Разработка pH-чувствительных липосом, содержащих наночастицы аптамер-золото, инкапсулирующих морен для лечения рака

Введение

Одна из наиболее распространенных причин смерти [1], рак, может привести к значительным экономическим потерям и ущербу для людей. Значительные усилия были направлены на разработку умных лекарств для лечения рака [2]. Благодаря своей способности защищать лекарственные средства до тех пор, пока они не достигнут целевого участка, полимерные наночастицы потенциально могут улучшить доставку терапевтических лекарств [3]. Чтобы гарантировать доставку терапевтического агента к активному центру, используются высокореактивные наночастицы. Такие наночастицы могут быть сконструированы таким образом, чтобы их свойства материала изменялись под действием различных биологических стимулов. Реактивные наночастицы создаются с использованием различных стимулов, включая внешние стимулы (например, температура и свет) и биологические стимулы (например, pH или окислительно-восстановительные условия). НЧ, реагирующие на pH, привлекли внимание исследователей из-за изменений pH после эндоцитоза наночастиц. Материалы, которые реагируют на pH, также привлекают внимание, потому что функция реагирования на pH может быть легко интегрирована в ряд полимерных структур для создания набора наночастиц, которые реагируют на pH. Наночастицы могут реагировать на pH изменением химического состава поверхности, изменением размера или формы частиц, а также разложением или высвобождением веществ. Это изменение свойств наночастиц можно использовать для регулирования клеточного поглощения и контролируемого высвобождения. Таким образом, чувствительные к pH наночастицы представляют собой мощную стратегию для создания терапевтических систем доставки.

Морин гидрат (3,5,7,2 ', 4'-пентагидроксифлавон) (рис. 1) - природное активное вещество, выделенное из китайских лекарственных трав или растений [4]. Это соединение прогестерона и вторичный метаболит фенола в растениях. Морин широко распространен в природе и обладает хорошими антиоксидантными, противораковыми [5] и значительными противовоспалительными эффектами. Потенциал Morin для различных применений вызвал значительный интерес [6], но такой потенциал значительно ограничен низкой растворимостью в воде и биодоступностью вещества [7].

Химическая структура гидрата Морина

Липосомы (полые), состоящие, среди прочего, из лецитина и церамида, имеют двухслойную структуру, состоящую из молекул амфифильных липидов [8]. Липосомы обеспечивают желаемые свойства, такие как биосовместимость, функциональность, снижение побочных эффектов и способность инкапсулировать большие количества лекарства [9, 10]. Они могут эффективно переносить гидрофильные и гидрофобные агенты и защищать их от внешних условий, успешно транспортируя их в целевые области тканей [11]. Повышенная эффективность включена в дизайн для облегчения инициируемого pH высвобождения противоопухолевого материала в интерстиции опухоли через pH-чувствительные липосомы [12,13,14,15]. Эти чувствительные к pH липосомы представляют собой специальные липосомы, которые выделяют лекарство в тканевой среде и быстро дестабилизируют в кислой среде, такой как эндосомы раковой ткани [16,17,18].

Для повышения селективности и эффективности лечения опухолей необходимо модифицировать pH-чувствительные липосомы для формирования нацеленных на опухоль наночастиц [19]. Недавно были разработаны ДНК-аптамеры в качестве высокоселективных и чувствительных сенсоров для биочувствительности и визуализации, а также в качестве потенциальных агентов для лечения рака [20]. Одноцепочечный ДНК-аптамер AS1411, как было показано, действует как химиотерапевтический агент из-за его высокой аффинности связывания с ядрами раковых клеток [21]. Этот аптамер (Apt) был объединен с Au NP для изготовления двухкомпонентной наноконструкции из Apt-нагруженных Au NP, которые могут взаимодействовать с ядрами раковых клеток. Некоторые исследования также продемонстрировали, что создание гибридов липосома-наночастица может предоставить богатый инструментарий для создания таких многофункциональных модальностей [22]. Гибридная липосома-везикулярная система Au NP, состоящая из катионных липосом и Au NP, была разработана для улучшения проникновения лекарственного средства в интерстиций опухоли и усиления противоопухолевой активности [23, 24].

Наночастицы золота (Au NP) считаются хорошими носителями лекарств и могут быть модифицированы биологически родственными молекулами для повышения специфичности, направленной на рак [25]. С модификацией поверхности Au NP, аптамер сульфгидрильной группы может быть использован для модификации поверхности Au NP, на которую может нацеливаться ковалентная связь Au-S, и соответствующая сульфгидрильная группа на поверхности нанозолота может быть присоединена к поверхность нанозолота [26]. С инженерной и прикладной точки зрения связанные с лигандами золотые наноматериалы представляют собой мощную платформу для облегчения целевой идентификации, обнаружения и лечения.

