Предварительные исследования биоразлагаемых наночастиц оксида цинка, допированных Fe, как потенциальной формы доставки железа в живой организм

Введение

Железо - один из важнейших компонентов, создающих живые организмы на Земле, в том числе человеческое население. Важность этого элемента связана с важной ролью железа во многих структурах и процессах, происходящих в организме, например. перенос кислорода по тканям и клеткам всего организма (часть гемоглобина и миоглобина), выработка энергии (компонент белков дыхательной цепи митохондрий внутри) и многое другое [1, 2]. Таким образом, железо принимает участие в важнейших жизненных процессах клеток и всего организма, и его дефицит может привести к значительным нарушениям функционирования живого организма.

Как показывают мировые отчеты, дефицит железа становится серьезной проблемой общественного здравоохранения среди населения. По данным ВОЗ, почти 30% общества во всем мире были поражены анемией в 1993–2005 гг. Распространенность анемии все еще намного выше у детей раннего возраста и беременных женщин [3]. Важность приема добавок железа во время беременности связана с тем, что дефицит железа является фактором риска преждевременных родов, низкого веса новорожденных при рождении и общего ухудшения состояния их здоровья [4]. У младенцев и детей дошкольного возраста фактор риска дефицита железа вызван быстрым ростом всего тела и последующим потреблением запасов железа; таким образом, добавка железа также рекомендуется детям в возрасте от 0 до 5 лет [5]. Интересно, что существуют научные отчеты, указывающие на взаимосвязь правильного уровня железа у детей и их эмоционального и нейропсихологического развития [6]. Более того, дефицит железа также является серьезным нарушением питания среди других видов млекопитающих, особенно у поросят-сосунов, где ограниченное внутриутробное поступление этого элемента сочетается с низким содержанием железа в молоке свиноматки [7, 8]. Кроме того, быстрый рост поросят быстро истощает запасы железа, поскольку в течение нескольких дней новорожденные поросята удваивают свой вес, тем самым увеличивая количество эритроцитов и общий объем крови. Таким образом, в настоящее время более эффективная и безопасная стратегия приема добавок железа как для людей, так и для животных стала одной из наиболее важных задач в профилактике и лечении недостаточности питания.

Существует три основных способа дополнительной доставки железа в живой организм:внутривенный, внутримышечный и пероральный. Каждый из них демонстрирует как достоинства, так и недостатки метода. Пероральный прием кажется простым и более естественным для организма, поскольку включает физиологические пути абсорбции железа и транспортные системы. Также этот метод сохраняет естественную систему контроля количества циркулирующего железа в организме на основе гепсидина [9]. Однако пероральный способ приема добавок часто сопровождается плохой абсорбцией и конечной низкой эффективностью. Научные исследования также показали, что стандартная стратегия приема растворимых пероральных добавок железа сильно влияет на состав и метаболическую активность микробиома кишечника животных [10]. С другой стороны, внутривенные или внутримышечные пути доставки железа в организм затруднены из-за риска токсических побочных эффектов [11]. Кроме того, в промышленном свиноводстве стандартный метод введения добавок железа, основанный на индивидуальном внутримышечном введении разовой дозы декстрана железа, вызывает стресс у животных и хлопотно для заводчиков. Также неправильно выполненная инъекция может вызвать воспаление и другие осложнения у животных, а также способствовать распространению различных заболеваний в стаде при несоблюдении условий бесплодия.

Упомянутые выше токсические побочные эффекты экзогенной доставки железа в живой организм связаны с появлением в организме свободного и несвязанного элемента железа, который в качестве переходного металла (через изменение валентности) может приводить к образованию вредных свободных радикалов (а именно реактивного кислорода. виды - АФК) по реакции Фентона [12]. Научные отчеты указывают на риск повышенного уровня свободных радикалов в организме как фактор, способствующий возникновению различных состояний, включая бактериальные инфекции, новообразования или заболевания печени [13]. Естественная физиологическая стратегия предотвращения образования АФК свободным железом основана на связывании элемента железа с определенными белками на каждом этапе его абсорбции и путей транспортировки в организме. В случае пероральной перегрузки железом и его внутривенного / внутримышечного введения физиологические пути циркуляции железа обычно нарушаются, что приводит к быстрому увеличению ROS [14].

