Влияние наночастиц SiO₂ на экспрессию генов и метилирование ДНК в тканях легкого и семенников

Аннотация

Нанотехнологии быстро развиваются и применяются в передовых медицинских терапиях. Однако растет обеспокоенность тем, что воздействие наночастиц (NP) может вызывать системные заболевания, так как эпигенетические механизмы ассоциируются с все большим числом заболеваний. Роль наноматериалов в эпигеномных модификациях важна для этиологии болезней. Цель — определить эпигенетические механизмы повреждения клеток легкого и семенников воздействием SiO₂ NP. Использовали самцов C57BL/6 для оценки повреждений легких и семенников, а также метилирования в импринтированной области Dlk1/Dio3. Клетки A549 под воздействием SiO₂ NP показали апоптозу; у мышей замечены изменения в тканях легкого и семенников. Гены в импринтированных доменах Dlk1/Dio3 изменились в обеих тканях: Dlk1, Rtl1, Dio3 урегулированы в семенниках, Dlk1 и Dio3 — в легком. Бисульфитное секвенирование ПЦР легких и семенников взрослых самцов показало преимущественно гипометилирование с редкими гиперметилированными CpG. Результаты указывают на важную роль наночастиц в метилировании ДНК импринтированных генов.

Введение

Диоксид кремния (SiO₂) — оксид кремния, в природе кварц, широко встречается в органических средах. Инженерные наночастицы массово применяются в высокотехнологичных отраслях. Этот наноматериал используется в электронике, пластиках, медицине, косметике, покрытиях благодаря большей удельной поверхности, реактивным центрам, высокой поверхностной энергии, насыщенным химическим связям, сильной адсорбции и взаимодействию с металлами и органикой, меняющим перенос загрязнителей. Широкое присутствие SiO₂ NP в потребительских товарах повышает вероятность их попадания в среду и контакта с людьми.

Предыдущие эксперименты показали, что однократная интратрахеальная инстилляция или множественные интраперитонеальные инъекции металлических и оксидных NP вызывают токсические эффекты от клеточного до организма уровней. SiO₂ NP подавляют рост клеток рака груди, повышая апоптоз и снижая подвижность. Воздействие SiO₂ NP значительно нарушает рецептор эпидермального фактора роста (EGFR). При обработке крыс тремя размерами TiO₂ NP большие агломераты (>100 нм) вызывали острый воспалительный ответ, малые (<100 нм) — окислительный стресс и цитотоксичность.

Токсичность NP для репродукции — растущая область. Ni NP вызывали высокую репродуктивную токсичность у C. elegans по сравнению с микропartikelами: уменьшение размера потомства, оплодотворенных яйцеклеток, активации сперматозоидов. Есть доказательства, что экологические факторы передаются потомству по отцовским путям без изменений в геноме спермы. Отцевая информация содержится не только в геноме, но и в эпигенетических маркерах, мРНК и некодирующих РНК.

Окислительный стресс — важный механизм нанотоксичности, запускающий повреждение ДНК, воспаление, денатурацию белков, перекисное окисление липидов. Биологические эффекты зависят от физико-химических свойств NP: размера, площади, формы, поверхностной химии, функционализации, растворимости. Нарастают доказательства, что воздействие NP может вызывать эпигенетические изменения в тканях и клетках даже при низких, нецитотоксичных дозах. Эпигенетика изучает наследственные изменения функции генов без изменения ДНК последовательности: метилирование ДНК, импринтинг генов, гистоновые модификации, регуляция некодирующими РНК. Такие изменения ассоциированы с развитием множества патологий. Поэтому эпигенетические эффекты критичны для оценки рисков на клеточном уровне.

Импринтированный домен Dlk1/Dio3 содержит три дифференциально метилированных региона (DMR), метилированных по отцовской линии: интергенный DMR (IG-DMR), матернино экспрессированный 3-DMR (Gtl2-DMR) и Dlk1-DMR. Предыдущие исследования предполагают, что IG-DMR диктует аллельную метилированность промотора Gtl2, которая контролирует экспрессию всего кластера. В геноме мыши множество импринтированных генов в домене Dlk1/Dio3 на дистальном участке хромосомы 12. IG-DMR между Dlk1 и Gtl2 специфически метилирован в мужской половой линии и регулирует аллель-специфическую экспрессию. Статус метилирования IG-DMR устанавливается до рождения и сохраняется всю жизнь в мужской половой линии при дифференцировке мужских половых клеток, то есть метилирование IG-DMR сохраняется в сперматогониях и сперматоцитах зрелых семенников.

