Простой подход к приготовлению микросфер rGO @ Fe3O4 для магнитно-направленной и чувствительной к ближнему инфракрасному излучению комбинированной химиофотермической терапии

Введение

Рак - одно из самых злокачественных заболеваний в мире и основная причина смерти человека [1, 2]. Хотя химиотерапия широко используется в лечении рака в клинике, несколько ключевых проблем, включая низкую терапевтическую эффективность и обширные побочные эффекты, серьезно ограничивают ее применение [3]. Системы доставки лекарств (DDS) показали большие преимущества в увеличении растворимости, биодоступности и накопления опухолей лекарств, которые, как ожидается, значительно улучшат их противоопухолевую эффективность [4]. В последнее время полые микросферы, используемые в качестве систем доставки лекарств, привлекают все большее внимание из-за их большой площади поверхности и большого количества пористых структур [5,6,7,8], и несколько материалов с полыми микросферами были разработаны с использованием инновационных технологий [9,10,11] , 12,13].

Оксид графена (GO), новый тип неорганического материала без металла, широко исследовался в доставке лекарств из-за его уникальных свойств, таких как хорошая биосовместимость, низкая стоимость и простота приготовления [14,15,16,17]. Примечательно, что оксид графена может эффективно преобразовывать свет в тепло под действием БИК-излучения [18,19,20], что становится многообещающей стратегией для улучшения эффекта фототермической терапии рака. Группа Чен сообщила, что ГО может доставлять противораковые препараты за счет нековалентного взаимодействия, такого как π-π-укладка, водородная связь и электростатическая адсорбция [21]. Однако двумерный нанолист из оксида графена имеет тенденцию к агломерации из-за большой удельной поверхности, а также ван-дер-ваальсовых связей между слоями графена [17, 22], что приводит к плохой растворимости в воде и снижению способности загружать лекарство. Были изучены некоторые стратегии преодоления этих недостатков. Группа Tsukruk разработала полые капсулы из графена с использованием технологии послойной сборки [23], которая показала чрезвычайно высокую загрузку лекарственного средства по сравнению с другими материалами GO. Этому может способствовать высокая удельная поверхность и большой объем пор полой капсулы, стабилизированной GO. Однако в нескольких отчетах упоминается исследование GO с трехмерно-связанной структурой пор для доставки лекарств.

Хотя многие зарегистрированные системы доставки лекарств продемонстрировали превосходную способность к загрузке лекарств и поведение с контролируемым высвобождением лекарств, их доклинические исследования и применения также ограничены из-за недостаточной специфичности для нацеливания на опухолевые ткани [24]. Среди различных систем целевой доставки лекарств Fe ₃ О ₄ материал магнитной мишени широко используется в терапии рака из-за его высоких магнитных откликов, стабильного качества и легкости получения [25,26,27,28,29]. Группа Ni разработала Fe ₃ О ₄ @SiO ₂ Наночастицы со структурой ядро-оболочка с суперпарамагнитными свойствами для магнитного нацеливания опухолей [30]. Кроме того, Fe ₃ О ₄ заякоренные наночастицы GO хорошо изучены в сочетании с магнитной целевой доставкой и фототермической терапией [31,32,33,34].

В настоящем исследовании мы сообщаем о продвинутой стратегии разработки платформы DDS, содержащей полые микросферы rGO, украшенные оксидом железа (rGO @ Fe ₃ О ₄ ) для магнитно-направленной фототермической терапии (ФТТ), запускаемой в ближнем инфракрасном диапазоне. Как показано на схеме 1, rGO @ Fe ₃ О ₄ полые микросферы получали в три этапа. Во-первых, rGO-SiO ₂ синтезируется методом распылительной сушки с использованием SiO ₂ в качестве шаблона, а затем были получены полые микросферы rGO путем удаления SiO ₂ с ВЧ травлением. После этого Fe ₃ О ₄ наночастицы были закреплены на полых микросферах rGO для создания rGO @ Fe ₃ О ₄ микросферы. В этой системе rGO используется как агент PTT, запускаемый в ближнем инфракрасном диапазоне, а Fe ₃ О ₄ может предложить свойство магнитного нацеливания на ячейку Хелы. Доксорубицин (DOX), инкапсулированные микросферы (rGO @ Fe ₃ О ₄ / DOX), основанный на адсорбции пор и π-π-стопке, как ожидается, будет демонстрировать сверхвысокую нагрузочную способность лекарственного средства и поведение высвобождения лекарственного средства в зависимости от pH, а также может значительно усилить противораковый эффект при сочетании фототермической и химиотерапии.

