Многомодовые биоразлагаемые наночастицы, чувствительные к микроокружению опухоли, для прицельной визуализации рака груди

Введение

В клинической практике микропузырьки в основном используются в качестве контрастных агентов для ультразвука для получения изображений различных органов и кровеносных сосудов в реальном времени [1,2,3]. Традиционные ультразвуковые контрастные вещества обычно состоят из таких материалов, как липиды или белки, которые содержат воздух или перфторуглеродные газы. Инкапсулированные в микросферы газы обладают низкой стабильностью в крови и коротким периодом полураспада из-за быстрой диффузии микропузырьковых дефектов [4,5,6]. Более того, поскольку размер частиц наполненных газом микропузырьков обычно велик (приблизительно от 1 до 8 мкм), микропузырькам трудно проникнуть в среду опухоли хозяина за счет экстравазации ткани. Таким образом, текущее применение пузырьков микронного размера для внутрисосудистой визуализации ограничено [7]. Идеальные контрастные вещества для ультразвука, как правило, должны иметь оптимальный размер для транспортировки через сосудистое пространство тканей, адекватную продолжительность акустического эффекта, хорошее прицеливание и биосовместимость, а также легкое выведение из организма [8, 9]. Концепция «газообразующих наночастиц» была предложена в предшествующих исследованиях, и такие наночастицы могут быть использованы в ультразвуковой контрастной визуализации [10,11,12]. Эти газообразующие наночастицы превосходят нынешние газонаполненные микропузырьки по своим характеристикам, а непрерывно генерируемый газ позволяет получать интенсивное ультразвуковое изображение. Генерирующие газ наночастицы могут улучшать проникновение и удерживание, они могут стабильно циркулировать в крови и эффективно накапливаться в опухолевой ткани [13, 14].

По-прежнему остается проблемой обнаружение крошечных и скрытых опухолей с помощью традиционных методов визуализации, таких как магнитно-резонансная томография (МРТ), компьютерная томография (КТ) и ультразвук, которые ограничены длительным временем сбора данных, высокой дозой облучения и низкой чувствительностью [15 , 16]. Необходимо объединить различные методы визуализации и разработать мультимодальную технологию визуализации для достижения синергетического эффекта для раннего выявления рака [17,18,19]. Суперпарамагнитный оксид железа (Fe ₃ О ₄ ) наночастицы могут быть использованы в качестве контрастных агентов для отрицательной МРТ при Т2-взвешенной визуализации [20, 21]. Fe ₃ О ₄ имеет привлекательные общие свойства, включая малый размер частиц, сильную проницаемость, высокую намагниченность, хороший метаболизм и относительно низкую токсичность [22, 23]. Fe ₃ О ₄ контрастные вещества для МРТ-диагностики ранней стадии рака широко изучаются из-за их высокой релаксации и контрастности [24,25,26]. Кроме того, флуоресцентная визуализация в реальном времени имеет отличное разрешение и может быть ценным методом для определения стадии опухоли, управления резекцией опухоли и мониторинга эффектов лечения [27, 28].

В данном случае эти наночастицы в основном инкапсулированы сополимер молочно-гликолевой кислоты (PLGA), одобренной Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) для использования в качестве материала для биосаждений [29, 30]. Частицы PLGA модифицированы пептидом RGD для связывания с интегрином αvβ3 на поверхности клеток рака груди и с Cy5.5 в качестве флуоресцентного красителя для визуализации in vivo, и они инкапсулируются с помощью Fe ₃ О ₄ действовать как Т2-отрицательный контрастный агент при МРТ (Схема 1а). Из-за повышенного уровня гликолиза в опухолевой ткани, который может производить больше молочной кислоты и протонов во внеклеточной среде, pH опухолевых тканей (6,8-7,2) ниже, чем у нормальных тканей (pH 7,4) [31,32,33] . Таким образом, мы разработали карбонат натрия (Na ₂ CO ₃ ) в PLGA для производства CO ₂ пузыри при более низком pH опухолевых тканей для ультразвуковой визуализации. Чтобы подтвердить их многообещающее применение в визуализации опухолей, были систематически охарактеризованы комплексные свойства этих многомодовых наночастиц для визуализации in vitro, включая их цитотоксичность, специфичность нацеливания и биораспределение в опухолевой ткани, с помощью трех режимов визуализации.