В текущем исследовании мы использовали pH-чувствительные липосомы, инкапсулирующие морин, и собранный Au-Apt, который был модифицирован на поверхности липосом (Apt-Au @ MSL, рис. 3a). Морин, который характеризуется низкой растворимостью в воде и биодоступностью, был преобразован. Были охарактеризованы морфология, размер и другие свойства приготовленного Apt-Au @ MSL. Новая наночастица показала противоопухолевые свойства и высокую противораковую активность. Противораковая активность Apt-Au @ MSL была исследована in vitro и in vivo (рис. 2).

Предлагаемая схематическая диаграмма разработанного нами Apt-Au @ MSL, содержащего морин, для доставки лекарств в раковые клетки со свойством нацеливания на опухоль.

Материалы и методы

Материалы

L-α-фосфатидилхолин (PC), холестерин (Chol), холестерилгемисукцинат (CHEMS), морин (≥ 99,99%), цитрат натрия (99,9%), HAuCl ₄ · 3H ₂ О (≥ 99,9%), поливинилпирролидон (ПВП, 40 000 мас.), NaOH (≥ 98,0%) и HCl (37%) были закуплены у Sigma-Aldrich Chemical Co. (США). Аптамер AS1411 с дисульфидной модификацией был синтезирован TaKaRa (Далянь, Китай) со следующей последовательностью:5'-HS-T- (C6-S-S-C6) -TTG GTG GTG GTG GTT GTG GTG GTG GTG G-3 '. Бромид тиазолилового синего тетразолия (МТТ), иодид пропидия (PI), кальцеин и аннексин V Alexa Fluor 488 были приобретены у Sigma-Aldrich Chemical. Все водные растворы готовили на бидистиллированной воде. Все остальные реагенты были наилучшими из имеющихся на рынке.

Синтез наночастиц золота

До 1 мл HAuCl ₄ · 4H ₂ О (1%) растворяли в 25 мл воды Milli-Q (pH =5,5), и к раствору добавляли 50 мг ПВП. Полученный раствор выливали в трехгорлую колбу (150 мл) и обрабатывали микроволновым (МВ) облучением в течение 5 мин при механическом перемешивании. Затем к раствору быстро добавляли 1,5 мл раствора цитрата натрия (1%) и подвергали МВ-облучению в течение 3 мин. Раствор собирали центрифугированием при 10000 об / мин в течение 5 мин.

Синтез наночастиц Apt-Au

Дисульфидная связь аптамеров была расщеплена с использованием трис (2-карбоксиэтил) фосфина. Через 30 мин раствор аптамера (100 мкл, 100 мкМ) добавляли к 10 мл 5 нМ раствора НЧ Au, а затем инкубировали в течение 24 ч для образования НЧ Au-Apt. Через 1 день мы дважды посолили раствор 2,5 мл 500 мМ раствора NaCl с интервалом 4 часа [27].

Приготовление липосом, чувствительных к pH

Липосомы, состоящие из яичного PC, CHEMS и Chol при молярном соотношении 33:13:5 и 5% морина, получали гидратацией пленки. Яичный ПК, CHEMS, Chol и 2 мг морина растворяли в 8 мл CHCl ₃ . , и органические растворители удаляли при 40 ° C с помощью роторного испарителя. Для липосом Morin полученную тонкую липидную пленку гидратировали с использованием 2% (мас. / Об.) PBS, а затем обрабатывали ультразвуком с помощью зонда на ледяной бане в течение 15 мин. Конечная липосома была синтезирована и стабилизирована в коллоидной системе. Для pH-чувствительных липосом Apt-Au @ Morin (Apt-Au @ MSL) липидную пленку гидратировали 475 мкг / мл НЧ Au-Apt в 5% декстрозе с последующей обработкой ультразвуком [23].

Характеристика

Были проведены ультрафиолетовая – видимая спектроскопия (UV – Vis, S-3100 Photodiode Array, Scinco Co., Ltd., Корея) и инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (FT – IR) (Nicolet iS50, США, Thermo Fisher Scientific). Морфологию Apt-Au @ MSL исследовали с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ, HT7700, Tokyo Japan, Hitachi). Процент высвобождения морина определяли с помощью УФ-видимой спектроскопии. Морфологию липосом Morin и Apt-Au @ MSL также наблюдали с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM, S-4800, Hitachi, Япония). Измерения динамического рассеяния света (DLS) и дзета-потенциала использовались для характеристики оптических свойств и размеров липосом Morin и Apt-Au @ MSL на анализаторе потенциала Brookhaven ZetaPALS.

Культура клеток

Линии раковых клеток человека, SGC-7901, BGC-823, A549, HeLa, MCF-7 и Hs68, были приобретены из Американской коллекции типовых культур (ATCC) и сохранены в RPMI с 10% фетальной бычьей сывороткой при 37 ° C и 5% CO ₂ .