Схематическое изображение rGO @ Fe ₃ О ₄ / Микросферы DOX и комбинированная фототермино-химиотерапия для подавления опухолей

Материалы и методы

Материалы

Гексагидрат хлорида железа (FeCl ₃ · H ₂ O), гидроксид натрия (NaOH) и гептагидрат сульфата железа (FeSO ₄ · 7H ₂ O) были приобретены в Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Клетки Hela получены из онкологической больницы Тяньцзиня. Солевой раствор с фосфатным буфером (PBS) _, Гидрохлорид доксорубицина (DOX · HCl), минимальная необходимая среда Дульбекко (DMEM), 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) и набор для подсчета клеток-8 (CCK-8) были приобретены у Solarbio Science and Technology Co. , ООО СиО ₂ (~ 300 нм) был приобретен у Shanghai Yuanjiang Chemical Company. Водный раствор деионоксида графена (2 мг / мл) был коммерчески доступным продуктом от Nanjing Xianfeng Company.

Подготовка rGO @ Fe ₃ О ₄ Микросферы

Полые графеновые микросферы были приготовлены методом распылительной сушки с использованием SiO ₂ (300 нм) в качестве шаблона. Вкратце, 100 мл SiO ₂ жидкая суспензия (50 мг мл ^-1 ) медленно по каплям добавляли в 300 мл водного раствора GO (2 мг мл ^-1 ) при сильном перемешивании смешанный раствор сушили распылением при 200 ° C в распылительной сушилке. Затем продукт выдерживали при 300 ° C под защитой Ar в течение 2 часов и rGO-SiO ₂ был получен. Чтобы удалить SiO ₂ , rGO-SiO ₂ помещали в раствор HF (10%) на 48 ч при 60 ° C. Твердый продукт промывали несколько раз и сушили в вакуумном сушильном шкафу при 60 ° C в течение 12 ч, в итоге был получен rGO с выходом 75%.

РГО @ Fe ₃ О ₄ Наночастицы получали методом соосаждения. В типичном процессе синтеза rGO @ Fe ₃ О ₄ наночастицы, 0,27 г FeCl ₃ · H ₂ O, 0,28 г FeSO ₄ · 7H ₂ O и 0,1 г полых микросфер rGO растворяли в 10 мл деионизированной воды и перемешивали в течение 30 мин при 50 ° C. Затем 60 мл NaOH (0,15 моль л ^-1 ) медленно добавляли при непрерывном перемешивании при 50 ° C в течение 12 часов. Наконец, продукты были разделены магнитным способом и несколько раз промыты деионизированной водой и этанолом с последующей сушкой при 60 ° C в вакууме в течение 12 часов.

Структурная характеристика

Размер и морфологию образца анализировали с помощью автоэмиссионной сканирующей электронной микроскопии (FE-SEM, Hitachi, S-4800) и просвечивающей электронной микроскопии (TEM, JEM2100F, JEOL). Состав продуктов анализировали с помощью системы дифракции рентгеновских лучей (XRD, D8 Focus, Cu Ka-излучение, Bruker, Германия) при скорости сканирования 12 ° / мин в диапазоне от 10 до 80 °. Также рентгеновскую фотоэлектронную спектроскопию (XPS) проводили на спектрометре XPS (Thermo Fisher Scientific, ESCALAB 250Xi, America). FTIR (FT-IR, AVATAR360, Nicolet) регистрировали от 500 до 4000 см ^-1 при разрешении 4 см ⁻¹ . Магнитные измерения проводились с использованием сверхпроводящего устройства квантовой интерференции (SQUID, Quantum Design MPMS) магнитометра при комнатной температуре (300 K). Спектры комбинационного рассеяния были получены с использованием рамановского спектроскопа (Renishaw, inVia Reflex, Англия) с лазером с длиной волны 532 нм. Содержание rGO оценивали с помощью термогравиметрического анализатора (TGA, TA Instruments-water LLC, SDTQ-600). Удельную поверхность измеряли с использованием метода Брунауэра-Эммета-Теллера (БЭТ). УФ-видимые спектры регистрировали с использованием анализатора нуклеиновых кислот / белков Beckman DU 800 (Beck-man Instruments, Inc., Rosemead, CA).