Наночастицы на основе железа (НЧ на основе Fe) широко изучаются как многообещающий инструмент для биомедицинских целей. Наиболее широкое использование этих наноструктур связано с их магнитными свойствами; таким образом, они в основном тестировались в качестве контрастных агентов для методов клинической диагностики, направленных на визуализацию опухоли или ее накопление в определенных тканях [15]. В последнее время наноструктуры также изучаются как новая, более эффективная форма доставки биологически активных веществ в организм. Носители НЧ могут обнаруживать значительно повышенную биодоступность для живого организма по сравнению с веществами в нерасфасованной форме, что во многом связано с их меньшими размерами [16, 17]. В одном из исследований эффективность НЧ, содержащих железо, сравнивали с сульфатом железа (стандартная добавка для лечения анемии) на анемичных крысах. На основании анализа крови полученные результаты показали повышенную биодоступность железа после перорального приема однократной дозы НЧ с железом у анемичных животных. В случае многократных доз наночастиц и сульфата железа полученные результаты были аналогичными [18]. В другом исследовании были описаны полученные результаты применения наноматериалов на основе железа в качестве альтернативных агентов доставки железа на людях и на модели грызунов. Авторы особо подчеркнули более высокую безопасность nanoFe по сравнению с растворимыми формами железа, что привело к недостаточному накоплению железа в слизистой оболочке кишечника и развитию полезной микробиоты [19]. Аналогичные многообещающие результаты были получены в исследовании на анемичных крысах, получавших НЧ на основе железа, кэпированные витамином С, что позволило избежать стандартного пути абсорбции железа из желудочно-кишечного тракта. Полученные результаты свидетельствуют об излечении подопытных животных от анемии с улучшением показателей крови в короткие сроки по сравнению со стандартным методом терапии железодефицитной болезни [20].

Материалы и методы

Синтез наночастиц

Наночастицы оксида цинка, легированные железом (НЧ ZnO:Fe), были синтезированы с использованием микроволнового гидротермального метода. Метод хорошо зарекомендовал себя, относительно недорогой, биологически чистый и масштабируемый в промышленном масштабе, способный вводить различные посторонние ионы в качестве функциональных допантов [21,22,23,24,25] в различные оксиды [26,27,28]. Концентрация железа в имеющихся наночастицах была установлена ​​на 5% молярных. Синтез проводили, исходя из нитратов (V):Zn (NO ₃ ) ₂ · 6H ₂ O (99%, Sigma – Aldrich) и Fe (NO ₃ ) ₃ · 9H ₂ О (96%, Карл Рот). Мы протестировали различных поставщиков и выбрали тех, которые предлагают наиболее однородный продукт, не содержащий измеримых уровней нерастворимых остатков. В дистиллированной воде растворяли соединения:17,63 г нитрата цинка (V) и 1,25 г нитрата железа (III) (V). Затем прозрачный раствор подщелачивали 25% -ным водным раствором аммиака (Carl Roth) до pH 8. Полученный красный остаток промывали с помощью воронки Бюхнера ~ 1 л дистиллированной воды и фильтровали под вакуумом. Осадок помещали в тефлоновый сосуд объемом 100 мл, заполняли водой до 80% объема, затем закрывали в камере реактора Ertec Magnum II. Микроволновый гидротермальный процесс проводили при 4 МПа в течение 20 мин. После реакции бледно-красный продукт собирали и сушили в течение ночи при 60 ° C.

Характеристика наночастиц

Характеристику продукта проводили с использованием сканирующей электронной микроскопии (SEM), фотолюминесценции (PL) и катодолюминесценции (CL) спектроскопии и энергодисперсионного элементного анализа (EDX). СЭМ-измерения проводились с помощью микроскопа Hitachi SU-70 с высоким разрешением (1 нм), оснащенного детектором характеристического излучения и системой катодолюминесценции GATAN Mono CL3 в режимах вторичных электронов (SE) и пропускания (TE). Спектры излучения и возбуждения фотолюминесценции регистрировали с помощью спектрофлуориметра Horiba / Jobin-Yvon Fluorolog-3, оснащенного ксеноновой лампой в качестве источника возбуждения и фотоумножителем Hamamatsu R928P. Динамическое рассеяние света (DLS) и дзета-потенциал измеряли с помощью системы определения характеристик частиц DelsaMax Pro. Термогравиметрический анализ (ТГА) проводили на термогравиметре NETZSCH STA 449 F1 Jupiter в токе аргона. СЭМ-измерения проводились после осаждения наночастиц на покрытый поликарбонатом агар 400 меш. Образец суспендировали в дистиллированной воде с помощью ультразвукового процессора Sonics VCX500, затем каплю суспензии помещали на сетку и затем сушили. Образец был приготовлен после 2-часового осаждения более тяжелых частиц.