Исследование противораковой активности in vitro

SGC-7901, BGC-823, A549, HeLa, MCF-7 и Hs68 высевали на 96-луночные планшеты (2,0 × 10 ³ клеток / лунку), а затем культивировали с Apt-Au @ MSL при различных концентрациях (0, 5, 10, 15, 20 и 30 мкг / мл). НЧ Au и Morin были отнесены к контрольным группам. Пустая группа состояла из необработанных клеток. 96-луночные планшеты инкубировали в увлажненном инкубаторе. После инкубации в каждую лунку добавляли 9,6 мл раствора МТТ (5 мг / мл) и дополнительно инкубировали в течение 2 часов. Каждую группу тестировали в трех экземплярах, и IC ₅₀ Значения были получены из средних значений OD трех тестов в зависимости от кривых концентрации лекарственного средства. Яркость каждой группы была получена с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии [28].

Адгезию клеток контролировали с помощью электронной системы считывания клеток в реальном времени (RT-CES; ACEA Biosciences, Inc.) каждые 10 мин в течение 75 часов. Для определения клеточной адгезии каждую лунку в планшете засевали клетками (1,0 × 10 ⁴ клеток / лунку) со свежей средой до конечного объема 200 мкл, а затем инкубировали в растворе Apt-Au @ MSL при различных концентрациях (10, 20 и 30 мкг / мл) в течение 10 часов после инкубации в течение 12 часов [29] . Бланк группа состояла из необработанных клеток, а контрольные группы состояли из групп Morin и Morin – липосомы.

Флуоресцентная микроскопия

Клетки SGC-7901 выращивали в 48-луночных планшетах в течение ночи при 37 ° C, 5% CO ₂ . . Затем клетки обрабатывали растворами Apt-Au @ MSL (10 и 30 мкг / мл) при различных концентрациях в течение 12 часов. Контрольные группы состояли из липосомных групп Морена и Морена. Впоследствии среда была удалена. Пустая группа состояла из необработанных клеток. Клетки промывали PBS трижды. Клетки окрашивали и затем измеряли совместным окрашиванием живых и мертвых клеток (анализ LIVE / DEAD). После совместного окрашивания кальцеином-AM / PI в течение 30 минут клетки дважды промывали PBS для удаления избытка красителя, и флуоресцентные изображения получали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) (для кальцеина-AM, Ex =488 нм). и Em =515 нм; PI Ex =535 нм и Em =615 нм [30]).

Анализ апоптотической гибели клеток

Для измерения противоопухолевых эффектов Apt-Au @ MSL каждую лунку шестилуночного планшета засевали клетками SGC-7901 (1,0 × 10 ⁵ клеток / лунку), а затем инкубировали в растворах Apt-Au @ MSL при различных концентрациях (5, 10, 20 и 30 мкг / мл) в течение 12 часов. Бланк группа состояла из необработанных клеток, а контрольные группы состояли из групп Morin и Morin – липосомы. После обработки клетки собирали и дважды промывали PBS. Клетки окрашивали PI и аннексином V – FITC, а затем анализировали с помощью анализатора CytoFLEX (Beckman Coulter) (для PI, Ex =535 нм и Em =615 нм; Annexin V – FITC, Ex =488 нм и Em =525 нм. ) [31].

Исследования по разрушению стен

Для изучения разрушения клеточной стенки в противораковом анализе клетки SGC-7901 выращивали в шестилуночных планшетах при 37 ° C и 5% CO ₂ . Клетки, культивированные без материала, использовали в качестве контрольной группы. После культивирования клеток с Apt-Au @ MSL при различных концентрациях (5, 10, 20 и 30 мкг / мл) в течение 12 ч их обрабатывали 0,25% раствором трипсина-ЭДТА. Все клетки (включая плавающие в среде) собирали при 2000 об / мин в течение 5 мин. Затем собранные клетки фиксировали в 2,5% растворе глутарового диальдегида в течение 4 часов [32]. Фиксированные клетки дегидратировали в серии градиентов ацетона в течение 20 мин. В конечном итоге ячейки были подвергнуты серии процедур, установлены на медных решетках и обследованы с помощью ТЕМ (HT-7700, Hitachi, Япония).

Вестерн-блоттинг

Экспрессию белка в клетках SGC-7901 определяли с помощью вестерн-блоттинга. Клетки SGC-7901 (4,0 × 105 клеток / лунку) инокулировали на 9-сантиметровом культуральном планшете и 20 мкг / мл Apt-Au @ MSL в течение 1, 6, 12 и 24 часов. Клетки собирали после обработки и суспендировали в буфере для лизиса клеток на льду в течение 1 часа. Смесь помещали в центрифугу при 11000 g . при 4 ° C в течение 10 мин и собирали супернатант, содержащий общий клеточный белок. Концентрацию общего белка в супернатанте определяли методом BCA. Затем белок ресуспендировали в загрузочном буфере и кипятили при 100 ° C в течение 10 минут. Образцы, содержащие равные количества белка (40 мкг / дорожку), подвергали SDS-PAGE (10% трициновые гели). Затем их переносили на нитроцеллюлозные (NC) мембраны при 100 В в течение 1,5 часов и блокировали с использованием 5% обезжиренного молока в трис-буферном солевом растворе с 0,1% твин-20 (TBST) в течение 1 часа. Затем NC-мембрану инкубировали с первичными антителами и вторыми антителами соответственно. Полосы целевого белка визуализировали на мембране с использованием реагентов для детекции вестерн-блоттинга ECL. β-актин использовали в качестве внутреннего контроля равной нагрузки и переноса белков. Экспрессия белков была количественно определена с помощью программного обеспечения Quantity-One, и уровень экспрессии был помечен под полосой [33].