а Принципиальные схемы функции в Fe ₃ О ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD NPs посредством целевого накопления в опухоли и генерации CO ₂ пузыри в кислых тканях опухоли с последующей трехмодальной МР / УЗ / ФИ визуализацией рака груди. б Схематическое изображение получения Fe ₃ О ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD NPs.

Результаты и обсуждение

Синтез и характеристика Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ О ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NP

Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ О ₄ НЧ @ PLGA / Cy5.5 / RGD были разработаны как многомодовые контрастные агенты, нацеленные на RGD, путем инкапсуляции биосовместимого полимера PLGA с Fe ₃ О ₄ и Na ₂ CO ₃ и агент, нацеленный на интегрин, через биоразлагаемую химическую связь (Схема 1b).

Изображения, полученные с помощью просвечивающей электронной микроскопии, показали, что Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ О ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD НЧ представляли собой прозрачные сферы с однородно диспергированными частицами оксида железа, видимыми в оболочке (рис. 1а). Средний гидродинамический размер наночастиц был определен как 117,6 нм с помощью динамического светорассеяния, а средний показатель полидисперсности составил 0,234 (рис. 1b). Поверхностный заряд наночастиц был подтвержден измерениями дзета-потенциала и составил -21,7 мВ (рис. 1c). Измерение спектра флуоресценции показало, что Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ О ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD имел максимальную длину волны излучения при 685 нм, что указывает на то, что Cy5.5 был успешно инкапсулирован в ядро ​​PLGA (рис. 1d). Значения намагниченности насыщения для Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ О ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD и бесплатный Fe ₃ О ₄ НЧ составили 32,6 и 42,5 ЭМЕ / г соответственно (рис. 1д). Эти данные свидетельствуют о суперпарамагнитных характеристиках наночастиц при комнатной температуре. Спектр FITR Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ О ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD показал, что валентное колебание N-H и пик поглощения –OH появляются около 3432 см ^-1 . Кроме того, мы обнаружили увеличение (1628 см ⁻¹ ) валентного колебания C =O. По сравнению с нецелевыми НЧ, характеристический пик (карбоксил) при 1735 см ^-1 целевых НП было значительно сокращено. Результаты показали связь между карбоксильной группой на поверхности микросферы и аминогруппой на пептиде RGD. Связывание Na ₂ in vitro CO ₃ / Fe ₃ О ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs показаны на рис. 1f.

Изображения TEM ( a ) Распределение размеров ( b ) Дзета-потенциал ( c ) Fe ₃ О ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD НЧ. г Спектр излучения флуоресценции Fe ₃ О ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD и Fe ₃ О ₄ / Na ₂ CO ₃ @ НЧ PLGA / cRGD. е Кривые магнитного гистерезиса Fe ₃ О ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD НЧ и Fe ₃ О ₄ НП. е ИК-Фурье спектров целевого Fe ₃ О ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD и нецелевые НЧ PLGA

Связывание in vitro НЧ Na2CO3/Fe3O4@PLGA/Cy5.5/RGD

Интегрин αvβ3 обычно сильно экспрессируется на эндотелиальных клетках опухоли рака молочной железы и может способствовать метастазированию опухоли [33,34,35,36]. Клеточная иммунофлуоресценция для экспрессии интегрина v в клетках MDA-MB-231 была намного выше, чем в клетках MCF-7; Клетки A549 служили положительным контролем (рис. 2а). Поглощение НЧ клетками изучали с помощью CLSM (рис. 2b). На ₂ CO ₃ / Fe ₃ О ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs показали гораздо более высокую скорость связывания с клетками MD-MB-231, чем нецелевые NP. Флуоресцентные изображения также показали, что Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ О ₄ НЧ @ PLGA / Cy5.5 / RGD связывались с цитоплазмой клетки, и объединенные изображения показали те же места, что и экспрессия интегрина αv [37, 38].

