Хондроитинсульфат / поликапролактон / желатин нановолокна с электропрядением с антитромбогенностью и повышенным сродством к эндотелиальным клеткам как потенциальная основа для тканевой инженерии кровеносных сосудов

Введение

Разработка нановолоконных материалов привлекла большое внимание в качестве биомиметических каркасов для восстановления и регенерации тканей из-за их уникальных (био) физико-химических свойств, включая их сверхтонкую структуру, подобную внеклеточной матрице (ЕСМ), отличные механические свойства, большую удельную площадь поверхности и высокая пористость с межсоединениями [1, 2]. Было продемонстрировано, что нановолоконные структуры играют ключевую роль в опосредовании клеточных ответов, таких как клеточная адгезия, морфология (например, распространение, выравнивание, удлинение и т. Д.), Расположение, миграция, пролиферация, фенотип и дифференциация посредством контактного руководства [3 , 4,5]. В то время как многочисленные стратегии нанопроизводства (например, нановолокно, синтез шаблона, разделение фаз и т. Д.) Предоставили доступную технологию для изготовления нановолоконных материалов, электроспиннинг является одним из наиболее эффективных методов изготовления нановолокон из различных материалов (металлов, керамики, полимеров). , композиционные материалы и др.) в промышленных масштабах [6,7,8].

Помимо (био) физических сигналов, выбор подходящих биоматериалов может значительно повлиять на активность клеток, а также на восстановление и регенерацию тканей [9]. Следует учитывать некоторые ключевые особенности, такие как биосовместимость, биорезорбируемость, механические свойства и биологические функции [9, 10]. По сравнению с натуральными / натуральными и синтетическими / синтетическими композитами, композитным материалам из нановолокон, состоящим из природных и синтетических полимеров, уделяется больше внимания благодаря сочетанию превосходных биологических свойств природных полимеров и механической прочности синтетических полимеров [9]. Среди них комбинация желатина (Gt) / поликапролактон (PCL) является одной из наиболее репрезентативно исследованных природно-синтетических гибридных систем и широко используется в тканевой инженерии сосудов крови [11,12,13,14]. Однако композитные нановолокна Gt / PCL все еще имеют некоторые ограничения, такие как медленная эндотелизация и тромбоз. Недавно хондроитинсульфат (ХС) представляет собой сульфатированный полисахарид, содержащий гликозаминогликан и галактозамин, который, как было продемонстрировано, обладает высокой адгезией к эндотелиальным клеткам (ЭК), слабым взаимодействием с белками и тромбоцитами, а также электростатическим отталкиванием отрицательно заряженных компонентов крови [15 , 16,17]. Кроме того, CS может ингибировать апоптоз клеток и способствовать заживлению сосудистых ран [18, 19]. Следовательно, электропряденые нановолокна Gt / PCL (PG), содержащие CS, будут отличными кандидатами в качестве биоинструктивного каркаса тканевой инженерии для восстановления и регенерации кровеносных сосудов.

В настоящей работе биомиметические композитные нановолокна PG, содержащие различные соотношения CS, были разработаны с помощью одностадийного электроспиннинга. Морфология, химическая пористость и деградация композитных нановолокон CS / PG были обнаружены с помощью различных методов определения характеристик. Была проведена оценка антикоагулянта композитных нановолокон PG / CS. Кроме того, эти композитные нановолокна с различным соотношением CS были засеяны эндотелиальными клетками аорты человека (HAEC), чтобы исследовать их влияние на клеточные ответы.

Материалы и методы

Материалы

CS (трахея крупного рогатого скота, тип A, чистота:95%) был поставлен Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd. (Китай). PCL был получен от Aladdin Biochemical Polytron Technologies Inc. (Китай). Gt (бычья кожа, тип B) получали от Sigma-Aldrich Biochemical Technology Co., Ltd. (Китай). Набор активированного частичного тромбопластинового времени (APTT) был приобретен у Leigen Biotechnology Co., Ltd (Китай). Уксусная кислота (чистота:99,5%) была приобретена в Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Китай). Эндотелиальные клетки аорты человека (HAEC) были получены из больницы при университете Циндао (Китай). Питательная среда Dulbecco's Modified Eagle Medium / Nutrient Mixture F-12 (DMEM / F-12), фетальная бычья сыворотка (FBS), 0,25% трипсин-ЭДТА были приобретены в Biological Industries (Израиль). Все реагенты были приобретены у Sigma Aldrich (Китай), если не указано иное. Вода, использованная во всех экспериментах, была деионизированной.