Модель In Vitro

В данном исследовании использовали клеточную линию Caco-2 (клетки аденокарциномы толстой кишки Кавказа) в качестве модели эпителиальных клеток желудочно-кишечного тракта. Клеточная линия была получена из Европейской коллекции аутентифицированных клеточных культур - ECACC (Sigma-Aldrich, Cat. No. 86010202). Клетки были засеяны размером 0,5 × 10 ⁶ . клеток / мл на 6-луночные или 96-луночные планшеты и хранятся в среде Игла в модификации Дульбекко - DMEM (Gibco) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки - FBS (Gibco), 1% заменимых аминокислот - NEAA (Gibco). ), 1% пенициллин-стрептомицин-неомицин-PSN (Gibco) и 0,2% бикарбоната натрия (Gibco) при 37 ° C и 5% CO ₂ . Когда наблюдалась 95–100% конфлюэнтность, среду для культивирования клеток удаляли и добавляли суспензию НЧ ZnO:Fe в свежей среде для выращивания. Клетки инкубировали с четырьмя различными концентрациями НЧ ZnO:Fe (1,0; 0,1; 0,01; и 0,001 мг НЧ ZnO:Fe / мл) в течение 24 часов при 37 ° C и 5% CO ₂ .

Анализ жизнеспособности ячеек

Жизнеспособность клеток оценивали для Caco-2 с использованием двух методов:анализа XTT и окрашивания трипановым синим. Все реагенты, необходимые для анализа XTT, были предоставлены из коммерческого набора (Cell Proliferation Kit II, Roche). После инкубации клеток, выращенных на 96-луночном планшете с различными концентрациями НЧ ZnO:Fe, клетки инкубировали с 50 мкл смеси для мечения XTT в течение 4 часов при 37 ° C и 5% CO ₂ . Впоследствии концентрацию формазана оценивали спектрофотометрическим методом. Поглощение измеряли при 470/650 нм, и результаты коррелировали с количеством жизнеспособных клеток. В следующем эксперименте за результат наивысшего поглощения принимали 100% жизнеспособность клеток. Окончательные результаты были рассчитаны на основе четырех отдельных повторностей экспериментов ( n =4).

Чтобы выполнить окрашивание трипановым синим, после того, как клетки, выращенные на 6-луночных планшетах, были инкубированы с различными концентрациями НЧ ZnO:Fe, клетки собирали (0,05% трипсина и 0,2% ЭДТА в течение 10 мин), центрифугировали и осадок повторно обрабатывали. суспендировали в 1 мл питательной среды. Сто микролитров стерильного 0,4% раствора трипанового синего смешивали со 100 мкл клеточной суспензии. Десять микролитров образца загружали на счетное стекло и анализировали с использованием программного обеспечения JuLi Br Couting (NanoEnTek) для оценки количества жизнеспособных клеток. Окончательные результаты были рассчитаны на основе трех отдельных повторностей экспериментов ( n =3).