а Конфокальные флуоресцентные изображения с экспрессией интегрина αv на клетках MB231, A549 и Mcf-7. Синий и зеленый представляют собой флуоресценцию DAPI и αv соответственно. б Конфокальные флуоресцентные изображения клеток MB231, инкубированных с целевым Fe ₃ О ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD НЧ и нецелевые НЧ. Синий, красный и зеленый представляют собой флуоресценцию DAPI, Cy5.5 и α v соответственно. c Относительная жизнеспособность клеток MB231, инкубированных с различными концентрациями Fe ₃ О ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD НЧ

Анализ цитотоксичности

Цитотоксичность Na ₂ in vitro CO ₃ / Fe ₃ О ₄ НЧ @ PLGA / Cy5.5 / RGD оценивали в клетках MDA-MB-231 с использованием анализа CCK8, тогда как клетки A549 и MCF-7, обработанные НЧ, использовали в качестве контроля (фиг. 2c). В диапазоне концентраций Fe 5–80 мкг / мл жизнеспособность клеток A549 и MB231 существенно не снижалась, и обе они были выше 70%. Напротив, клетки MCF-7 показали значительное снижение жизнеспособности клеток примерно до 50% при концентрациях Fe выше 40 мкг / мл. Результаты CCK8 показали, что Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ О ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs показали значительно более низкую цитотоксичность в клетках MDA-MB-231 в заданном диапазоне концентраций.

Контрастное изображение in vitro

Мы использовали фантом из агарового геля для изучения эффективности Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ О ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD НЧ in vitro при различных значениях pH (рис. 3а). На ультразвуковых контрастных изображениях Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ О ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD НЧ были значительно усилены при слабокислом pH (pH 6,8) по сравнению с pH 7,2, вероятно, потому что pH 7,2 не производит достаточного количества CO ₂ пузыри для ультразвуковой визуализации. Напротив, когда НЧ находились в слабокислой среде, могло образоваться достаточно пузырьков для ультразвуковой визуализации. Эта характеристика актуальна для опухолей, которые демонстрируют высокую тканевую неоднородность и различные уровни pH (pH 6,8–7,2) in vivo [32, 39, 40]. Затем была проанализирована интенсивность сигнала ультразвукового изображения (рис. 3b). Соотношения интенсивности сигналов групп нецелевых NP (pH =7), нецелевых NP (PH =5), целевых NP (PH =7) и целевых групп NP (PH =5) относительно интенсивности сигнала группы пустая группа составляла 112%, 145%, 167% и 178 ± 4% соответственно, что ясно указывает на то, что целевая группа NP (PH =5) имела самый сильный сигнал УЗИ.

а Ультразвуковые изображения НЧ-мишени и НЧ-мишени, записанные при различных значениях pH (7,2 и 6,8), PBS в качестве контроля. б Уровень интенсивности сигнала рассчитывается по образцу / бланку, образец представляет собой интенсивность эхо-сигнала целевых и нецелевых NP, а пустой бланк представляет собой интенсивность эхо-сигнала PBS. c Т2-взвешенные МРТ-изображения Fe ₃ О ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD НЧ с разной концентрацией Fe (0,0625, 0,125, 0,25, 0,5 и 1 мМ). г Поперечные относительности (r2) составляли 19,597 мМ ⁻¹ . s ⁻¹ для Fe ₃ О ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD НЧ

Для исследования МРТ in vitro, поскольку концентрация Fe в Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ О ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs увеличились, интенсивность T2-взвешенного сигнала показала значительное снижение, что указывает на возможность использования этих NP в качестве контрастных агентов T2 MR (рис. 3c). Скорость поперечной релаксации (r2) Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ О ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs были рассчитаны как 19,597 мМ ^-1 s ⁻¹ . Хотя скорость поперечной релаксации (r2) Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ О ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs ниже, чем у многих других суперпарамагнитных агентов МРТ, состав Fe ₃ О ₄ может увеличить r2, которое было в 2,94 раза выше, чем r2 частиц SPIO, используемых в клинической практике.

Ультразвуковая контрастная визуализация Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ О ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NP

Чтобы продемонстрировать потенциал Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ О ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs для ультразвуковой визуализации опухолей, мы ввели инъекцию Na ₂ в хвостовую вену CO ₃ / Fe ₃ О ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs ксенотрансплантату рака молочной железы голым мышам и контролировали ультразвуковые изображения как функцию времени (фиг. 4a). Перед инъекцией были записаны изображения опухоли, печени и подкожной области. Сразу после инъекции в области опухолевых тканей не наблюдалось увеличения контрастности. Увеличение площади опухоли наблюдалось через 30 мин после инъекции и длилось 90 мин. Результаты ультразвукового исследования in vivo показали, что Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ О ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs генерировали достаточно пузырей в кислых тканях опухоли, чтобы обеспечить эхогенную отражательную способность для ультразвуковой визуализации. В качестве контроля мы также получили изображения печени и подкожных тканей в разное время после инъекции целевых НЧ. В течение периода наблюдения не было обнаружено значительного улучшения в области подкожной инъекции, а улучшение в печени, которое со временем уменьшалось, было значительно ниже, чем в опухолях (рис. 4b). Этот результат показывает, что Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ О ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD НЧ, циркулирующие в организме при физиологическом pH, не производят значительного количества CO ₂ пузырьки для увеличения контраста ультразвука.