Электропрядение нановолокон

PCL (10% мас. / Об.) Растворяли в уксусной кислоте при механическом перемешивании при комнатной температуре в течение 4 часов. Gt (10% мас. / Об.) Растворяли в 90% -ной уксусной кислоте при постоянном перемешивании в течение 2 часов. CS в различных концентрациях добавляли в раствор Gt и осторожно перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч для получения гомогенных растворов, содержащих 5, 10 и 15 мас.% CS относительно общей концентрации полимера. Затем был приготовлен раствор PG путем смешивания двух вышеуказанных растворов в массовом соотношении 50/50 (мас. / Мас.) При перемешивании в течение 2 часов, названных как 5% CS @ PG, 10% CS @ PG и 15% CS @ PG. .

Приготовленные гомогенные растворы подвергали процессу электроспиннинга, снабженного шприцем объемом 1 мл с иглой 21 G и коллектором, покрытым алюминиевой фольгой. В этом исследовании расстояние между пластиной коллектора и кончиком иглы было зафиксировано на уровне около 18 см, напряжение было установлено на уровне 23 кВ, а полимерные растворы откачивались со скоростью 1 мл / ч. Все растворы подвергали электропрядению на приборе для электропрядения (Technology, Tk602TH, Китай) при комнатной температуре и тщательно контролируемой влажности (<40%). Перед дальнейшими экспериментами образцы помещали в вакуумную сушильную печь на 72 часа, по крайней мере, для удаления остатков растворителя.

Сканирующая электронная микроскопия (SEM) и просвечивающий электронный микроскоп (TEM)

Морфологию нановолоконных каркасов CS @ PG исследовали с помощью SEM (VEGAS, TESCAN, Чехия) при ускоряющем напряжении 20 кВ при комнатной температуре. Диаметр нановолокон ( n =100) были дополнительно измерены по изображениям SEM с использованием программного обеспечения для анализа изображений (Изображение J).

Наблюдения с помощью ПЭМ и анализ энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии (EDS) проводились с использованием JEOL JEM-2100 plus (Япония).

Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (FTIR)

FTIR выполняли с помощью FTIR-спектрометра Nicolet iN10 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) для оценки характерных функциональных групп нановолокон CS, PG и нановолокон CS @ PG. Спектры образцов записывались в режиме пропускания в диапазоне длин волн 4000–500 см ⁻¹ . с разрешением 2 см ⁻¹ .

Пористость и абсорбция физиологического раствора с фосфатным буфером (PBS)

Пористость нановолокон определялась методом вытеснения жидкости. Во-первых, сухой вес нановолокон был взвешен как W ₁ . . Затем четыре группы нановолокон были погружены в этанол на 2 часа при 25 ° C и взвешены как W ₂ . Этанол с поверхности образца был удален фильтровальной бумагой, и затем веса образцов были отмечены как W ₃ . Пористость нановолокон рассчитывалась по следующей формуле:

Для испытания на абсорбцию раствора PBS полученные нановолокна взвешивали в сухом состоянии и записывали как Wd. Затем нановолокна замачивали в PBS в течение 24 часов при 25 ° C, и вес во влажном состоянии регистрировали как Ww после удаления избытка жидкости с поверхности образца. Коэффициент набухания можно измерить с помощью следующего уравнения:

Все значения в приведенных выше экспериментах выражены как среднее ± стандартное отклонение ( n =3).

Поведение, связанное с разлагаемостью in vitro

Чтобы определить устойчивость полученных нановолокон к лизоциму, разлагаемость образцов измеряли в запланированное время (1, 4, 7, 10 и 14 дней). Начальный вес нановолокон был записан как W _i . Затем образцы погружали в раствор PBS (pH 7,4), содержащий лизоцим (500 мкг / мл), и инкубировали in vitro при 37 ° C. В заранее определенные интервалы разложения каждую группу образцов удаляли, промывали деионизированной водой и сушили вымораживанием для получения конечной массы ( W _f ). Раствор лизоцима меняли трижды в неделю. Оставшуюся массу (%) нановолоконных каркасов оценивали по следующей формуле:

Чтобы оценить деградацию образца через 7 дней, морфологию нановолокон наблюдали с помощью SEM.