Загрузка и выпуск DOX

DOX, модельный химиотерапевтический препарат доксорубицин, был инкапсулирован в ядра rGO @ Fe ₃ О ₄ для оценки поведения загрузки и высвобождения противоопухолевых препаратов in vitro. rGO @ Fe ₃ О ₄ / DOX был подготовлен в соответствии с предыдущей ссылкой. Вкратце, 10 мл (0,2 мг мл ^-1 ) водного раствора DOX добавляли к 10 мг rGO @ Fe ₃ О ₄ раствора смесь гомогенизировали ультразвуком, чтобы избежать значительного осаждения. Затем смесь уравновешивали на возвратно-поступательном шейкере (SK-O180-Pro) при скорости 150 об / мин в течение 24 часов. После центрифугирования при 6000 об / мин в течение 10 мин выгруженный DOX был удален, супернатант rGO @ Fe ₃ О ₄ / DOX измеряли с помощью спектрофотометра UV-Vis для определения количества загруженного DOX. ОП DOX регистрировали при 490 нм, следующие уравнения использовались для расчета эффективности загрузки (LE) и емкости загрузки (LC) DOX:

Исследования высвобождения DOX in vitro проводили, помещая rGO @ Fe ₃ О ₄ / DOX (10 мг) в диализном мешке (MWCO =1000) с фосфатно-солевым буфером (PBS, 30 мл) при pH 5,4, 6,5 или 7,4, поместив его на водяную баню 37 ° C и встряхивая при 80 об / мин. Через заранее определенные интервалы собирали 3 мл высвобождающей среды и рассчитывали количество высвободившегося DOX путем измерения УФ-видимого излучения при 480 нм.

Фототермический эффект rGO @ Fe ₃ , запускаемый в ближнем инфракрасном диапазоне О ₄ Микросферы

Для отслеживания влияния rGO @ Fe ₃ О ₄ доза фототермического эффекта, инициируемого БИК, rGO @ Fe ₃ О ₄ растворы с различной концентрацией (0,0625, 0,125, 0,25, 0,5 и 1 мг / мл ⁻¹ ) облучали БИК-лазером при мощности 2 Вт / см ⁻² на 5 мин соответственно. Кроме того, влияние энергии ближнего ИК-диапазона на фототермический эффект было оценено путем облучения rGO @ Fe ₃ О ₄ (0,25 мг мл ^-1 ) с разной мощностью (1 Вт · см ⁻² , 1,5 Вт см ⁻² , 2 Вт см ⁻² ) в течение 5 мин. Температура в реальном времени измерялась с помощью инфракрасной тепловизионной камеры FLIR I5.

In Vitro Uptake

Клетки Hela высевали через 35 мм ² конфокальные тарелки плотностью 1 × 10 ⁵ ячеек / лунка. После инкубации в течение 24 часов в инкубаторе (5% CO ₂ , 37 ° C) среду удаляли и свежую среду, содержащую rGO @ Fe ₃ О ₄ / DOX микросферы и rGO @ Fe ₃ О ₄ / DOX с магнитом и культивировали еще 5 часов. РГО @ Fe ₃ О ₄ / Концентрация DOX составляла 0,1 мг / мл ^-1 . Затем клетки трижды промывали холодным PBS (pH =7,4) и фиксировали 4% раствором параформальдегида в течение 20 минут (CLSM, TCSSP5II, Leica, Ernst-Leitz-Strasse, Германия).