а Ультразвуковое исследование in vivo опухолей, печени и подкожных областей в разное время после инъекции Fe ₃ О ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD НЧ. б Интенсивность эхо-сигнала как функция времени рассчитывается по ткани / холостому сигналу, ткань представляет собой интенсивность эхосигнала опухоли, печени или подкожной области, пробел представляет собой интенсивность эхо-сигнала перед инъекцией

МРТ Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ О ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NP

Для МРТ in vivo, чтобы продемонстрировать, что НЧ можно использовать для визуализации опухолей, Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ О ₄ НЧ @ PLGA / Cy5.5 / RGD вводили непосредственно в опухоли и мышцы. Результаты показали, что в области опухоли наблюдалось значительное уменьшение контраста T2-MR после инъекции целевых НЧ, а интенсивность сигнала значительно снизилась с 8875 через 0 минут до 5972 через 120 минут после инъекции (рис. 5a, b). Однако при том же количестве введенных наночастиц область подкожных мышц показала гораздо меньшее снижение сигнала Т2. Это открытие демонстрирует эффективность Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ О ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD НЧ с контрастными агентами T2-MR, нацеленными на сверхчувствительный интегрин, для использования в визуализации, нацеленной на опухоль. В группе инъекции в хвостовую вену визуализация T2-MR также показала очевидное уменьшение контрастности опухоли через 24 часа после инъекции, демонстрируя высокое накопление в опухоли Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ О ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD НЧ (рис. 5в, г). Более того, в печени и почках наблюдались пониженные сигналы Т2, что указывает на то, что ионы железа в НЧ могут быстро выводиться из организма. Таким образом, МРТ показала, что Fe ₃ в оболочке из PLGA О ₄ Наночастицы демонстрируют эффективное пассивное нацеливание на опухоль за счет эффекта повышенной проницаемости и удерживания (EPR), особенно нацеливания, опосредованного RGD, но могут разлагаться и быстро выводиться in vivo.

а Т2-МРТ in vivo нормальных и опухолевых подкожных тканей до и после инъекции Fe ₃ О ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD НЧ. б Средняя интенсивность сигнала в мышце и опухоли для инъекции Fe ₃ О ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD НЧ. c Т2-МР-изображения аксиальной и коронарной областей мышей с опухолью MDA-MB-231 до и после внутривенной инъекции Fe ₃ О ₄ / Na ₂ CO ₃ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD НЧ. г Отношение интенсивности сигнала рассчитывается по ткани / мышце, ткань обозначает интенсивность сигнала опухоли, печени и почки до и после инъекции целевых НЧ, мышца обозначает интенсивность сигнала мышцы одновременно

Флуоресцентная визуализация и гистология

Двести микролитров НЧ вводили мышам внутривенно для визуализации флуоресценции in vivo. В группе, которым вводили НЧ, нацеленные на RGD, сигнал флуоресценции Cy5.5 постепенно увеличивался в области опухоли и достиг пика через 4 часа после инъекции, что указывает на то, что Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ О ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs могут эффективно накапливаться в опухоли. В нецелевой группе НЧ распределялись по телу после инъекции и быстро выводились, и они не накапливались в опухоли в течение длительного периода времени (рис. 6а). Затем мышей препарировали, и основные органы и опухоли собирали для флуоресцентной визуализации in vitro, которая показывала высокое поглощение опухолью целевых НЧ (фиг. 6b, c). Интенсивность флуоресценции Cy5.5 в опухолях мышей, которым вводили целевые НЧ, была в 1,5 раза выше, чем у мышей, которым вводили нецелевые НЧ.