Анализ совместимости крови

Время коагуляции

Активированное частичное тромбопластиновое время (APTT) использовалось для оценки активности внутренних и общих путей коагуляции путем тестирования времени свертывания бедной тромбоцитами плазмы (PPP) после инкубации с электропрядеными нановолокнами на покровных стеклах. Для этого собирали кровь с антикоагулянтом (приблизительно 10 мл) и центрифугировали при 3000 об / мин в течение 20 минут для получения плазмы с низким содержанием тромбоцитов (PPP). Каждый образец инкубировали с 200 мкл PPP в течение 10 минут при 37 ° C и анализировали с использованием набора APTT в соответствии с инструкциями производителя ( n =3).

Тестирование гемолиза

Скорость гемолиза оценивали путем измерения концентрации гемоглобина, высвобожденного в фазу раствора из эритроцитов в разбавленной цельной крови, подвергнутой воздействию нановолокон, полученных методом электроспряжения. Образцы покровных стекол по отдельности помещали в 24-луночные планшеты и погружали в 2 мл PBS при 37 ° C на 30 мин. Группы отрицательного контроля содержали только 2 мл PBS, в то время как группы положительного контроля состояли из 2 мл деионизированной воды с целью индукции максимального лизиса эритроцитов ( n =3 для каждой тестовой группы). Затем в каждую лунку добавляли 40 мкл вышеуказанной антикоагулированной свежей цельной крови и инкубировали в течение 60 мин при 37 ° C, после чего суспензии удаляли в центрифужные пробирки и центрифугировали при 100 × g на 5 мин. Супернатанты измеряли оптическую плотность при 570 нм с использованием считывающего устройства для микропланшетов (SynergyH1 / H1M, BioTek, Китай).

Тромбогенность

Тромбогенный потенциал оценивали in vitro после инкубации образцов электропрядения с богатой тромбоцитами плазмой (PRP). PRP получали центрифугированием (1500 об / мин, 20 мин), а верхнюю половину плазмы отбрасывали. Затем нановолокна на покровных стеклах инкубировали в 100 мкл PRP при 37 ° C в течение 2 часов и трижды осторожно промывали PBS для последующих экспериментов. Чтобы оценить активность тромбоцитов после инкубации с PRP, электропряденые нановолокна хранили в DMEM с добавлением 10% FBS в течение 2 и 24 часов, а затем использовали набор для анализа CCK-8 для измерения жизнеспособности тромбоцитов на нановолокнах. CCK-8 (20 мкл) добавляли к 200 мкл бессывороточной среды DMEM в 24-луночных планшетах и ​​инкубировали в течение 1 часа. Наконец, суспензии были измерены с помощью устройства для чтения микропланшетов при длине волны 450 нм.

Культура клеток и жизнеспособность клеток

Эндотелиальные клетки аорты человека (НАЕС) ​​культивировали в среде DMEM с добавлением FBS (10%, об. / Об.) И стрептомицина / пенициллина (1%, об. / Об.) В атмосфере 37 ° C и 5% CO 2. . Питательную среду меняли трижды в неделю. Клетки обычно выделяли 0,05% трипсином / ЭДТА в течение 3 минут, центрифугировали при 1000 об / мин и суспендировали в свежей среде для проведения пассажа или посева клеток.

Перед посевом клеток все нановолокнистые материалы в 24-луночном планшете стерилизовали УФ-облучением в течение 1 часа и погружали в 75% этанол (об. / Об.,%) На 1 час. Затем нановолокна промывали четыре раза раствором PBS и вымачивали в DMEM в течение 12 часов в CO ₂ . инкубатор. Клетки засевали плотностью 1 × 10 ⁴ . клеток на лунку на нановолокнах и среду заменяли каждый день. Через 24 ч совместного культивирования клетки трижды промывали раствором PBS, а затем окрашивали с помощью набора для двойного окрашивания кальцеином-AM / PI (YEASEN Biochemical Technology Co., Ltd., Шанхай, Китай). PI использовали для окрашивания мертвых клеток и окрашивали кальцеином-AM для живых клеток.

