам обеспечивали свободный доступ к асептичной пище и стерильной воде. Эксперименты начинали после адаптивного кормления в течение 7 дней.

Создание модели сепсис-индуцированной поврежденности легких путем связки и прокола слепой кишки (CLP) у мышей

Мышей случайно распределили в 2 группы: шам-группу (n = 8) и группу модели. Мышей держали на голодовке 12 ч перед операцией, затем анестезировали 1% натрия пентобарбитала (70 мг/кг) внутрибрюшинно. Наблюдали эффект анестезии; дыхание и сердечный ритм мышей отмечали. Голова и конечности мышей фиксировали в положении лежа на спине, кожу живота готовили и дезинфицировали йодопхорными ватными шариками. Мышам в группе модели делали продольный разрез (1,0 см) в среднем сегменте средней линии живота, открывали брюшную полость и вытаскивали слепую кишку, избегая повреждения мезентериальных сосудов. Ее связывали шелковым швом 1–0 на 1/2 от конца слепой кишки, и слепую кишку прокалывали у противоположного края мезентерия иглой № 16. Небольшое количество кишечного содержимого выдавливали, слепую кишку возвращали на место, и разрез накладывали швами. После открытия брюшной полости мышам в шам-группе только вытаскивали слепую кишку, а затем возвращали ее обратно. Мышей подкожно вводили 1 мл 0,9% раствора хлорида натрия после операции, размещали в отдельных клетках и кормили рутинно.

In vivo трансфекция

Перед моделированием мышей распределяли в 7 групп (n = 8): группу модели, группу miR-499-5p agomir, группу agomir негативного контроля (NC), группу малого интерферирующего РНК (si)-Sox6, группу si-NC, группу miR-499-5p agomir + overexpresssion (oe)-Sox6 и группу miR-499-5p agomir + oe-NC. За час до моделирования мышей обрабатывали согласно группировке. Мышей анестезировали 1% натрия пентобарбитала внутрибрюшинно, затем фиксировали в положении лежа на спине под углом 45°, язык мыши сдвигали к стороне рта для обеспечения проходимости дыхательных путей. Переднюю кожу шеи мыши дезинфицировали и разрезали для экспозиции трахеи. Трансфекционный комплекс (50 мкл) всасывали микропробоотборником (капали в соответствии с группой, такое же количество фосфатно-буферного раствора (PBS) капали в группу модели) и затем медленно капали в трахею. После трансфекции мышей вертикально вращали, и трансфекционный комплекс полностью распределялся в легких [15]. В процессе трансфекции наблюдали дыхание и сердечный ритм мышей. Если происходила респираторная и сердечная остановка, трансфекцию немедленно прекращали и восстанавливали проходимость дыхательных путей. Трансфекцию продолжали, когда дыхание и сердечный ритм стабилизировались. MiR-499-5p agomir и его NC, а также соответствующие плазмиды Sox6 приобрели у Shanghai GenePharma Co., Ltd. (Шанхай, Китай). После трансфекции мышей размещали в отдельных клетках и кормили 1 день, затем эвтаназировали. Мышей анестезировали 1% натрия пентобарбитала внутрибрюшинно, фиксировали в положении лежа на спине и эвтаназировали вскрытием брюшной аорты. Кожу мыши локально дезинфицировали, открывали грудную полость, связывали трахею и правый главный бронх, отсоединяли правый главный бронх и удаляли правую легкую. Нижняя доля правой легкой помещали в 10% нейтральный формалин для патологического обследования, средняя доля быстро взвешивали для расчета влажного веса (W) и сушили при 56℃, сухой вес (D) рассчитывали через 72 ч, таким образом вычисляли соотношение W/D. Верхняя доля правой легкой хранили в жидком азоте для детекции мРНК и белка. Левую легкую промывали три раза 0,4 мл физиологическим раствором, собирали около 1 мл бальвеолярной о 씻очной жидкости (BALF), переносили в 1,5-мл эппендорфовскую (EP) пробирку и клали на лед. BALF центрифугировали при 1500 об/мин 5 мин и переносили в новую EP-пробирку, затем хранили при -80℃ для детекции воспалительных факторов.