а Флуоресцентная флуоресцентная визуализация in vivo животных через 0, 0,5, 1, 2 и 3 часа после инъекции после инъекции целевых и нецелевых НЧ. b Флуоресцентные изображения Ex vivo опухолей и основных органов (печень, селезенка, легкие, сердце и почки), полученные от животных. c Усредненная интенсивность флуоресценции различных органов и опухолей

Более того, опухолеспецифическое нацеливание Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ О ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs подтверждали с помощью флюоресцентной визуализации замороженных срезов опухоли (фиг. 7a). Иммунофлуоресцентное окрашивание срезов опухоли антителами против αv и β3 интегрина выявило значительную экспрессию интегрина αvβ3 в опухолевых тканях. Флуоресценция интегрина αv и β3 была объединена с флуоресценцией Cy5.5 Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ О ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs для получения иммуноокрашенного изображения, показывающего колокализацию. Результаты иммунофлуоресценции опухолевых тканей показали, что Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ О ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs специфически связываются с интегрином αvβ3 при злокачественном раке молочной железы MB231. Кроме того, окрашивание H&E Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ О ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs по сравнению с нецелевой группой показали, что все срезы тканей органа имели нормальную патологическую морфологию и отсутствие гистопатологической реакции на повреждение (фиг. 7b). Все результаты вышеуказанного цитотоксического и гистологического анализа показали, что Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ О ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs не вызывали значительной токсичности для тканей основных органов in vivo, и их хорошая биосовместимость с полным основанием может быть отнесена к PLGA.

а Флуоресцентная визуализация замороженных срезов опухоли MDA-MB-231 от мышей, которым вводили целевые и нецелевые НЧ. Зеленый, красный, фиолетовый и синий представляют собой флуоресценцию αv, β3, Cy5.5 и DAPI соответственно. б Окрашенные H и E срезы опухоли, полученные от мышей после инъекции целевых и нецелевых НЧ

Выводы

В заключение, приведенные выше результаты демонстрируют творческий и успешный подход к МРТ рака груди с помощью магнитного нацеливания и системы генерации газа, которая активируется в микросреде опухоли. Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ О ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD NPs демонстрируют превосходные характеристики визуализации и хорошую биосовместимость в режимах МРТ / УЗИ / флуоресцентной визуализации. Наша работа демонстрирует большой потенциал диагностики опухолей с помощью улучшенной мультимодальной визуализации.

Материалы и методы

Материалы

Совместно молочная и гликолевая кислота (PLGA) (лактид:гликолид =75:25, Mw =20000), краситель Cyanine5.5 и поливиниловый спирт (PVA) были приобретены у Sigma-Aldrich Company (Шанхай, Китай). Пептид RGD был индивидуально синтезирован GenicBio BioTech Co. Ltd. (Шанхай, Китай). Fe ₃ О ₄ наночастицы и карбонат натрия (Na ₂ CO ₃ ) были приобретены у Xian Ruixi Biological Technology Co. Ltd. (Хэнань, Китай). Дихлорметан (CH ₂ Cl ₂ ) и диметилсульфоксид (ДМСО) были получены от Solarbio Company (Пекин, Китай). Все химические вещества были аналитической чистоты.

Синтез наночастиц Fe3O4/Na2CO3@PLGA/Cy5.5/cRGD

Сначала смешивали 12,5 мг PLGA и 0,25 мл хлороформа. Затем 5 мкл Cy5.5, 15 мкл магнитных наночастиц, модифицированных олеиновой кислотой, диспергированных в хлороформе (OA @ Fe ₃ О ₄ , 10 мг / мл), 5 мкл карбоната натрия (Na ₂ CO ₃ ), последовательно добавляли 1,5 мл 1% раствора ПВС и эмульгировали с помощью ультразвукового процессора в течение 2 мин. Затем добавляли 12,5 мл 0,3% раствора ПВС и перемешивали в течение 3–4 ч при комнатной температуре и 12,5 мл 0,4% раствора ПВС добавляли для перемешивания (500 об / мин) в течение ночи для удаления остаточного органического растворителя. Вышеупомянутый раствор подвергали нескольким ультрафильтрационным промывкам с ddH ₂ . O, а затем разбавили буфером PB (pH =7,4) до конечного объема 1,25 мл. Затем к вышеуказанному смешанному раствору добавляли 0,25 мг EDC и 1,25 мг NHS. Смесь перемешивали в течение 30 мин при 25 ° C, а затем трижды промывали ультрафильтрацией и ресуспендировали в буферном растворе PB (pH =7,4). Затем к раствору добавляли 1,25 мг cRGD и перемешивали при 4 ° C в течение ночи. Для удаления EDC, NHS и любых остаточных cRGD прозрачный раствор фильтровали с помощью ультрафильтрационной трубки. Наконец, Fe ₃ О ₄ / Na ₂ CO ₃ НЧ @ PLGA / Cy5.5 / cRGD ресуспендировали в 1,25 мл деионизированной воды и хранили при 4 ° C.