Морфология клеток в нановолокнах

Для наблюдения за адгезией клеток на нановолокнах морфологию клеток наблюдали через 24 ч совместного культивирования с помощью флуоресцентного микроскопа (Nikon A1 MP, Япония). Сначала клетки фиксировали 4% параформальдегидом при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем 0,5% раствор Тритона Х-100 использовали в течение 5 мин для повышения проницаемости клеточной мембраны. Наконец, 4'6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) использовали для окрашивания ядер клеток, а родамин-фаллоидин использовали для окрашивания F-актина. Количественный анализ (плотность клеток, площадь отдельных клеток, удлинение клеток) был дополнительно выполнен с помощью Image J.

Размножение клеток

Активность пролиферации клеток на композитных нановолокнах определяли с помощью набора CCK-8 Assay Kit. HAEC были засеяны на нановолокна плотностью 8 × 10 ³ . ячеек / лунка. Питательную среду меняли каждые два дня. После 1, 4, 7 дней совместного культивирования клетки промывали раствором PBS для удаления неприлипающих клеток. Затем 20 мкл CCK-8 и полную среду в объемном соотношении 1:10 добавляли в 24-луночный планшет на 1 час в инкубаторе. Поглощение тестировали с помощью Elisa Reader при 450 нм.

Окрашивание клеток DAPI и родамин-фаллоидином проводили с помощью флуоресцентного микроскопа, чтобы непосредственно наблюдать изменения количества клеток после совместного культивирования с различными нановолокнами в течение двух и шести дней.

Статистический анализ

Все образцы в экспериментах обрабатывались в трех экземплярах. Все данные представлены как средние значения ± стандартное отклонение (SD). Статистический анализ образцов был определен с помощью однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) для сравнения различий со значимостью, присвоенной при p <0,05.

Результат и обсуждение

Приготовление и характеристика нановолокон CS @ PG

На рисунке 1 представлена ​​схематическая диаграмма процесса электроспиннинга для нановолоконных каркасов CS @ PG и оценка антикоагуляции и цитосовместимости in vitro. Для разработки инженерных каркасов сосудистой ткани для стимулирования пролиферации эндотелиальных клеток, различные соотношения CS (5, 10 и 15 мас.%) Были включены в растворы PG (10%, об. / Об.) Для изготовленных композитных нановолокон с помощью процесса электроспиннинга.

Схематическое изображение изготовления нановолокон и оценки in vitro

СЭМ была проведена для наблюдения за структурой нановолокон электроспрядения CS @ PG. Как показано на рис. 2, СЭМ-изображения нановолокон PG, 5% CS @ PG, 10% CS @ PG, 15% CS @ PG демонстрируют плотную волокнистую структуру, содержащую непрерывные, гладкие и наноразмерные волокна, полученные методом электроспиннинга. . Нановолокна PG (рис. 2а) показали множество нерегулярных шариков на нановолокнах в процессе электроспиннинга, имеющих средний диаметр 406,01 ± 146,28 нм. Это можно объяснить тем, что 10% (вес. / Об.) Раствор электроспрядения имел низкую вязкость, что приводило к образованию неоднородных нановолокон, содержащих шарики [20]. При увеличении количества CS в полимерном растворе от 5 до 10 мас.% Можно было получить гомогенные нановолокна без каких-либо гранул за счет увеличения вязкости раствора (рис. 2б, в). Соответственно, 5% CS @ PG и 10% CS @ PG показали меньший средний диаметр 382,35 ± 152,99 нм и 300,29 ± 100,85 нм соответственно. Этот результат в первую очередь объясняется тем, что увеличение содержания CS соответственно увеличивает проводимость раствора для электропрядения [20]. Однако, когда концентрация полимера составляла до 15%, вязкость раствора полимера слишком высока, чтобы его можно было растягивать в электрическом поле. При той же скорости потока 1 мл / ч, что и в предыдущих группах, мы наблюдали, что при приложенном напряжении 23 кВ возникло явление закупорки кончика иглы, и конус Тейлора не наблюдался. Следовательно, скорость потока раствора для электропрядения и приложенное напряжение были отрегулированы до 0,9 мл / ч и 20 кВ соответственно. Были успешно произведены нановолокна 15% CS @ PG со средним диаметром 266,92 ± 105,43 нм.