Кроме того, мышей разделяли на 3 группы (n = 10/группа): шам-группу, группу модели и группу miR-499-5p agomir (50 мкл miR-499-5p agomir капали в трахею за 1 ч до операции). Выживаемость отслеживали каждые 12 ч, всего 7 дней. Наблюдали статус выживания мышей в течение 7 дней и определяли токсичность miR-499-5p [16].

Гематоксилин-эозиновое (H&E) окрашивание и оценка поврежденности

Ткани легких подготавливали в парафиновые срезы, окрашивали H&E и наблюдали под оптическим микроскопом. Поврежденность легких оценивали (альвеоларная гиперемия, кровоизлияние, инфильтрация или агрегация нейтрофилов в альвеолярной полости или стенке сосуда, утолщение альвеолярной стенки и/или образование гиалиновой мембраны) по патологической системе оценки поврежденности легких, выпущенной Американским торакальным обществом. 0 баллов означало отсутствие или очень легкие поражения; 1 балл — легкие поражения; 2 балла — умеренные поражения; 3 балла — тяжелые поражения; 4 балла — очень тяжелые поражения. Общий балл четырех пунктов представлял общий балл поврежденности легких [17].

Массоновское окрашивание и оценка

Ткани легких делали в парафиновые срезы (4 мкм) и обрабатывали Массоновским окрашиванием [18]. Коллагеновые волокна, слизь и хрящи окрашивались в синий цвет, цитоплазма, мышцы, целлюлоза и глиальные клетки — в красный, ядра клеток — в сине-черный. В полуколичественной системе оценки Ashcroft [19], 0 баллов означало нормальные легкие; 1 балл — легкое фиброзное утолщение альвеолярной или бронхиальной стенки; 3 балла — умеренное утолщение альвеолярной или бронхиолярной стенки без повреждения структуры легких; 5 баллов — ухудшение фиброза, сопровождающееся повреждением структуры легких, формирование фиброзных бандов или масс; 7 баллов — тяжелое повреждение структуры легких и обширные области фиброза, формирование фиброзных бандов или сгустков; 8 баллов — всеобластная фиброзная упаковка.

TUNEL-окрашивание

А폽тоз тканей легких тестировали TUNEL-набором (Roche Diagnostics GmbH, Мангейм, Германия) и наблюдали оптическим микроскопом. Апоптотические клетки окрашивались в коричневый цвет в ядре. Апоптозный индекс показывал процент TUNEL-позитивных клеток [20].

Иммуногистохимия

Срезы тканей легких депарафинизировали ксилолом, инкубировали с 3% перекисью водорода и блокировали козьим сывороточным белком. Затем использовали как антитела Каспазу-3 (ab13847, 1:500), Каспазу-9 (ab32539, 1:250) и SOX6 (ab30455, 1:500, все от Abcam, MA, США) для иммуноокрашивания срезов. Оптический микроскоп (Leica Microsystems, IL, USA) использовали для захвата изображений, которые затем анализировали программным обеспечением Image Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Rockville, MA, USA) [21].

Обратная транскрипция количественная полимеразная цепная реакция (RT-qPCR)

Набор OMEGA (Solarbio science & technology Co., Ltd., Пекин, Китай) использовали для экстракции общей РНК в тканях легких и определения концентрации РНК. Комплементарная ДНК (cDNA) синтезировали обратной транскрипцией в соответствии с набором RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, США). Праймеры проектировали Invitrogen (Carlsbad, CA, USA), как показано в Таблице 1. ПЦР-реакцию проводили в соответствии с набором FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) (Roche). Эксперимент количественно анализировали методом 2^−△△Ct. U6 был контрольной нагрузкой для miR-499-5p, а GAPDH — внутренним параметром для других генов [22].

Вестерн-блот анализ

Общий белок собирали, используя буфер лизиса радиоиммунопреципитационного анализа для обработки тканей легких. Концентрацию общего белка измеряли методом бинхониновой кислоты. Образец белка (30 мкг) обрабатывали 10% натрий-додецил-сульфат полиакриламидной гель-электрофорезом, переносили на поливинилиденфторидную мембрану, блокировали 5% обезжиренным сухим молоком и инкубировали с первичными антителами: Sox6 (ab30455, 1:1000, Abcam), Каспаза-3 (9661, 1:1000, Cell Signaling Technology, MA, США), Каспаза-9 (9502, 1:1000, Cell Signaling Technology), опухолевой некрозный фактор-α (TNF-α, ab6671, 1:1000, Abcam), интерлейкин-1β (IL-1β, 16806-1-AP, 1:500, Proteintech, США), IL-6 (ab6672, 1:1000, Abcam) и GAPDH (sc-32233, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, США). Затем мембрану инкубировали с вторичным антителом (1:2000) и разрабатывали усиленной хемолюминесценцией [23].