Анализы жизнеспособности клеток

Цитотоксичность этих микросфер оценивали с помощью анализа CCK-8 после обработки NIR. Клетки HeLa высевали на 96-луночные планшеты (5 × 10 ³ клеток / лунку) в 100 мкл среды и культивировали в 5% CO ₂ при 37 ° C в течение 24 часов. Для оценки биосовместимости:rGO @ Fe ₃ О ₄ были добавлены в лунку с диапазоном концентраций от 0,01 до 0,2 мг / мл ^-1 ; для однократной группы фототермической терапии, rGO @ Fe ₃ О ₄ добавляли в диапазоне концентраций от 0,01 до 0,2 мг / мл ^-1 , и применяя облучение ближним инфракрасным светом в течение 10 мин (2 Вт см ⁻² , 808 нм); для комбинированной группы фототермо-химиотерапии, rGO @ Fe ₃ О ₄ / DOX был добавлен с диапазоном концентраций rGO @ Fe ₃ О ₄ / DOX от 0,01 до 0,2 мг / мл ^-1 , и применяя освещение в ближнем инфракрасном диапазоне в течение 10 мин (2 Вт см ⁻² , 808 нм). Клетки инкубировали в течение 24 или 48 часов. После этого клетки промывали PBS и инкубировали в 100 мкл среды DMEM, содержащей 10 мкл раствора CCK-8, в течение еще 40 мин. Жизнеспособность определяли с помощью считывающего устройства для микропланшетов при длине волны 450 нм. Все эксперименты проводились в трех экземплярах.

Результаты и обсуждения

Характеристика синтеза и морфологии

Приготовление rGO @ Fe ₃ О ₄ микросфер был выполнен в три этапа. Во-первых, rGO-SiO ₂ микросферы были синтезированы методом распылительной сушки с использованием SiO ₂ как шаблон. Морфология rGO-SiO ₂ микросферы характеризовали с помощью SEM и TEM. Как показано на рис. 1а, rGO-SiO ₂ микросферы диаметром 3 мкм имели однородную сферическую форму и состояли из множества скученных SiO ₂ наночастицы (~ 300 нм). Данные ПЭМ и гидродинамический диаметр, измеренный методом динамического рассеяния света, также подтвердили результаты. (Рис. 1г, ж). Затем были получены полые микросферы rGO путем удаления SiO ₂ из rGO-SiO ₂ с нагревом до 300 ° С и травлением ВЧ. Очевидные поры с размером пор около 300 нм могут наблюдаться из-за SiO ₂ растворение (рис. 1б, д). Наконец, Fe ₃ О ₄ в силу магнитно-направленной способности декорировался на пористый жГО методом соосаждения. Наблюдение с помощью SEM и TEM показало, что заметное уменьшение размера пор после Fe ₃ О ₄ была получена загрузка (рис. 1c, f), обеспечивающая возможность доставки лекарственного средства и контролируемое высвобождение лекарственного средства. Примечательно, что размер частиц и гидродинамическое распределение по размерам rGO-SiO ₂ , rGO, rGO @ Fe ₃ О ₄ больше не имеют видимых изменений во время этих процедур (рис. 1g, h, i).

Морфологическая характеристика микросфер. СЭМ-изображения ( a ) rGO-SiO ₂ , ( b ) rGO, ( c ) rGO @ Fe ₃ О ₄ ; ПЭМ-изображения ( d ) rGO-SiO ₂ , ( e ) rGO, ( f ) rGO @ Fe ₃ О ₄ ; гидродинамическое распределение по размерам соответствующих образцов ( г ) rGO-SiO ₂ , ( ч ) rGO, ( i ) rGO @ Fe ₃ О ₄

Характеристика структуры и состава

Для дальнейшего подтверждения успешного приготовления rGO @ Fe ₃ О ₄ , SEM с EDS был использован для исследования структуры и состава микросфер. Изображения EDS rGO @ Fe ₃ О ₄ были охарактеризованы путем визуализации неупруго рассеянных электронов в окнах потерь энергии для элементарных O, Fe и C, а различные цветовые области представляют места, обогащенные O, Fe и C в реальных структурах, соответственно. Как показано на рис. 2а и б, Fe и O широко распространены в rGO @ Fe ₃ О ₄ микросферы с высокой плотностью загрузки. Рисунок 2d подтвердил, что Fe ₃ О ₄ наночастицы, равномерно диспергированные в rGO с диаметром около 18 нм, что приводит к резкому уменьшению размера пор в rGO @ Fe ₃ О ₄ микросферы. Выбранная диаграмма электронной дифракции (SAED) дополнительно подтвердила присутствие Fe ₃ О ₄ в rGO (рис. 2e) характеристический резонанс на расстоянии 2,98 нм, 2,53 нм, 2,09 нм, 1,62 нм и 1,49 нм, относящийся к плоскостям 220, 311, 400, 511 и 440 гранецентрированной кубической фаза Fe ₃ О ₄ , соответственно. Пики появляются при 220, 311, 400, 511 и 440, соответствующих Fe ₃ О ₄ также были обнаружены в спектрах XRD, что согласуется с результатами SAED (рис. 2c). Однако сообщается, что Fe ₃ О ₄ и γ-Fe ₂ О ₃ Невозможно было различить по рентгенограмме независимо для одного и того же местоположения характеристических пиков [35]. Результат XPS показал, что преобладающие пики при 725,9 / 724,5 эВ и 714,1 / 711,0 эВ, что соответствуют Fe2p _1/2 и Fe 2p _3/2 РГО @ Fe ₃ О ₄ (Рис. 2g, h) соответственно, что указывает на сосуществование Fe ³⁺ и Fe ²⁺ в Fe ₃ О ₄ [36]. Термогравиметрический анализ (ТГА) был проведен для мониторинга термического разложения rGO в rGO @ Fe ₃ О ₄ микросфер путем нагревания образца до 800 ° C и охлаждения до 100 ° C в атмосфере воздуха (рис. 2f). Кривая потери массы показала две отчетливые области потери массы, включая область дегидратации (40-300 ° C) и область удаления летучих (300-800 ° C) rGO в rGO @ Fe ₃ О ₄ , рассчитанное по образцу содержание углерода составило 25,6 мас.%.