СЭМ-изображения и распределение диаметров электроспрядных каркасов CS @ PG при различных соотношениях CS. а PG, b 5% CS @ PG, c 10% CS @ PG, d 15% CS @ PG

Как показано на рис. 3а, было обнаружено, что CS был равномерно распределен в нановолокнах 5% CS @ PG и 10% CS @ PG. Однако агрегация CS была обнаружена в волокнах с 15% CS @ PG. Как показано на фиг. 3b, для определения содержания серы в подготовленных волокнах был проведен элементный анализ EDX. Как и ожидалось, содержание серы увеличивалось с увеличением концентрации CS в полученных волокнах.

Изображения TEM ( a ) и элементный анализ EDX электроспрядных каркасов CS @ PG при различных соотношениях CS, то есть PG, 5% CS @ PG, 10% CS @ PG и 15% CS @ PG

Анализ спектра FTIR

Для определения характерных пиков поглощения химической группы полученных нановолоконных каркасов был проведен анализ спектров FTIR. Спектры FTIR PG и CS считались контрольной группой для сравнения с группами нановолокон CS @ PG. В спектре PG сильные полосы поглощения, появляющиеся при 3300 см ⁻¹ и 2935 см ⁻¹ можно отнести к –NH ₂ и –OH валентное колебание, и CH ₂ асимметричная растяжка соответственно. Появилось несколько характерных пиков поглощения при 1652 см ^-1 . (амид I) для валентного колебания C =O, 1542 см ⁻¹ (амид II) для изгибных колебаний N – H, 1441 см ⁻¹ для канала ₂ растяжение, и 1267 см ⁻¹ (амид III) для валентного C – N колебания [21, 22]. В спектре CS наблюдается характерная полоса поглощения при 1245 см ⁻¹ . , представляющий собой растягивающее колебание S =O в отрицательно заряженном SO ₄ ^2– [23, 24].

Как показано на фиг. 4, спектры FTIR нановолокон с 5% CS @ PG, 10% CS @ PG и 15% CS @ PG показали характерные пики PCL, Gt и CS вместе. По сравнению со спектрами группы PG, группы CS @ PG показали характеристическую полосу CS при 1245 см ^-1 , а интенсивность полосы CS увеличивалась при наличии CS в нановолокнах. Это открытие подтвердило наличие различного содержания CS в электропряденых нановолокнах CS @ PG.

ИК-Фурье спектр каркасов из электроспрядника CS @ PG

Пористость, коэффициент набухания и разлагаемость нановолокон

Высокая пористость волокна указывает на то, что материал имеет отличные взаимосвязи, что способствует диффузии кислорода и питательных веществ в поры и способствует инфильтрации клеток [25, 26]. На рис. 5а показана пористость нановолоконных пленок. Пористость полученных нановолокон с различным соотношением CS составляла примерно до 80%. Высокопористая архитектура, полученная с помощью электропряденых нановолокон, может имитировать естественный ECM, обеспечивая тем самым благоприятную трехмерную микросреду для клеток [27]. Сообщалось, что каркасы в тканевой инженерии с пористостью до 80% были полезны для транспортировки питательных веществ и метаболитов.

а Пористость полученных нановолокон. б Абсорбция PBS приготовленных нановолокон. c Оставшаяся масса нановолокон CS @ PG после разложения в растворе PBS в течение до 14 дней. г СЭМ-микрофотографии нановолоконных пленок в растворе PBS при 37 ° C в течение 7 дней

Степень поглощения PBS нановолоконными каркасами CS @ PG сравнивали, чтобы оценить влияние CS на поглощение PBS пленками. Как показано на фиг. 5b, степень поглощения PBS каркаса PG составляла 586,34 ± 49,44%, а нановолокна 5% CS @ PG и 10% CS @ PG составляли 492,86 ± 21,99% и 510,04 ± 69,55%, соответственно. Коэффициент абсорбции PBS для групп 15% CS @ PG (665,07 ± 59,81%) был значительно выше, чем у 5% CS @ PG и 10% CS @ PG. Этот результат показал, что повышенное содержание CS в композитных нановолокнах может улучшить способность пленок поглощать PBS, что может быть связано с высокой гидрофильностью молекул CS, содержащих гидрофильные группы (карбоксил и гидроксил) [28].