Иммуноферментный анализ (ELISA)

Уровни IL-1β, IL-6 и TNF-α в BALF определяли ELISA-набором (Boster, Хубэй, Китай). Колориметрическое определение проводили при 450 нм.

Детекция индексов оксидативного стресса

Ткани легких в жидком азоте взвешивали и разбавляли в определенной пропорции физраствором при низкой температуре, затем гомогенизировали и центрифугировали при 4℃, 3000 об/мин 20 мин при низкой температуре, и supernatент забирали для определения. Активность миелопероксидазы (MPO) тестировали MPO-детекционным набором (Наньцзинь Цзяньчэн Байоинжиниринг Институт, Наньцзин, Китай), а мальондиальдегид (MDA), супероксиддисмутаза (SOD), глутатионпероксидаза (GSH-Px) и каталаза (CAT) тестировали наборами, предоставленными Цзяньчэн Байоинжиниринг Институтом.

Двойной люциферазный репортер-генный анализ

Sox6 мог быть мишенью гена miR-499-5p, что предсказывали биологическим веб-сайтом (https://www.targetscan.org/vert_72/). Существовало четыре сайта связывания между miR-499-5p и 3′непереведенной областью (UTR) мРНК Sox6. Векторы pmiR-RB-REPORT-Sox6 wild type (WT) и pmiR-RB-REPORT-Sox6 mutant type (MUT) конструировали Guangzhou RiboBio Co., Ltd. (Гуандун, Китай), и генерировали соответствующие люциферазные репортерные плазмиды. Клетки TC-1 (мышиные эпителиальные клетки легких, 1 × 10⁵ клеток/колодец, Shanghai Yiyan biological technology Co., Ltd., Шанхай, Китай) посевали в 24-колодецкую пластинку и трансфицировали miR-499-5p agomir или agomir-NC, pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT или pmiR-RB-REPORT-Sox6 MUT через Lipofectamine2000. Систему двойного люциферазного репортер-генного анализа (Promega, WI, USA) применяли для измерения люциферазной активности.

Статистический анализ

Все данные анализировали программным обеспечением SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, USA). Измерительные данные выражали средним ± стандартным отклонением. Сравнения между двумя группами проводили t-тестом, сравнения среди множественных групп оценивали однофакторным дисперсионным анализом (ANOVA), и пост-хок тест Тьюки использовали для попарного сравнения после ANOVA. Кривую выживания строили методом Каплан-Мейер. P-значение < 0,05 указывало на статистически значимую разницу.

Результаты

Соотношение W/D и Sox6 повышены, в то время как miR-499-5p снижено в тканях легких мышей с сепсис-индуцированной поврежденностью легких

Токсичность miR-499-5p тестировали на мышах для детекции времени выживания септических мышей. Результаты показали (рис. 1a): уровень выживания в течение 7 дней мышей в шам-группе составлял 100%, а септических мышей снижался. Уровень выживания септических мышей после лечения miR-499-5p улучшался. Результаты соотношения W/D тканей легких продемонстрировали (рис. 1b): по сравнению с шам-группой, соотношение W/D повышалось в группе модели (P < 0,05). В сравнении с группой agomir NC и группой si-NC, соотношение W/D снижалось в группе miR-499-5p agomir и группе si-Sox6 (оба P < 0,05). Соотношение W/D заметно повышалось в группе miR-499-5p agomir + oe-Sox6 относительно группы miR-499-5p agomir + oe-NC (P < 0,05).

Экспрессию miR-499-5p и Sox6 детектировали и обнаружили (рис. 1c–f): в противовес шам-группе, miR-499-5p снижалась, а Sox6 повышалась в группе модели (оба P < 0,05). В отношении группы agomir NC, miR-499-5p повышалась, а Sox6 снижалась в группе miR-499-5p agomir (оба P < 0,05). По сравнению с группой si-NC, Sox6 подавлялась в группе si-Sox6 (P < 0,05). В сравнении с группой miR-499-5p agomir + oe-NC, Sox6 драматически повышалась в группе miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (P < 0,05).