Характеристика наночастиц

Динамические диаметры и дзета-потенциал наночастиц измеряли с помощью Zetasizer Nano-ZS (Malvern Instruments, UK). Морфология наночастиц была получена с помощью просвечивающего электронного микроскопа FEI Tecnai F20. Загрузка Cy5.5 регистрировалась флуоресцентным спектрометром Hitachi F-7000. FTIR выполняли с использованием инфракрасного спектрометра с преобразованием Фурье (Alpha II, Bruker, Швейцария). Магнитометр с вибрирующим образцом (VSM, Lake Shore 7410) применяли для определения кривой гистерезиса наночастиц и свободного Fe ₃ О ₄ .

Клетки и животные

Клетки рака груди человека MDA-MB-231 были любезно предоставлены Банком стволовых клеток Китайской академии наук. Клетки поддерживали при 37 ° C в 95% воздухе и 5% CO ₂ . . Самок мышей BALB / c (4 недели) были приобретены у Shanghai Slaccas Laboratory Animal Co. Ltd. и содержались в соответствии с протоколами, утвержденными Центром лабораторных животных Медицинского университета Гуанси. Эксперименты на животных сопровождались Руководством по уходу и использованию лабораторных животных, выпущенным Комитетом по этике животных Центра лабораторных животных Медицинского университета Гуанси. Клетки рака молочной железы MDA-MB-231 трансплантировали в правый бок мышей BALB / c (2 × 106 в 200 мкл клеток на мышь) и позволяли расти в течение 10–14 дней (средний диаметр 5 мм) перед визуализацией.

Клеточное выражение интегрина αv

Клеточную иммунофлуоресценцию проводили для подтверждения высокой экспрессии интегрина αv в клетках MDA-MB-231. Клетки A549 и MCF-7 использовали в качестве контроля. Клетки высевали в чашки для культивирования со стеклянным дном диаметром 35 мм (MatTek, США) в количестве 2 × 10 ⁴ . клеток мл ⁻¹ на 24 ч. После инкубации клетки фиксировали в течение 20 мин при комнатной температуре 4% параформальдегидом. Затем их инкубировали с кроличьими моноклональными антителами против интегрина αv (ab179475, Abcam) при 4 ° C в течение ночи и антителами против кроличьих IgG в течение 1 часа при комнатной температуре. Наконец, клетки окрашивали DAPI. Изображения были получены с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (TCS SP8, Leica, Германия).

Чтобы оценить эффективность нацеливания наночастиц, было проведено исследование клеточного поглощения с использованием конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM). Клетки высевали в чашки для культивирования со стеклянным дном диаметром 35 мм (MatTek, США) в количестве 2 × 10 ⁴ . клеток мл ⁻¹ на 24 ч. Затем клетки инкубировали с НЧ, нацеленными на RGD (30 мкг мл ^-1 0,5 мл) при pH 7,4 в течение 2 ч, а нецелевые НЧ использовали в качестве контроля. После инкубации клетки фиксировали 4% параформальдегидом в течение 20 мин, а затем инкубировали с αv-антителом. Посредством совместной локализации мы подтвердили целевое связывание наночастиц с интегрином на клетках.

Анализ CCK8

Биосовместимость Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ О ₄ Наночастицы @ PLGA / Cy5.5 / RGD оценивали с помощью исследования цитотоксичности. Клетки MDA-MB-231, A549 и MCF-7 высевали на 96-луночные планшеты в количестве 5 × 10 ³ . клеток мл ⁻¹ на 24 ч. Затем 0,1 мл Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ О ₄ Суспензию @ PLGA / Cy5.5 / RGD NP при концентрациях Fe 5, 10, 20, 40 и 80 мкг / мл добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 24 часов. Наконец, добавляли 10 мкл раствора CCK8, и суспензию инкубировали еще 1 час. Результаты определяли с помощью ридера для микропланшетов (Thermo Scientific, США) при 450 нм.