Модель животного

Самцов голых мышей BALB / c (~ 17 г) покупали в Исследовательском центре модельных животных Нанкинского университета и разводили в аксенической среде (животные, свободные от специфических патогенов). Модели опухолей были созданы путем подкожной инъекции клеточной суспензии (клетки SGC-7901, 100 мкл, 1 × 10 ⁶ / мл) в плечо голых мышей. Яркие изображения опухоли были получены через 15 дней после подкожной инъекции опухолевых клеток. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Центром лабораторных животных Аньхойского сельскохозяйственного университета (номер разрешения:SYXK 2016-007). Штангенциркуль использовали для определения максимального продольного диаметра (длины) и максимального поперечного диаметра (ширины) каждой опухоли. Затем рассчитывали объем опухоли по формуле длина × ширина ² . × 0,5 [34].

Исследование противораковых заболеваний in vivo

Последующие тесты были выполнены, когда объем опухоли достиг 50 мм ³ . Мышей, произвольно разделенных на пять групп, подвергали следующим внутривенным инъекциям:PBS (100 мкл), Morin, Morin – липосомы, Au-Apt и Apt-Au @ MSL. Мышам вводили внутривенно в хвост в дозе 2 мг / кг материала для лечения. Размеры опухолей мышей измеряли через 24 дня. Также определяли массу тела и выживаемость мышей. Мышей умерщвляли, и ткани опухолей и органов мышей собирали для окрашивания H&E [35, 36].

После блокирования и пермеабилизации слайды с опухолями промывали PBS, окрашивали с помощью анализа TUNEL и подвергали контрастному окрашиванию DAPI. Флуоресцентные изображения были получены с помощью CLSM. Для визуализации DAPI Ex =358 нм и Em =461 нм, а для анализа TUNEL Ex =450–500 нм и Em =515–565 нм [37].

Анализ для оценки токсичности

Чтобы оценить токсичность обработки Apt-Au @ MSL для жизненно важных органов, мышей в четырех группах обработки умерщвляли через 30 дней. Важные органы (печень, селезенка, почки, сердце, легкие и опухоли) мышей из всех групп были собраны и окрашены H&E. Также были собраны образцы крови и измерен уровень глюкозы в крови. Кроме того, определяли вес мышей [38].