Белковое содержание Sox6 в тканях легких септических мышей определяли иммуногистохимией (рис. 1g). Наблюдали, что по сравнению с шам-группой, белковая экспрессия Sox6 повышалась в группе модели (P < 0,05); по сравнению с группой agomir NC и si-NC, более низкая белковая экспрессия Sox6 выявлялась в группе miR-499-5p agomir и группе si-Sox6 (оба P < 0,05); относительно группы miR-499-5p agomir + oe-NC, белковая экспрессия Sox6 усиливалась в группе miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (P < 0,05).

Восстановленная miR-499-5p или истощенная Sox6 облегчают патологию тканей легких, снижают оценку поврежденности, коллагеновые волокна и степень легочной фиброзе у мышей с сепсис-индуцированной поврежденностью легких

Результаты H&E окрашивания представили (рис. 2a): в шам-группе структура ткани легких была интактной, альвеолярная перегородка в основном проявлялась без отека или воспаления, и альвеолярная полость была чистой. В группах модели, agomir NC, si-NC и miR-499-5p agomir + oe-Sox6 в большинстве альвеолярных полостей тканей легких виделись экссудация, отек и кровоизлияние, и массивная инфильтрация воспалительных клеток показывалась в легочной интерстиции. В группах miR-499-5p agomir, si-Sox6 и miR-499-5p agomir + oe-NC поражение тканей легких снижалось по сравнению с группой модели.

Результаты оценки поврежденности легких мышей и полуколичественной оценки Ashcroft показали (рис. 2b, d): в отношении шам-группы, оценка поврежденности легких и степень легочной фиброзе очевидно повышались в группе модели (P < 0,05). По сравнению с группой agomir NC и si-NC, оценка поврежденности легких и степень легочной фиброзе снижались в группе miR-499-5p agomir и группе si-Sox6 (оба P < 0,05). В противовес группе miR-499-5p agomir + oe-NC, оценка поврежденности легких и степень легочной фиброзе заметно повышались в группе miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (P < 0,05).

Результаты Массоновского окрашивания выявили (рис. 2c): в шам-группе ткани легких мышей содержали небольшое количество синих коллагеновых волокон. В группах модели, agomir NC, si-NC и miR-499-5p agomir + oe-Sox6 коллагеновые волокна увеличивались. В группах miR-499-5p agomir, si-Sox6 и miR-499-5p agomir + oe-NC коллагеновые волокна снижались по сравнению с группой модели.

Восстановленная miR-499-5p или истощенная Sox6 снижают TUNEL-позитивные клетки, экспрессию белков Каспазы-3 и Каспазы-9 в тканях легких мышей с сепсис-индуцированной поврежденностью легких

Результаты вестерн-блот, TUNEL-окрашивания и иммуногистохимии указали (рис. 3a–f): нормальное ядро было синим, а а폽тотическое ядро — коричневым в разных оттенках. По сравнению с шам-группой, TUNEL-позитивные клетки, экспрессия белков Каспазы-3 и Каспазы-9 повышались в группе модели (все P < 0,05). По сравнению с группами agomir NC и si-NC, TUNEL-позитивные клетки, экспрессия белков Каспазы-3 и Каспазы-9 снижались в группе miR-499-5p agomir и группе si-Sox6 (все P < 0,05). По сравнению с группой miR-499-5p agomir + oe-NC, TUNEL-позитивные клетки, экспрессия белков Каспазы-3 и Каспазы-9 повышались в группе miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (все P < 0,05).

Восстановленная miR-499-5p или истощенная Sox6 снижают содержание TNF-α, IL-1β и IL-6 в BALF и тканях легких мышей с сепсис-индуцированной поврежденностью легких

Результаты ELISA и вестерн-блот анализа показали (рис. 4a–g): содержание TNF-α, IL-1β и IL-6 повышалось в группе модели относительно шам-группы (все P < 0,05). По сравнению с группами agomir NC и si-NC, содержание TNF-α, IL-1β и IL-6 снижалось в группе miR-499-5p agomir и группе si-Sox6 (все P < 0,05). По сравнению с группой miR-499-5p agomir + oe-NC, содержание TNF-α, IL-1β и IL-6 повышалось в группе miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (все P < 0,05).