Ультразвуковое изображение с контрастным усилением

Ультразвуковое изображение наночастиц выполняли с помощью ультразвуковой системы Vevo 2100 (Fujifilm Visual Sonics Inc., Канада). RGD-нацеленные и нецелевые NP добавляли к модели агарозы, а PBS использовали в качестве контроля. Изображения были записаны в B-режиме и CEUS-режиме с различными буферами pH 7,2 и 6,8. Была нарисована интересующая область, и было измерено среднее значение серого на изображениях в B-режиме.

Для ультразвуковой визуализации in vivo мышей анестезировали 2% изофлураном (Hebei Yipin Pharmaceutical Co., Ltd., Китай), и температуру тела поддерживали на уровне 37 ° C с помощью грелки. Всего через хвостовую вену вводили 200 мкл НЧ, нацеленных на RGD. Контрольным животным вводили подкожно такое же количество НЧ. Ультразвуковые изображения были записаны с использованием преобразователя с частотой 7 МГц для непрерывного получения ультразвуковых изображений опухолей, печени и подкожных областей. Зона акустической фокусировки была помещена в центр опухоли с наибольшим поперечным сечением, и было получено поле обзора, содержащее опухоль и прилегающую к ней ткань.

Магнитно-резонансная томография

МРТ Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ О ₄ НЧ @ PLGA / Cy5.5 / RGD получали с использованием MR 3.0 T (GE Healthcare, США) и спирали для животных (RF TECH LIMITED, Китай). НЧ с различными концентрациями Fe 0,031, 0,063, 0,125, 0,25, 0,5 и 1 мМ сканировали в пробирках Эппендорфа объемом 1 мл, PBS использовали в качестве контроля. МРТ T2 выполнялась для каждой трубки с использованием T2-взвешенной последовательности FSE (толщина среза 3 мм, TR / TE 2000 / 74,4 мс, поле зрения 8 × 8 см и матрица 320 × 256). Релаксивность (r2) рассчитывалась путем линейной аппроксимации обратного времени релаксации как функции концентрации Fe.

Для МРТ in vivo мышей случайным образом разделили на две группы ( n =3) для магнитно-резонансного сканирования, получавшего либо (1) локальную инъекцию Na ₂ CO ₃ / Fe ₃ О ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD НЧ в подкожных мышцах и опухолевых тканях или (2) инъекция Na ₂ в хвостовую вену CO ₃ / Fe ₃ О ₄ @ PLGA / Cy5.5 / RGD НП. Базовые изображения мышей были сделаны перед инъекцией наночастиц. Для группы 1 такое же количество НЧ вводили в подкожные и опухолевые ткани, а МРТ-сканирование выполняли каждые 30 мин для регистрации передачи сигнала в тканях. Для второй группы визуализацию опухоли выполняли в аксиальном и корональном положениях, а параметры МРТ были такими же, как те, которые использовались для визуализации in vitro. Интенсивность сигнала (SI) в интересующей области (ROI) измерялась и сравнивалась с сигналами тканей в разное время до и после инъекции.

Визуализация флуоресценции опухоли

Для получения изображений флуоресценции in vivo использовали систему визуализации флуоресценции in vivo (FX PRO, Bruker, Швейцария) для сканирования, и мышей случайным образом разделили на две группы ( n =3):(1) НП, нацеленные на RGD, и (2) НП, не нацеленные на цель. Изображения получали каждые 30 минут в течение 4 часов после инъекции. Впоследствии важные органы и опухоли были собраны и визуализированы, и было изучено распределение флуоресценции в органах тела. Количественный анализ интенсивности флуоресценции проводили с использованием программного обеспечения молекулярной визуализации (Bruker, Швейцария). Затем эти важные органы подвергали окрашиванию H&E для оценки тканевой токсичности. Замороженные срезы опухоли также подвергали флуоресцентному иммуноокрашиванию антителами против интегрина αv и интегрина β3.

Доступность данных и материалов

Выводы, сделанные в этой рукописи, основаны на данных, которые все представлены и показаны в этой статье.

Сокращения

Cy5.5:

Сульфо-цианин5,5 сложный эфир NHS

DAPI:

4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол

EDC:

1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимид гидрохлорид

FSE:

Эхо быстрого вращения

MR:

Magnetic resonance

NHS:

N-гидроксисукцинимид

PB:

Phosphate buffer

PBS:

Физиологический раствор с фосфатным буфером

PEG:

Полиэтиленгликоль

PVA:

Поливиниловый спирт

RGD:

Arginine–glycine–aspartate

TE:

Echo time

TR:

Repetition time