Результаты и обсуждение

Характеристика

Настоящее исследование направлено на разработку новой липосомы, которая обладает преимуществами наночастиц (Apt-нагруженные НЧ Au) и может быть эффективно использована в качестве противоракового агента. Основные свойства новых липосом важны для проведения дальнейших исследований. Apt-Au @ MSL был синтезирован, как описано в предыдущем исследовании [23], с небольшими модификациями, а затем охарактеризован с использованием различных методов (рис. 3). На рис. 3б представлены результаты УФ – видимой спектроскопии, которые показывают характерный пик и позволяют отслеживать образование НЧ Au. Характерные пики наблюдались в УФ-видимом спектре наночастиц Au примерно при 530 нм. В частности, анализ УФ-видимых спектров показал сильное УФ-поглощение, на которое влияла модификация поверхности Apt. Наблюдались те же результаты. Характерные пики были смещены после того, как pH-чувствительные липосомы были покрыты морином. Характерный пик изготовленного Apt-Au @ MSL располагался при 362 и 550 нм. Эти результаты показали, что синтез был успешно завершен. Для дальнейшей характеристики была проведена ИК-Фурье спектроскопия для проверки результатов синтеза. Характерный сдвиг пиков в красный цвет для Morin – липосом и Apt-Au @ MSL дополнительно указывает на успешную модификацию Morin (рис. 3c). Мы выполнили анализ высвобождения морина в PBS при различных уровнях pH, чтобы определить pH-чувствительность Apt-Au @ MSL. Эти три значения pH моделируют нейтральную среду кровообращения, умеренно кислую среду опухоли и кислую среду внутриклеточного тела. Процент высвобождения морина определяли с помощью УФ-видимой спектроскопии. При pH 5,0 около 54% ​​морина высвобождалось в течение 24 часов, и непрерывное высвобождение наблюдалось в следующие 96 часов; Между тем, при pH 7,4 только около 10% морина высвобождалось в течение 24 часов. Эти результаты показывают, что Apt-Au @ MSL проявляет хорошую стабильность в нормальных физиологических условиях, предотвращая утечку лекарственного средства; однако лекарство быстро высвобождается в ядерном теле. Такое поведение высвобождения лекарственного средства может эффективно улучшить эффект лечения (рис. 3d). ПЭМ и СЭМ были проведены для выяснения структур липосом и Apt-Au @ MSL (рис. 3f). Просвечивающая электронная микроскопия была проведена для выяснения структуры AuNP. Как показано на фиг. 3g, AuNPs имеют размер частиц около 10 нм, что согласуется с размером модификации липосом (фиг. 3g). Результаты SEM на фиг. 3e показывают, что сырые липосомы образуют только однослойные везикулы с неоднородным диаметром около 120 нм, что согласуется с размером, определенным с помощью DLS. Напротив, Apt-Au @ MSL показывает, что морфология гибридных везикул приписывается модификации Au-Apt. Диаметр 150 нм также соответствовал размеру, определенному DLS (рис. 3i). Примечательно, что исследование взаимодействий между pH-чувствительными липосомами и Au-Apt с помощью TEM показало, что Au NPs ассоциированы почти исключительно с везикулярным липидным бислоем и локализованы на периферии везикул (Fig. 3h). Измерения ζ-потенциала представлены на рис. 3j, а дзета-потенциалы Au NPs и Au-Apt отрицательны. Результат показывает, что как Au NP (-57,1 ± 0,3 мВ), так и Au-Apt имеют отрицательный заряд (-31,7 ± 0,2 мВ). Apt-Au @ MSL был модифицирован положительно заряженными липосомами Morin, и потенциал изменился до 36,4 ± 0,3 мВ. Адсорбция положительного и отрицательного заряда - это механизм связывания липосом Au-Apt и Morin. Кроме того, на рис. 3k показано изменение скорости инкапсуляции частицы во времени, что указывает на стабильность частицы в течение определенного периода времени. Как показано на фиг. 3k, скорость инкапсуляции частицы практически не изменяется в течение 24 часов, что указывает на то, что частица демонстрирует хорошую стабильность в течение определенного периода времени. Стандартная кривая концентрации морина в зависимости от поглощения морина в УФ-видимой области была подготовлена ​​для изучения скорости инкапсуляции морина-липосомы и Apt-Au @ MSL. Результаты показали, что эффективность захвата Morin – липосом и Apt-Au @ MSL может достигать 90,2% и 89,6%, как показано в Таблице S1 и Рис. S1

Характеризация изображений. а Схематическое изображение синтеза Apt-Au @ MSL. б Ультрафиолетовые спектры поглощения морина, НЧ Au, Au-Apt, Morin – липосомы и Apt-Au @ MSL. c ИК-Фурье спектрометры Морина, Морина-липосом и Apt-Au @ MSL. г Характеристики высвобождения морина из Apt-Au @ MSL при различных условиях pH. е СЭМ-изображение Morin – липосомы. е СЭМ-изображение Apt-Au @ MSL. г ПЭМ-изображение НЧ Au. ч ПЭМ-изображение Apt-Au @ MSL. я Диаметры Morin – липосомы и Apt-Au @ MSL определяли не менее трех раз с помощью DLS. j ζ-потенциал наночастиц Au, Apt-Au и Apt-Au @ MSL. к Степень эффективности захвата (EE%) Morin – липосомы и Apt-Au @ MSL

Тест противораковой активности Apt-Au @ MSL

In Vitro

Морин проявляет превосходную противоопухолевую активность, но имеет низкую биодоступность из-за низкой растворимости в воде. После того, как Morin был инкапсулирован pH-чувствительными липосомами и преобразован в водорастворимый материал, поверхность липосом была модифицирована с использованием Au-Apt для получения целевого противоопухолевого эффекта. На фигуре 4а показана противоопухолевая активность Apt-Au @ MSL по данным МТТ-анализа in vitro. Концентрация лекарства определяется концентрацией морина. Группа, получавшая Morin, не показала явной противоопухолевой активности по сравнению с пустой группой. Однако группа, получавшая морин, инкапсулированный рН-чувствительными липосомами, проявила повышенную противораковую активность. Результат предполагает, что противоопухолевая активность липосом Morin превосходила активность сырого Morin. Одновременно мы обнаружили улучшение противоопухолевой активности липосом, модифицированных Apt (Apt-Au @ MSL). В таблице 1 перечислены ИС ₅₀ значения Morin, Morin – липосомы, Apt-Au @ MSL и цисплатина. Morin, Morin – липосомы и Apt-Au @ MSL проявляют широкий спектр противораковой активности в отношении опухолевых клеток. Они продемонстрировали явное предпочтение клеткам SGC-7901 с высокой эффективностью и низкой токсичностью по отношению к нормальным клеткам человека. IC ₅₀ значение Apt-Au @ MSL составляло 15,6 ± 1,5 мкг / мл для клеток SGC-7901. Эти результаты были дополнительно подтверждены тестированием RTCA. Клетки SGC-7901 культивировали с Apt-Au @ MSL при различных концентрациях; контрольную группу обрабатывали PBS, а контрольную группу составляли липосомы Morin и Morin. Адгезию и распространение контролировали с помощью iCELLigence (рис. 4b). Результаты во многом были аналогичны результатам, полученным при тестировании МТТ. Противоопухолевая активность Apt-Au @ MSL была значительно выше, чем у Morin и Morin – липосом. Apt-Au @ MSL может ингибировать пролиферацию клеток SGC-7901 с увеличением концентрации. Изменения морфологии клеток после обработки Apt-Au @ MSL также наблюдали с помощью флуоресцентной микроскопии. Как показано на фиг. 4c, клетки SGC-7901 без Apt-Au @ MSL поддерживают структурную целостность клетки. Напротив, целостность клеток нарушается после обработки клеток Apt-Au @ MSL в различных концентрациях.