Наша цель — выявить изменения в экспрессии генов мужской половой линии при сперматогенезе до транскрипционного и трансляционного silencing для объяснения отцовского влияния на потомство через изменения среды. Экологические факторы могут модифицировать транскрипционные изменения спермы, приводя к изменениям в развитии потомства. Для исследования использовали клеточные линии и мышей как модели скрининга токсических эффектов SiO₂ NP. На наш взгляд, это первое исследование, демонстрирующее эпигенетические механизмы повреждения импринтированных регионов Dlk1/Dio3 наночастицами в тканях легкого и семенников.

Методы

Экспериментальные животные

Работа с животными соответствовала Руководству по уходу и использованию лабораторных животных под протоколом Нанкинского медицинского университета. Мыши из Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Содержание при 23 °C, 12-часовой световой цикл. Вода и корм ad libitum. Мониторинг активности ежедневно. Через 2 недели инъекции нано-SiO₂ 12,5 мг/кг.

Реактивы

Нано-SiO₂ (99,5%, 10–20 нм) от Sigma-Aldrich. NP взвешивали в RPMI 1640, ультразвуковая диспергация 20 мин, разбавление, еще 20 мин ультразвука.

Характеристики SiO₂ NP

Размер и дзета-потенциал измеряли Malvern Zetasizer Nano ZSP.

Извлечение РНК и qRT-PCR

Образцы легкого и семенников заморожали в жидком азоте, хранили при -80 °C ~4 ч. Общая РНК изолировали TRIzol (Invitrogen). Ультразвук 80% мощности 5 мин, добавили хлороформ, центрифуга 12000g/мин 4 °C 15 мин. Три этапа фенол/хлороформ очистки для удаления белков. UV абсорбция при 260/280 нм для качества. Праймеры в доп. файле 1: Таблицы S1, S2. qRT-PCR по протоколу производителя (SYBR Green, Vazyme). Цикл: 95 °C 30 с, 40 циклов 95 °C 15 с, 60 °C 15 с, 72 °C 30 с. Анализ 2^-ΔCt с нормализацией на β-актин.

Извлечение ДНК, бисульфитная обработка и БСП

ДНК из тканей семенников и легкого изолировали QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen). Бисульфитная конверсия 500 нг гДНК EpiTect Bisulfite kit (Qiagen). Олигонуклеотиды для CpG метилирования спроектированы Methyl Primer Express v1.0: P1-F/R, P2-F/R, P3-F/R, P4-F/R (последовательности в тексте). ПЦР: 2,5 мкл 10× буфер, 500 нг бисульфит-ДНК, 0,5 мкл праймеров, 0,5 мкл dNTP, 0,5 мкл rTaq (Takara), ddH₂O до 25 мкл. Активация 94 °C 10 мин, 40 циклов: 94 °C 30 с, 58 °C 30 с, 72 °C 1 мин, финал 72 °C 10 мин.

Клеточная культура и обработка

A549 (ATCC) культивировали в RPMI 1640 + 10% ФБС, 37 °C, 5% CO₂. Посеяли в 96-колончатые пластинки, инкубировали с SiO₂ NP концентрациями 62,5–2000 мкг/мл 24 ч.

Тест жизнеспособности клеток

CCK-8 пролиферационный тест. Плотность 1,5×10⁴ клеток/колонка, ночная инкубация. После воздействия SiO₂ NP добавили 100 мкл CCK-8, 30 мин 37 °C. Абсорбция при 450 нм. Ингибирующие скорости расчитали, IC₅₀ определили SPSS 15.0.

Статистический анализ

SPSS 15.0. Сравнение групп: непарный t-тест и Пирсон хи-квадрат для БСП. Данные как mean ± SD. Значимость p < 0,05.

Результаты

Характеристика SiO₂ NP

Средний гидродинамический радиус и дзета-потенциал в среде: 371,77 ± 18,46 нм и 18,83 ± 2,12 мВ (рис. 1).

Влияние SiO₂ NP на линию A549

Пролиферационный тест определил IC₅₀. Рис. 1c: SiO₂ NP снижают жизнеспособность A549 доза-зависимо. Значимое снижение при >62,5 мкг/мл (p<0,001). IC₅₀ 24ч = 4942 мкг/мл.

Влияние SiO₂ NP на легкие и семенники мышей

Доза 12,5 мг/кг привела к нарушению ламеллярных тел в легких (рис. 2a,b) и повреждению митохондриальных крист в семенниках (рис. 2c,d) по сравнению с контролем. Изучали активацию импринтинга в регионе Dlk1/Dio3.

Экспрессия импринтированных генов в легких и семенниках

Анализировали 24 импринтированных гена. 13 экспрессируются в обеих тканях: Dio3, Dlk1, Gpr1, Gtl2, Igf2r, Igf2, Inpp5f, Peg10, Ndn, Nnat, Rasgrf1, Rtl1, Snrpn (рис. 3a,b). Фокус на Dlk1/Dio3 регионе: Dlk1, Gtl2, Rtl1, Dio3.