Характеристики структуры и состава rGO @ Fe3O4. ( а , b ) СЭМ с картированием изображений ЭЦП rGO @ Fe ₃ О ₄ микросферы:элементы C, Fe и O; ( c ) Рентгенограммы rGO-SiO ₂ , rGO и rGO @ Fe ₃ О ₄ микросферы; ( д , e ) SEAD изображения rGO @ Fe ₃ О ₄ микросферы; ( е ) Кривые ТГ rGO @ Fe ₃ О ₄ микросферы; ( г , ч ) РФЭС спектры rGO @ Fe ₃ О ₄ микросферы; ( я ) Петли магнитного гистерезиса Fe ₃ О ₄ и rGO @ Fe ₃ О ₄ микросферы (на вставке вверху показаны значения коэрцитивного поля (Hc) образцов, а на вставке внизу показаны их суспензии до и после магнитной сепарации внешним магнитом)

Магнитные свойства rGO @ Fe ₃ О ₄ микросферы исследовались с помощью сверхпроводящего устройства квантовой интерференции. Магнитное поле проводилось в диапазоне сканирования от -20 000 до 20 000 Э при комнатной температуре. На рисунке 2i показаны значения намагниченности насыщения (Ms) и значения коэрцитивного поля (Hc) Fe ₃ . О ₄ равны 66,6 emu g ⁻¹ и 9,3 Э. После загрузки Fe ₃ О ₄ на rGO, значение Ms и значение Hc для rGO @ Fe ₃ О ₄ микросферы уменьшились до 33,9 emu g ^-1 и 7,44 Э. Заметное уменьшение магнитного насыщения может быть связано с диамагнитными свойствами rGO в rGO @ Fe ₃ О ₄ микросферы. Кроме того, избирательная агломерационная способность rGO @ Fe ₃ О ₄ микросфер был выполнен интуитивно с помощью эксперимента по магнитной сепарации. Суспензии Fe ₃ О ₄ и rGO @ Fe ₃ О ₄ микросферы помещали во флакон с внешним магнитом на 2 мин, суспензии можно было сконцентрировать в сторону магнита, и водный раствор стал прозрачным. Когда магнит убрали, rGO @ Fe ₃ О ₄ микросферы снова равномерно диспергировались после медленного встряхивания, что указывает на то, что rGO @ Fe ₃ О ₄ микросферы обладают хорошей способностью диспергировать в воде. Превосходная вододиспергирующая способность и свойство магнитного отклика позволили целенаправленно использовать rGO @ Fe ₃ . О ₄ как лекарство при лечении рака.