а Жизнеспособность клеток SGC-7901, инкубированных с различным материалом (Morin, Au-Apt, Morin-liposome и Apt-Au @ MSL) в разных концентрациях (0, 5, 10, 15, 20 и 30 мкг / мл). Клетка, обработанная PBS, была обозначена как пустая группа. б Кривую пролиферации клеток SGC-7901 детектировали с помощью системы RT-CES. Различные соединения добавляли через 10 часов. Концентрации a , b , и c представляют собой разные Apt-Au @ MSL (10, 20 и 30 мкг / мл) соответственно. c Яркие изображения клеток при различных концентрациях (0, 2,5, 5, 10, 20 и 30 мкг / мл)

Анализ апоптотической гибели клеток

Количественный анализ апоптоза проводили методом проточной цитометрии с окрашиванием аннексином-FITC. Клетки окрашивали PI и аннексином V – FITC, а затем анализировали с помощью проточного цитометра CytoFLEX (Beckman Coulter). Аннексин V использовали для обнаружения клеток с ранним апоптозом, связанных с экспонированным фосфатидилсерином, а мечение PI использовали для окрашивания клеток с поздним апоптозом. Коэффициент апоптоза составлял 1,57% для холостых групп. Клетки, обработанные Морином, показали коэффициент апоптоза 3,51%. Apt-Au @ MSL при различных концентрациях проявлял более высокую индуцирующую способность с коэффициентами апоптоза 7,44%, 10,75%, 15,53% и 40,77% (рис. 5). Усиленный апоптоз также подтвердил выдающуюся противораковую активность, индуцированную Apt-Au @ MSL. Коэффициент апоптоза клеток SGC-7901 увеличивался с увеличением концентрации Apt-Au @ MSL.

Анализ проточной цитометрии на основе окрашивания аннексином V-FITC / PI апоптоза SGC-7901 после лечения различными методами. Концентрация а , b , c , и d составляет 5, 10, 20 и 30 мкг / мл соответственно

Исследование противоопухолевой активности с помощью флуоресцентного анализа

Противоопухолевый эффект на клетки SGC-7901, индуцированный Apt-Au @ MSL, интуитивно оценивали с помощью флуоресцентных анализов LIVE / DEAD. После инкубации клеток с Morin, Morin – липосомами и Apt-Au @ MSL в различных концентрациях их совместно окрашивали набором LIVE / DEAD в течение 30 мин в темноте. На фиг. 6 клетки в пустой группе показывают, что все клетки с зеленой флуоресценцией представляют собой живые клетки. Контрольные группы, включающие Morin и Morin – липосомы, показывают количество красных флуоресцентных клеток. Однако клетки, обработанные Apt-Au @ MSL в различной концентрации, явно проявляли большое количество апоптотических клеток. С увеличением концентрации количество живых клеток постепенно уменьшалось. Преимущественно увеличивался процент погибших клеток, а плотность клеток снижалась. Результат подтвердил, что Apt-Au @ MSL может эффективно способствовать апоптозу опухоли.

Флуоресцентные микроскопические изображения SGC-7901, инкубированного с различной концентрацией Apt-Au @ MSL и последующим кратковременным окрашиванием. Пустая группа представляла собой PBS. Липосомы Morin и Morin были выбраны в качестве контрольной группы

Исследование целостности ячейки

Чтобы подтвердить влияние поглощения и транспорта Apt-Au @ MSL в клетку SGC-7901, мы провели анализ ТЕА. Изменение морфологии клеток наблюдали с помощью ПЭМ. ПЭМ-изображения были получены для наблюдения за внутренней структурой клеток и определения противоопухолевых механизмов. Как показано на фиг. 7, пустые изображения клеток SGC-7901 без обработки показали значительные изменения в морфологии и внешнем виде прозрачных клеточных стенок. В контрольной группе (Morin и Morin – липосомы) морфология клеток показала частичное повреждение, и ядерная область сократилась. Однако значительные изменения клеточной стенки и внутренней структуры также наблюдались после воздействия Apt-Au @ MSL. Цитоплазма протекла, и структура ядра стала неясной. Многие клеточные фрагменты образовывались вокруг полых клеток. Кроме того, клеточные стенки распадались или разрушались. Целые профили стали нечеткими, клетки были повреждены, цитоплазма протекла. Красными стрелками обозначена область Au NP. As the concentration of the Apt-Au@MSL increased, more Au NP regions appeared in the nucleus. This occurrence suggested the release of Morin after Apt-Au@MSL entered the cell interior, hence the appearance of a large amount of Au NPs. These aforementioned results suggest that antitumor activity was associated with compromised cell integrity and nuclear structure.