Экспрессия региона Dlk1/Dio3

Регион содержит белок-кодирующие гены Dlk1, Gtl2, Rtl1, Dio3 на унаследованном аллеле (рис. 4c). Анализ метилирования DMR по сравнению с контролем: разные гены метилируются в легком и семенниках. Dlk1 и Dio3 урегулированы в обеих тканях, Rtl1 — только в семенниках (рис. 4a,b).

Метилирование DMR регионов Dlk1/Dio3

Анализ трех участков CpG островов. В семенниках преобладает гипометилирование, но CpG остров 1 значимо гиперметилирован (рис. 5). В легком общая картина похожа, но CpG остров 2 показал гиперметилирование (рис. 6).

Обсуждение

Растущее применение наноматериалов вызывает опасения за здоровье и экологию. Предыдущие работы: SiO₂ NP вызывают повреждение легких и сердечно-сосудистых (воспаление, ишемическое повреждение миокарда у старых крыс). NP могут воздействовать на половую линию, так как клетки более чувствительны к токсичности Ag NP при более низких дозах. Ag NP увеличили аномалии в сперматозоидах крыс, снизили целостность акрозомы и плазматической мембраны, митохондриальную активность. Наше исследование — часть серии оценки потенциала NP воздействовать на мужские организмы и их необлученное потомство.

Ранее in vitro: кратковременное воздействие NP вызывает апоптоз и аберрантную экспрессию импринтированных генов в TM-4 клетках Сертоли, что может быть механизмом репродуктивной токсичности. In vivo: эндокринные дисрупторы способствуют фенотипам/болезням не только у экспонированных, но и в последовательных поколениях. Эпимутации в половой линии, ставшие постоянными, позволяют трансгенерациональную передачу эпигенетических фенотипов. Цель — изучить изменения эпигенетического состояния под воздействием SiO₂ NP в мурином модели для механистической базы отцовских трансгенерациональных эффектов.

Эпигенетическое состояние — химические модификации генома без изменения ДНК последовательности: метилирование ДНК, импринтинг, гистоновые модификации, некодирующие РНК. Эпигенетические механизмы влияют на геномную функцию в экзогенной среде. На наш взгляд, первое исследование SiO₂ NP индуцирующей токсичность легких и семенников на эпигенетическом уровне.

Сначала изучили острую токсичность SiO₂ NP в A549 (человечная эпителиальная линия легкого). В мышах выявили повреждение ламеллярных тип II эпителиоцитов легкого и митохондриальных гребней семенников при экологических концентрациях. Для понимания механизма патологии проанализировали импринтированные гены. Гénomный импринтинг — silencing одного родительского аллеля в зиготах гамет в зависимости от происхождения; происходит через эпигенетические процессы: метилирование ДНК и/или гистоновые модификации. Импринтированная экспрессия в домене Dlk1/Dio3 важна для фетального роста, тайминга полового созревания, восприимчивости к метаболическим заболеваниям. IG-DMR диктует аллельную метилированность промотора Gtl2, контролируя экспрессию всего кластера. Основная функция — наследовать метилирование ДНК половых клеток как гаметический сигнал и поддерживать аллель-специфические паттерны в соматических клетках. Наше исследование показало, что SiO₂ NP изменяют экспрессию Dlk1/Dio3 в легких и семенниках. В регионе отцовские гены (Dlk1, Rtl1, Dio3) аномальны после NP. Бисульфитное секвенирование показывает разные уровни гипометилирования в легком и семенниках. Статус метилирования IG-DMR общий ниже в обработанных тканях, и эта гипометилирование может быть механизмом дифференциальной экспрессии импринтированных генов.

Заключение

Результаты указывают, что воздействие SiO₂ NP может индуцировать важные изменения метилирования ДНК, запускающие клеточное повреждение, и эти изменения критичны для экспрессии импринтированного кластера Dlk1/Dio3. Важно, изменения метилирования затрагивают и легкие, и семенники. Результаты играют роль в будущих исследованиях эпигеномных эффектов NP, наследуемых потомством экспонированных моделей, и уточнении молекулярных механизмов таких эпигенетических изменений.

Аббревиатуры

BALF

Bronchoalveolar lavage fluids (бронхоальвеолярный ошалочный жидкость)

CCK-8

Cell counting kit-8 (тест подсчета клеток-8)

DMRs

Differentially methylated regions (дифференциально метилированные регионы)

EGFR

Epidermal growth factor receptor (рецептор эпидермального фактора роста)

IG-DMR

Intergenic DMR (интергенный DMR)

MPs

Microparticles (микропartikelы)

NPs

Nanoparticles (наночастицы)