Данные эксперимента по разложению in vitro показаны на фиг. 5c, и было обнаружено, что с увеличением отношения CS скорость разложения нановолоконных каркасов CS @ PG также увеличивалась. Это может быть связано с наличием SO ₄ ^2– группы [29]. Как показано на рис. 5c, скорость разложения большинства каркасов начала увеличиваться через 7 дней, и результаты разложения на 14-й день составили 8,45%, 11,39%, 13,97% и 15,10% для PG, 5% CS @ PG, 10 % CS @ PG и 15% CS @ PG нановолокнистые каркасы соответственно. СЭМ-изображения нановолоконных каркасов (рис. 5d) показали небольшое набухание после погружения в раствор PBS на 7 дней. СЭМ-изображения показывают, что разработанные нановолокна были достаточно стабильными, чтобы избежать серьезной деградации и разрастания до 7 дней, что влияло на реакцию клеток in vivo или in vitro.

Оценка гемосовместимости

АЧТВ - это простой и надежный метод обнаружения крови или плазмы с помощью внутреннего механизма свертывания. APTT был протестирован для измерения влияния электропряденых нановолокон на возможную задержку свертывания крови. Время свертывания, определенное с помощью APTT, показало статистически значимое уменьшение времени коагуляции между контрольными PG и 5% CS @ PG и 10% CS @ PG нановолокнами. Напротив, пролонгированное АЧТВ было обнаружено после инкубации 15% нановолокон CS @ PG с PPP, что указывает на его улучшенные антикоагулянтные свойства. Как показано на рис. 6а, влияние свертывания крови зависело от диаметра образцов нановолокон. Наименьшее время коагуляции APTT было обнаружено после взаимодействия с нановолокном 5% CS @ PG, а самое высокое APTT - с электропрядением 10% CS @ PG, аналогично степени гемолиза. Время коагуляции увеличивалось с увеличением соотношения CS.

а АЧВВ нановолокон CS @ PG. б Скорость гемолиза образцов. c Метаболическая активность тромбоцитов на нановолокнах. нет =3, * p <0,05

Согласно ASTM F756-00 (2000), скорость гемолиза биоматериалов должна быть <5% [30]. Степень гемолиза в этом исследовании определялась с помощью колориметрического анализа высвобожденного гемоглобина из эритроцитов и может быть рассчитана по уравнению:Гемолиз (%) =(OD _sam - OD _neg ) / (OD _pos - OD _neg ) × 100%. Как показано на рис. 6b, все образцы были негемолитическими и не вызывали какого-либо заметного гемолиза (скорость гемолиза менее 5%).

Данные эксперимента по жизнеспособности тромбоцитов показаны на рис. 6в. Через 2 ч метаболическая активность прикрепленных тромбоцитов была максимальной с максимальными значениями, достигнутыми после взаимодействия PRP с нановолокнами, особенно с нановолокнами PG. Интересно, что через 24 часа активность тромбоцитов снизилась во всех образцах. Этот результат может быть связан с быстрой активацией тромбоцитов структурой нановолокон, что приводит к быстрому потреблению и высвобождению факторов роста по сравнению со стабильной и длительной активацией тромбоцитов при контакте с гладкой поверхностью [31]. Нормальная продолжительность жизни тромбоцитов составляет примерно 8–10 дней, и она будет сокращаться по мере того, как тромбоциты начнут активироваться.

Окрашивание живых / мертвых клеток

Влияние CS на цитосовместимость нановолокон исследовали с помощью оценки жизнеспособности клеток, адгезивной морфологии и пролиферации HAEC на нановолокна в течение 6 дней. Присоединенные клетки оценивали с помощью набора для двойного окрашивания кальцеином-AM / PI, окрашивания DAPI и набора для анализа CCK-8.

На рис. 7a – e показаны флуоресцентные изображения живых и мертвых HAEC, прикрепленных к различным нановолокнам. Кальцеин-AM (зеленый) и PI (красный) использовали для окрашивания живых клеток и мертвых клеток соответственно. Можно было наблюдать, что живые клетки были прикреплены к композитным нановолокнам CS @ PG, что указывало на то, что нановолокна, содержащие различные соотношения CS, не были токсичны для HAEC. Дальнейший количественный анализ количества живых / мертвых клеток на нановолокнах был исследован с помощью изображения J (рис. 7f). По сравнению с долей живых и мертвых клеток на нановолокнах PG, другие три группы PG, содержащие различные соотношения CS, особенно группы 10% CS @ PG и 15% CS @ PG, показали больший процент живых клеток, и этот процент был увеличен. с увеличением концентрации CS. Этот результат показал, что присутствие CS в нановолокнах способствует поддержанию жизнеспособности клеток [32].