TEM images of SGC-7901 cells treated with different concentration of Apt-Au-MSL (10, 20, and 30 μg/mL). The blank group was PBS. The Morin and Morin–liposome were set as control group. The red square is the enlarge area. The red arrow point to Au NPs

Molecular Mechanism Induced by Apt-Au@MSL

To explore the molecular mechanism of Apt-Au@MSL-induced apoptosis, we detected the expression levels of caspases and PARP. Activation of caspase-3, -8, and -9 was first detected with specific substrates. As shown in Fig. 8a, Apt-Au@MSL treatment induces dose-dependent activation of caspase-3, -8, and -9. Caspase-9 promotes mitochondria-mediated apoptosis more than does caspase-8, indicating that the mitochondria-mediated apoptosis signaling pathway is dominant. Western blot analysis further confirmed the existence of Apt-Au@MSL-induced apoptosis at the protein level. Figures 8b and c show that after cells are treated with Apt-Au@MSL, activation of caspases and cleavage of PARP shows time and dose dependence (Figs. 8b, c). In Fig. 8d, e, the Western blot analysis confirmed our results. In conclusion, Apt-Au@MSL inhibits the growth of SGC-7901 cells mainly by inducing apoptosis.

Apt-Au@MSL induced apoptosis in SGC-7901 cells. а SGC-7901 cells were treated with indicated concentrations of Apt-Au@MSL for 24 h. Then, the total protein was extracted and incubated with synthetic Apt-Au@MSL substrates for measuring caspase activities. Dose-dependent (b ) and time-dependent (c ) effects of Apt-Au@MSL on PARP and caspases expression. г , e Quantitative analysis of PARP, caspase-7, caspase-9, and caspase-3 expressions. Data are means ± SD, *P <0,05, ** P  < 0.01

Apt-Au@MSL Inhibits Tumor Growth

In Vivo

The in vivo antitumor activities of Apt-Au@MSL were evaluated using an SGC-7901 tumor xenograft model. A comparison of the images of the tumors with those of the control group (Morin and Morin–liposomes) showed that mice treated with Apt-Au@MSL markedly reduced the weight and size of the tumor (Fig. 9a). The relative tumor volume curves and the mice weight curves indicate that the Apt-Au@MSL in vivo exhibits a higher anticancer efficiency (Fig. 9b) than those of the other treatment groups. No significant difference in average tumor volume was indicated between the control group (Morin and Morin–liposomes) and the blank group. The tumor volume of the Apt-Au@MSL group was only nearly a tenth of the blank group and nearly a sixth of the control group. The result indicated that raw Morin and Morin–liposomes at 40 mg/kg exerted no effect on the growth rate of tumors. However, Apt-Au@MSL could inhibit tumor growth. The body weight of mice in the different groups (PBS, Morin, Morin–liposomes, and Au-Apt groups) showed no marked fluctuation (Fig. 9c) during the treatment period. This result suggested that the treatment was tolerated and caused no acute side effects. Notably, we found that the mice with Apt-Au@MSL treatment showed markedly prolonged survival (Fig. 9d). The surviving mice in this group behaved normally, showing no apparent sign of unhealthy condition. These results demonstrated that the administration of Apt-Au@MSL could inhibit tumor growth in xenograft mouse models.

а In vivo applications of Apt-Au@MSL and photographs of the mice tumor taken 24 days. A dosage of 2 mg/kg was administrated intravenously for all mice (n = 6–8). б Tumor weight of mice in different groups after 24 days. c Tumor volume index for the different treatment groups. The tumor sizes were measured at the indicated time points. г Survival rate of the mice in different group after tumor inoculation. Data are means ± SD (n  = 6-8). The intravenous injection of PBS was set as blank group (100 μL); the treated by Morin and Morin–liposome were set as control group. In vivo therapeutic effects of Apt-Au@MSL in SGC-7901-bearing mice. Data are means ± SD, *P <0,05, ** P  < 0.01