Восстановленная miR-499-5p или истощенная Sox6 повышают активность SOD, CAT и GSH-Px, а также снижают содержание MDA и MPO в тканях легких мышей с сепсис-индуцированной поврежденностью легких

Результаты детекции индексов оксидативного стресса представили (рис. 5a–e): по сравнению с шам-группой, активность SOD, CAT и GSH-Px снижалась, в то время как содержание MDA и MPO повышалось в группе модели (все P < 0,05). По сравнению с группами agomir NC и si-NC, активность SOD, CAT и GSH-Px повышалась, в то время как содержание MDA и MPO снижалось в группе miR-499-5p agomir и группе si-Sox6 (все P < 0,05). По сравнению с группой miR-499-5p agomir + oe-NC, активность SOD, CAT и GSH-Px подавлялась, в то время как содержание MDA и MPO усиливалось в группе miR-499-5p agomir + oe-Sox6 (все P < 0,05).

miR-499-5p напрямую нацеливается на Sox6

Мы предсказали через биоинформатический веб-сайт TargetScan, что существовали целевые сайты связывания между miR-499-5p и SOX4/6. Используя RT-qPCR, обнаружили, что по сравнению с шам-группой, экспрессия SOX2/4/6 повышалась в группе модели, и экспрессия SOX6 повышалась больше всего (все P < 0,05); по сравнению с группой agomir NC, группа miR-499-5p agomir не демонстрировала изменений в экспрессии SOX2, показывала сниженную экспрессию SOX4, в основном сниженную SOX6 (Дополнительный файл 1: Рис. S1a, b). Поэтому мы окончательно выбрали SOX6 как целевой ген miR-499-5p. Биологический предсказательный веб-сайт (https://www.targetscan.org/vert_72/) выявил, что miR-499-5p может нацеливаться на Sox6 (рис. 6a). Двойной люциферазный репортер-генный анализ продемонстрировал (рис. 6b), что по сравнению с контрольной группой, люциферазная активность очевидно разрушалась после ко-трансфекции вектора pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT и miR-499-5p agomir в клетки TC-1 (P < 0,05), в то время как люциферазная активность не показывала явной разницы после ко-трансфекции miR-499-5p agomir с pmiR-RB-REPORT-Sox6 MUT вектором или agomir-NC с pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT вектором (P > 0,05), что указывает на то, что miR-499-5p может напрямую связываться с 3′UTR WT Sox6, а затем ингибировать люциферазную активность.

Обсуждение

Сепсис — критическая причина шока и синдрома множественной органной дисфункции, среди которых ALI является наиболее частой и значительной органной осложнением [24]. Сепсис-индуцированная ALI проявляется не только наиболее рано, с наивысшей инцидентностью, но и прогрессирует быстро, смертность высока, и на данный момент нет эффективной терапии [25]. Предыдущее исследование предполагало, что ап-регуляция miR-218 аттенуировала секрецию воспалительных факторов и предотвратила сепсис-индуцированную поврежденность легких [26]. Также повышение уровней miR-146a могло снизить воспаление при ALI [27], а восстановление miR-125b улучшало выживание мышей с ALI и подавляло воспаление [28]. Хотя исследования подчеркивали роль miRNA в поврежденности легких, детальный механизм miR-499-5p в сепсис-индуцированной поврежденности легких был мало изучен, поэтому мы фокусировались на miR-499-5p для открытия его терапевтического потенциала в сепсис-индуцированной ALI. Также исследование предоставило доказательство того, что повышенный Sox6 был вовлечен в сепсис-индуцированный сердечный а폽тоз [10]. Необходимы усилия для глубокого понимания сепсис-индуцированной поврежденности легких. Мы стремились обсудить защитный эффект miR-499-5p, нацеливаясь на Sox6, на сепсис-индуцированную поврежденность легких у мышей.