Анализ фототермического эффекта

Учитывая более глубокое проникновение в ткани и меньшее повреждение окружающих тканей NIR, для лечения опухолей часто применялась фототермическая терапия, чувствительная к NIR. Следовательно, поведение rGO @ Fe ₃ при фототермическом превращении О ₄ водные растворы с различной концентрацией и различной плотностью мощности регистрировали при облучении лазером NIR с длиной волны 808 нм в течение 5 мин. На рис. 3а, б показано, что повышение температуры rGO @ Fe ₃ О ₄ сильно зависел от концентрации и плотности мощности лазера. Когда концентрация микросфер была до 1 мг / мл ^-1 , температура повысилась с 27,9 до 70,3 ° C при облучении лазером NIR в течение 5 мин при мощности 2 Вт / см ⁻² . , в то время как температура для группы PBS только что поднялась с 31,7 до 36,2 ° C. Высокая эффективность фототермического преобразования rGO @ Fe ₃ О ₄ будет иметь большой потенциал для фототермической терапии опухолей, согласно предыдущему сообщению, что дегенерация белка и повреждение ДНК в клетке произойдет (произойдет) при воздействии 50 ° C в течение 4-6 минут [21, 37]. Для интуитивного отображения поведения фототермического преобразования rGO @ Fe ₃ О ₄ Была проведена ИК-термография, результаты показаны на рис. 4в. РГО @ Fe ₃ О ₄ раствор с концентрацией 1 мг / мл ⁻¹ быстро увеличилась до 70,3 ° C после облучения NIR в течение 5 мин, в то время как группа воды не имеет явных изменений, что согласуется с результатами термометрии. Кроме того, фототермическая стабильность rGO @ Fe ₃ О ₄ был изучен путем выполнения процедуры включения / выключения лазера с лазером 808 нм при 2 Вт см ⁻² за шесть циклов (рис. 3г). Было получено такое же повышение температуры, что указывает на прекрасную фототермическую стабильность в ближнем ИК-диапазоне rGO @ Fe ₃ О ₄ композиты. Эти результаты показали, что rGO @ Fe ₃ О ₄ микросферы имеют большие перспективы в качестве фототермического агента для фототермической терапии рака.

Фототермические эффекты rGO @ Fe3O4. а Изменение температуры rGO @ Fe ₃ в зависимости от концентрации О ₄ растворы с различной концентрацией (0,0625, 0,125, 0,25, 0,5 и 1 мг / мл ^-1 ) при облучении 808 нм при 2 Вт см ⁻² на 5 мин. б Температурный отклик в зависимости от мощности 0,25 мг / мл ^-1 rGO @ Fe ₃ О ₄ раствора под действием БИК-лазера с длиной волны 808 нм в течение 5 мин (1 Вт см ⁻² , 1,5 Вт см ⁻² , 2 Вт см ⁻² ). c Инфракрасные тепловые изображения rGO @ Fe ₃ О ₄ раствора с интервалами 0, 1, 2, 3, 4 и 5 минут, стимулированных при 808 нм (2 Вт см ^-2 ). г Повышение температуры rGO @ Fe ₃ О ₄ (0,25 мг мл ^-1 ) раствора в течение 6 последовательных циклов включения / выключения лазера при облучении 808 нм при 2 Вт / см ⁻²

Площадь поверхности и размер пор микросфер rGO @ Fe3O4, поведение при загрузке и высвобождении DOX. а Изотермы адсорбции-десорбции азота rGO @ Fe ₃ О ₄ . б Распределение пор по размерам rGO @ Fe ₃ О ₄ . c ИК-Фурье спектры rGO @ Fe ₃ О ₄ и rGO @ Fe ₃ О ₄ / DOX. г , e СЭМ и картографические изображения N, Fe и O rGO @ Fe ₃ О ₄ / DOX микросферы. е Кинетические кривые высвобождения лекарственного средства, полученные при различных значениях pH rGO @ Fe ₃ О ₄ микросферы. г Кинетические кривые высвобождения DOX в ближнем ИК-диапазоне