Histological Analysis of Anticancer Activity

H&E staining of tumor tissue and organ samples was conducted after fixation and treatment. Treatment efficacy with respect to tumor cell death was also evaluated by H&E staining of tumor tissue from different groups. In Fig. 10a, the mice treated with Au-Apt, Morin, and Morin–liposomes show the same extent of thermal damage as that of the mice in the blank group. No apparent apoptosis was observed in the blank group. The tumor tissue sections consisted of tightly packed tumor cells. However, Apt-Au@MSL treatment exhibited the most significant damage to the tumor tissue, with moderate cell apoptosis in the tumor. The result suggested anticancer activity in the mouse models treated with Apt-Au@MSL. To further investigate the ratio of apoptotic cells in tumors tissue in vivo, TUNEL assay was performed for the detection of apoptotic cells. As shown in Fig. 10b, the apoptotic cells in tumors can be stained with green fluorescence to indicate apoptosis. The merged images show fewer green fluorescent regions in the blank group and the control group (Morin and Au-Apt), indicating the presence of fewer apoptotic cells. The cells of the mice treated with Morin–liposomes appear partly apoptotic. Moreover, a large number of green fluorescent regions were observed in the group treated with Apt-Au@MSL, indicating a large amount of apoptotic cells. The results were consistent with that of H&E staining, confirming that Apt-Au@MSL can promote tumor apoptosis in vivo.

а H&E staining analysis of the tumors in mice. Histological analysis of the tumors in mice following different treatments as PBS, Morin, Morin–liposome, Au-Apt, and Apt-Au@MSL group. б Apoptotic cells were detected by a TUNEL assay (green) and co-stained by nuclear staining DAPI (blue)

In Vivo Toxicity Evaluation

The potential in vivo toxicity is often a significant concern for the clinical application of anticancer medicine. To verify the applicability of Apt-Au@MSL in vivo, the mice were evaluated under different treatments (Morin, Morin–liposomes, Au-Apt, and Apt-Au@MSL). Blood biochemical assays were also conducted to examine possible changes in the biochemistry of mice after treatment. As shown in Fig. 11a, the blood glucose index for blood function of the Apt-Au@MSL groups was similar to those of the blank and control groups. No difference in body weight was found in each group. A steady increase was observed, indicating that the drug exhibited no toxicity (Fig. 11b). H&E staining of organ sections (Fig. 11c) showed no sign of damage or inflammation in the group treated with Apt-Au@MSL, compared with the blank and control group. This finding indicated that PBS, Morin, Morin–liposomes, Au-Apt, and Apt-Au@MSL were negligible side effects in vivo. These results, as well those of H&E staining, further indicate safety in the use of Apt-Au@MSL for tumor treatment.

In vivo toxicity evaluation. а Blood glucose data detected in the mouse toxicity model. б Weight of mice in different groups after 24 days. c Images of H&E-stained major organs. Each value represents the mean ± SD (n =3)

Conclusions

In conclusion, this study presents the synthesis of an antitumor nanomaterial, Apt-Au@MSL. Apt-Au@MSL exhibited excellent monodispersity and tumor-targeting properties. The polarity of Morin was modified, and the antitumor activity was enhanced. The pH of the solution was 5.0, and the release rate of Morin from Apt-Au@MSL was the maximum in the characterization experiments. Apt-Au@MSL showed that the morphology of hybrid vesicles was attributable to Au-Apt modification. The diameter of 150 nm was consistent with the size determined by DLS. We screened our model cancer cell by MTT assay and found that SGC-7901 cells could effectively suppress proliferation. IC ₅₀ of Apt-Au@MSL was 15.6 ± 1.5 μg/mL for the SGC-7901 cells. Fluorescent flow cytometric assays confirmed that Apt-Au@MSL could be used as an effective anticancer material and induced apoptosis in vitro. The Apt-Au@MSL found in the internal cell, as shown in the TEM images, suggested that Apt-Au@MSL could target the cancer cell. The administration of Apt-Au@MSL could inhibit tumor growth in xenograft mouse models, as determined from tumor weight testing. H&E staining and TUNEL assay further confirmed that Apt-Au@MSL could promote tumor apoptosis in vivo. Both blood biochemistry testing and H&E staining suggested that these materials exhibit negligible acute toxicity and good biocompatibility in vivo.

Доступность данных и материалов

The authors declare that the materials, data, and associated protocols are promptly available to the readers without undue qualifications in material transfer agreements. All data generated and analyzed during this study are included in this article.

Сокращения

Apt:

Aptamers

Apt-Au:

Aptamers and Au nanoparticle

MSL:

Morin pH-sensitive liposome

AuNP:

Наночастицы золота

ROS:

Reactive oxygen species

Apt-Au@MSL:

Aptamers and Au nanoparticle-modified Morin pH-sensitive liposome

ПК:

L-α-Phosphatidylcholine

Chol:

Cholesterol

CHEMS:

Cholesteryl hemisuccinate

PVP:

Поливинилпирролидон

PI:

Иодид пропидия

FT–IR:

Fourier-transform infrared spectroscopy

UV–Vis:

Ultraviolet–visible spectroscopy

ТЕМ:

Просвечивающая электронная микроскопия

SEM:

Сканирующая электронная микроскопия

DLS:

Динамическое рассеяние света

PDI:

Индекс полидисперсности

ATCC:

American Type Culture Collection

CLSM:

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

TUNEL:

TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling

H&E staining:

Hematoxylin-eosin staining

RTCA:

Real-time unlabeled cell analysis