Соотношение W/D тканей легких рассчитывали в нашем исследовании, и экспрессию Sox6 и miR-499-5p в тканях легких мышей оценивали. Результаты показали, что соотношение W/D и Sox6 повышались, в то время как miR-499-5p снижалось в тканях легких мышей с сепсис-индуцированной поврежденностью легких. Недавнее исследование предполагало, что экспрессия miR-499-5p у пациентов с легким сепсисом, тяжелым сепсисом и септическим шоком была драматически снижена относительно нормальных контролов [9]. Другое исследование представило, что экспрессия miR-499-5p была заметно снижена в тканях не мелкоклеточного рака легких (NSCLC) и связана с плохими клиническими исходами [29]. Сообщается, что экспрессия Sox6 повышалась в тканях рака легких по сравнению с нормальными тканями [30]. Аналогично, предыдущее исследование выявило, что экспрессия Sox6 была заметно повышена в тканях почек мышей с диабетической болезнью почек [31]. Наше исследование также представило, что miR-499-5p напрямую нацеливается на Sox6. Важным открытием было то, что Sox6 является целевым геном miR-499 [10]. Другое исследование предоставило данные о том, что Sox6 был целевым геном miR-499-5p, и восстановление miR-499-5p подавляло экспрессию Sox6 [32]. Однако целевое отношение miR-499-5p и Sox6 в тканях легких сепсис-индуцированных мышей не было раскрыто до сих пор.

Кроме того, было выявлено, что восстановленная miR-499-5p или истощенная Sox6 облегчали патологию тканей легких, снижали оценку поврежденности, коллагеновые волокна и степень легочной фиброзе, а также снижали TUNEL-позитивные клетки, экспрессию белков Каспазы-3 и Каспазы-9 в тканях легких мышей с сепсис-индуцированной поврежденностью легких. Ранее предполагалось, что ап-регуляция miR-499-5p подавляла пролиферацию клеток и продвигала а폽тоз in vivo и in vitro при NSCLC [29]. Другое исследование верифицировало, что восстановление miR-499-5p и истощение Sox6 аттенуировали гипоксия/реоксигенация-индуцированный клеточный а폽тоз и снижали экспрессию Каспазы-3 [32]. Было представлено, что даун-регуляция Sox6 облегчала патологическую поврежденность и репрессировала нейронный а폽тоз в гиппокампальных тканях болезни Альцгеймера [33]. Более того, исследование выявило, что истощение Sox6 ингибировало высокоглюкозо-индуцированный клеточный а폽тоз и почечную интерстициальную фиброзу в почечных мезангиальных клетках мышей [31]. Другое исследование продемонстрировало, что низкая экспрессия Sox6 снижала активность Каспазы-3 и процент а폽тотических клеток в мышиных клетках P19CL6 [34]. Кроме того, мы верифицировали, что восстановленная miR-499-5p или истощенная Sox6 снижали содержание TNF-α, IL-1β и IL-6 в BALF и тканях легких мышей с сепсис-индуцированной поврежденностью легких. Xia et al. прояснили, что уровни TNF-α и IL-6 драматически повышались у мышей с сепсис-индуцированной поврежденностью легких [35]. Исследование продемонстрировало, что низкая экспрессия Sox6 снижала воспалительную реакцию в гиппокампальных тканях болезни Альцгеймера [33]. Другой результат в этом исследовании подразумевал, что восстановленная miR-499-5p или истощенная Sox6 повышали активность SOD, CAT и GSH-Px, а также снижали содержание MDA и MPO в тканях легких мышей с сепсис-индуцированной поврежденностью легких. Было представлено, что CLP-индуцированная ALI характеризовалась воспалением в морфологии, повышенным W/D соотношением, повышенной белковой концентрацией в BALF, более высоким уровнем MPO и MDA, а также более низким уровнем активности SOD, GSH-Px и CAT в легких после CLP [36]. Предлагалось, что активность SOD и CAT снижалась при сепсис-индуцированной ALI у мышей [37]. Кроме того, исследование сообщило, что overexpresssed miR-499-5p и низкоэкспрессированный Sox6 снижали уровень MDA [32].

Заключение

В заключение, мы обнаружили, что высокая экспрессия miR-499-5p может аттенуировать а폽тоз клеток тканей легких и ингибировать воспаление при сепсис-индуцированной поврежденности легких мышей через истощение Sox6, что может иметь важные терапевтические импликации в лечении сепсис-индуцированной поврежденности легких. Тем не менее, клинические исследования необходимы для определения эффективности для лечения сепсис-индуцированной поврежденности легких.

Доступность данных и материалов

Не применимо.