Загрузка и выдача лекарств

Площадь поверхности и размер пор rGO @ Fe ₃ О ₄ были оценены с помощью анализов BET и BJH (рис. 2а, б). N ₂ Кривая адсорбции-десорбции - изотермический тип IV, площадь поверхности и размер пор - 120,7 м ² г ⁻¹ , 2-8 нм и 1,012 см ³ г ⁻¹ , соответственно. Результаты показали, что rGO @ Fe ₃ О ₄ обладали мезопористыми каналами и средним распределением пор по размеру, демонстрируя большой потенциал для загрузки противоопухолевого лекарственного средства. Тогда rGO @ Fe ₃ О ₄ микросферы с пористой структурой служили для загрузки модельного химиотерапевтического препарата доксорубицина путем простого перемешивания и небольшой обработки ультразвуком. Анализ ATR-FTIR дополнительно подтвердил стабильное включение DOX в rGO @ Fe ₃ О ₄ из-за характерного резонанса -COOH и бензольных групп DOX при 1726 см ⁻¹ и 1618 см ⁻¹ (Рис. 4c). Наблюдение с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM) показало, что новые сигналы N элементов, приписываемые DOX, равномерно распределяются в микросфере после загрузки DOX (рис. 4d, e). Кроме того, эффективность загрузки DOX (LE) и грузоподъемность (LC) rGO @ Fe ₃ О ₄ / DOX составляли 92,15% и 18,43% соответственно. Значительно более высокие ЖК rGO @ Fe ₃ О ₄ / DOX, чем многие лекарственные носители, может иметь чрезвычайно большую площадь поверхности и размер пор [19]. Высокая УЭ rGO @ Fe ₃ О ₄ / DOX можно отнести к двум аспектам, первый из которых заключается в том, что rGO @ Fe ₃ О ₄ может взаимодействовать с DOX за счет сильного π – π-стэкинга между sp2-гибридизованными π-связями rGO @ Fe ₃ О ₄ и хининовая часть DOX [21], и еще одна может заключаться в том, что они могут образовывать водородную связь между карбоновой кислотой (–COOH), гидроксильными (–OH) группами rGO @ Fe ₃ О ₄ и амин (–NH ₂ ), гидроксильные (–ОН) группы DOX. Затем мы наблюдали за поведением высвобождения DOX в PBS при pH 7,4, 6,5 и 5,4, чтобы имитировать внеклеточную среду опухоли и нормальных тканей. Как показано на фиг. 4f, скорость высвобождения DOX увеличивалась, когда pH был отрегулирован с 7,4 до 5,4, а устойчивое высвобождение DOX при pH 5,4 может достигать 73% после 98-часовой обработки. Таким образом, совокупный профиль выпуска DOX из rGO @ Fe ₃ О ₄ проявляли pH-зависимый образ. Это ускоренное высвобождение в кислых условиях может быть связано с частичным протонированием гидроксильных и аминогрупп DOX, что приводит к более высокой растворимости лекарства и ослаблению водородных связей между DOX и графеном [38]. Кроме того, мы также изучили поведение высвобождения DOX в ответ на NIR in vitro. Как показано на рис. 4g, высвобождение DOX ускоряется NIR-излучением, и скорость высвобождения DOX достигает 85%. Такое поведение, связанное с реакцией на стимуляторы pH и NIR, играет важную роль в эффективной доставке лекарства к месту опухоли.

Поглощение клеток in vitro

Для проверки способности Fe ₃ к магнитному наведению О ₄ в rGO @ Fe ₃ О ₄ микросферы, эксперименты по поглощению клетками с обработкой магнитным полем или без нее были качественно исследованы с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM). Клетки Hela инкубировали с rGO @ Fe ₃ О ₄ / DOX в течение 4 ч, и ядра Hela окрашивали с помощью DAPI. Результаты на рис. 5 показали, что черное пятно, соответствующее rGO @ Fe ₃ О ₄ микросферы и очевидные внутриклеточные сигналы красной флуоресценции, приписываемые DOX, наблюдались в rGO @ Fe ₃ О ₄ группа с обработкой магнитным полем. Напротив, было меньше черного пятна и более слабая флуоресценция DOX может быть обнаружена, когда rGO @ Fe ₃ О ₄ группа без нагрузки магнитным полем. Объяснение может заключаться в том, что черное пятно, приписываемое rGO @ Fe ₃ О4, проникший внутрь клетки, может продвигаться с помощью магнита. Результаты показывают, что Fe3O4 в rGO @ Fe ₃ O4 / DOX может эффективно нацеливаться на клетки Hela и значительно усиливать интернализацию микросфер клетками, демонстрируя благоприятную способность системы доставки лекарств к магнитному нацеливанию при лечении рака.