Жизнеспособность клеток HAEC на каркасах CS @ PG. а Планшет для культивирования тканей (TCP), b PG, c 5% CS @ PG, d 10% CS @ PG, e 15% CS @ PG, f Процент количества живых / мертвых клеток в различных нановолоконных каркасах, n =3

Поведение клеточной адгезии на нановолокнах

Нанофиброзные каркасы с хорошей биосовместимостью считаются основным требованием для образования кровеносных сосудов. PCL с хорошей биоразлагаемостью и природный Gt с превосходной биосовместимостью широко использовались в тканевой инженерии с различными структурами, включая гидрогели, электропряденые нановолокна и трехмерные каркасы [21, 33, 34]. Морфологию НАЭК на композитных нановолокнах и взаимодействии клеток с материалами через 24 часа наблюдали с помощью флуоресцентного микроскопа. Плотность клеток 10% CS @ PG и 15% CS @ PG была статистически значимой, чем PG и 5% CS @ PG, что указывает на то, что добавление CS на более высоком уровне способствует адгезии клеток. Как показано на фиг. 8c, площадь отдельной ячейки 5% CS @ PG и 15% CS @ PG была больше, чем у других групп нановолокон. Однако удлинение клеток 10% CS @ PG было значительно выше, чем PG, 5% CS @ PG и 15% CS @ PG (фиг. 8d). Этот результат можно объяснить тем, что добавление CS в концентрации 10% может способствовать распространению HAEC. Было обнаружено, что HAEC могут прилипать, распространяться и хорошо расти на композитных нановолокнах, особенно на 10% CS @ PG и 15% CS @ PG. Таким образом, эти два нановолоконных материала можно рассматривать как безопасный и многообещающий сосудистый материал-кандидат для клинического применения.

а Морфология адгезии клеток HAEC на каркасах CS @ PG (DAPI:ядра клеток; родамин-фаллоидин:цитоскелет). б Плотность клеток. c Площадь одной ячейки, d Удлинение клеток в разных группах нановолокон

Размножение клеток

Рост и жизнеспособность клеток на нановолокнах CS @ PG исследовали in vitro с помощью флуоресцентного микроскопа и теста CCK-8 (рис. 9a – c). В качестве положительного контроля был выбран каркас из электропряденого PG. Результаты анализа CCK-8 для различных нановолоконных пленок показаны на рис. 9c. Через 2, 4, 6 дней культивирования клеток количество клеток увеличивалось со временем культивирования для всех групп. На 6 день значение OD нановолокон 10% CS @ PG было значительно выше, чем у каркаса PG. Сравнение пролиферации клеток 5% CS @ PG, 10% CS @ PG и 15% CS @ PG показало, что скорость пролиферации клеток увеличивалась по мере присутствия CS в композитных нановолокнах в определенном диапазоне. Однако на способность к пролиферации клеток также влияла морфология поверхности нановолоконных материалов. Поскольку нановолокно 15% CS @ PG демонстрирует высокую вязкость из-за более высокого отношения CS в растворе полимера для электроспиннинга, это может повлиять на пролиферацию клеток.

а HAEC пролиферировали на нановолокнах, обнаруженных при окрашивании клеток в течение 2, 6 дней, b Плотность клеток на нановолоконных каркасах через 2, 6 дней, n =3, * p <0,05, c Анализ CCK-8 после культивирования HAEC на нановолокнах PG и CS @ PG через 2, 4, 6 дней

Выводы

Таким образом, биомиметические композитные нановолокна CS @ PG были успешно изготовлены с использованием технологии электропрядения. Изменения морфологии и диаметра волокон были получены путем варьирования концентраций CS в нановолокнах PG. Нановолокна CS @ PG обладали соответствующей пористостью (~ 80%) и абсорбцией раствора PBS (до 650%). Включение CS в нановолокна PG значительно улучшило их антикоагулянтные свойства, продлило время их коагуляции и усилило клеточные ответы. В частности, 10% нановолокон CS @ PG демонстрируют благоприятную клеточную адгезию, удлинение и пролиферацию. Следовательно, композитные нановолокна PG, включенные с определенным количеством CS, ингибируют антитромбогенность и усиливают ответы эндотелиальных клеток, что может быть разработано как многообещающий каркас тканевой инженерии для восстановления и регенерации кровеносных сосудов.

Доступность данных и материалов

Все данные, полученные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в эту статью.