Оценка магнитных мишеней микросфер rGO @ Fe3O4-DOX. CLSM-изображения rGO @ Fe ₃ О ₄ / DOX-инкубированные клетки HeLa с магнитом и без него (на вставках показано изображение с большим увеличением)

Анализы цитотоксичности in vitro

Биосовместимость rGO @ Fe ₃ О ₄ оценивали с помощью анализа CCK-8 в отношении клеток Hela. Как показано на рис. 6а, после инкубации с rGO @ Fe ₃ О ₄ при широком диапазоне различных концентраций жизнеспособность клеток также была выше 90% даже при высоких концентрациях до 200 мкг / мл ^-1 , результаты показали, что rGO @ Fe ₃ О ₄ демонстрирует высокую биосовместимость и может служить эффективной платформой для доставки лекарств. Эффективность фототермической терапии rGO @ Fe ₃ О ₄ был дополнительно исследован после инкубации с клетками Hela в течение 24 и 48 часов при облучении светом NIR (808 нм NIR-лазер, 10 мин). Как показано на рис. 6b, фототоксичность явно зависела от дозы от стимуляции NIR, а жизнеспособность клеток снизилась с 90,37 до 35,52% через 24 часа и с 93,77 до 31,75% через 48 часов, что означает, что rGO @ Fe ₃ О ₄ обладал превосходной фототоксичностью и имел большие перспективы в области фототермической терапии. Чтобы оценить синергетическую терапевтическую эффективность фототермической химиотерапии, цитотоксичность rGO @ Fe ₃ О ₄ / DOX по отношению к клеткам Hela с БИК и без него. Как показано на фиг. 6c, d, жизнеспособность клеток проявлялась в зависимости от концентрации и с контролем времени. Примерно 65% и 80% клеток Hela были убиты rGO @ Fe ₃ О ₄ / DOX без NIR-облучения и DOX через 24 часа, снижение способности rGO @ Fe ₃ убивать опухоли О ₄ / DOX по сравнению с бесплатным DOX может быть связано с задержкой выпуска DOX в rGO @ Fe ₃ О ₄ / DOX микросферы. После облучения NIR-лазером (808 нм NIR-лазер, 10 мин) rGO @ Fe ₃ О ₄ Группа / DOX с помощью лазера убила более 86% клеток при эквивалентной дозе DOX (30 мкг мл ^-1 ). Similar results could be observed after the same treatment cells for 48 h, the decrease in the cell viability of DOX, rGO@Fe₃ О ₄ /DOX, rGO@Fe₃ О ₄ /DOX with NIR irradiation group was 80%, 76%, and 90%, respectively, indicating a synergistic effect of the combined photothermal therapy and chemotherapy.

The biocompatibility and the therapeutic efficacy of single photothermal therapy or combined photothermal-chemotherapy. а Cell viability of Hela cells cultured with rGO@Fe₃ О ₄ for 24 h and 48 h. б Cell viability of Hela cells cultured with or without NIR irradiation at different concentrations of rGO@Fe₃ О ₄ for 24 h and 48 h. ( c , d ) Cell viability of Hela cells cultured with free DOX, rGO@Fe₃ О ₄ /DOX microspheres for 24 h and 48 h with and without NIR irradiation (808 nm, 2 W cm ⁻² ) (*p <0,05, ** p <0,01, *** p <0.001)

Conclusions

In summary, we explored a facile strategy to construct rGO-based drug delivery platform rGO@Fe₃ О ₄ /DOX for synergistic photothermal-chemotherapy. rGO@Fe₃ О ₄ /DOX microsphere exhibited excellent NIR-triggered PTT effect and perfect NIR photothermal stability. The Fe₃ О ₄ on the microspheres ensured excellent tumor cells targeting ability. DOX could be encapsulated into rGO@Fe₃ О ₄ with an ultrahigh drug-loading capacity and a pH-responsive drug release behavior could be simultaneously achieved. In addition, an enhanced antitumor efficiency was achieved when a combination of chemotherapy and photothermal therapy. Therefore, this multifunctional drug delivery platform could be a promising candidate for tumor targeting and combinatorial cancer therapy in the future.

Доступность данных и материалов

The data and the analysis in the current work are available from the corresponding authors on reasonable request.

Сокращения

DDS:

Drug delivery system

NIR:

Near-infrared

GO:

Оксид графена

DOX:

Доксорубицин

DMEM:

Dulbecco’s minimum essential medium

DAPI:

4',6-diamidino-2-phenylindole

CCK-8:

Cell counting kit-8

SEM:

Сканирующая электронная микроскопия

ТЕМ:

Просвечивающий электронный микроскоп

XRD:

X-ray diffraction system

XPS:

Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия

FTIR:

Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье

TGA:

Thermogravimetric analyzer

LE:

Loading efficiency

LC:

Грузоподъемность