Модель животного

Для целей этого предварительного исследования взрослые самцы мышей Balb-c ( n =6) индивидуально содержались в стандартных и контролируемых условиях жизни (12/12 часов светлый-темный период, 25 ° C, влажность 30%) со стандартной пищей и водой (при условии ad libitum). Все процедуры были одобрены Местным этическим комитетом, соглашение № WAW2 / 59/2017. Через 7 дней акклиматизации суспензию НЧ ZnO:Fe в воде (10 мг / мл; 0,3 мл / мышь) вводили через желудочный зонд (IG) животным из экспериментальной группы ( n =4). Мыши контрольной группы получали по ИГ 0,3 мл питьевой воды ( n =2). Во время эксперимента мы не заметили никаких поведенческих изменений у подопытных животных или каких-либо тканевых аномалий. Через 24 часа мышей из экспериментальной и контрольной групп умерщвляли в CO ₂ . -O ₂ камера (CO2 Box, Bioscape, Merazet) с последующим забором тканей. Половину свежесобранных образцов замораживали при -20 ° C для атомно-абсорбционной спектрометрии (AAS). Вторую половину тканей фиксировали в 4% забуференном формалине и переносили в 70% этанол (через 24 ч). Впоследствии образцы были обезвожены в этаноле с возрастающей концентрацией, залиты парафином (Leica TP1020, Leica EG1150), и микроскопические слайды толщиной 6 мкм (или 4 мкм для гистопатологических исследований) были приготовлены с помощью микротома (Leica RM2255). / P>

Накопление железа, оцененное методом окрашивания Perl

Срезы микроскопии селезенки, печени и мозга окрашивали методом Перла (берлинская лазурь) на присутствие железа. Образцы депарафинизировали и повторно гидратировали до дистиллированной воды, затем помещали в рабочий раствор с равными частями 5% -ного феррицианида калия (Sigma-Aldrich) и 5% -ной соляной кислоты (Sigma-Aldrich) и окрашивали в течение 30 мин. После этого срезы промывали водой и окрашивали ядерно-быстрым красным (Sigma – Aldrich) в течение 5 минут, промывали водой и помещали под покровные стекла с помощью Permount (Fisher Scientific). Изображения окрашенных образцов были получены с использованием микроскопа Olympus BX60 и программного обеспечения для получения изображений Cell ^ P. Из каждого протестированного образца было отобрано 16 случайно выбранных изображений для дальнейшего изучения с помощью MicroImage v.4.0 (Olympus) в соответствии с протоколом анализа изображений в домашних условиях [29]. При исследовании селезенки во время анализа учитывалась только красная пульпа в ткани. Содержание железа рассчитывалось как отношение площади и интенсивности железо-положительных пятен (синий цвет) к площади ядер клеток на изображении.

Концентрация железа в протестированных тканях, измеренная с помощью атомной абсорбционной спектрометрии

Предварительно собранные, хранящиеся при -20 ° C и впоследствии размороженные образцы тканей были подготовлены для дальнейшей количественной оценки концентрации железа методом атомно-абсорбционной спектрометрии (ААС) в соответствии с протоколом, подробно описанным ранее [24]. Вкратце, ткани взвешивали и выдерживали> 16 ч в растворе, содержащем 5 мл 65% азотной кислоты и 1 мл 30% перекиси водорода (Merck). Затем образцы минерализовали в микроволновой системе Ethos 900 (Milestone, США) до жидкого раствора и оценивали с помощью AAS (Perkin-Elmer) на содержание железа.

Статистический анализ

Данные, полученные в исследовании, были представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего (SEM). Для статистической оценки накопления железа, полученного с помощью окрашивания Perl, для всех групп выполняли однофакторный дисперсионный анализ с множественным сравнением Тьюки-Крамера post hoc. Для оценки значимой разницы между контрольной и экспериментальной группами по анализу AAS, непарный t был использован тест. Значительные различия между контрольной и экспериментальной группами в экспериментах in vitro оценивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа с тестом множественных сравнений Даннета. Статистический анализ был рассчитан с помощью GraphPad InStat 3.10. Для всех тестов полученные результаты считались статистически значимыми с P ≤ 0,05 и P ≤ 0,01 и P ≤ 0,001 как высокий и чрезвычайно значимый.

Результаты

Характеристика наночастиц

Изображения, полученные с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) кристаллизованных в микроволновом гидротермальном процессе нанокристаллов ZnO:Fe, показаны на рис. 1. Сухой порошок, хранившийся после синтеза, диспергировали в воде с использованием ультразвуковой ванны, а затем осаждали на медном элементе размером 400 меш. Суспензию, полученную в результате ультразвуковой обработки, оставляли на 2 ч для агломерации и осаждения крупных зерен. В образце обычно наблюдаются кристаллы ZnO в форме удлиненных гексагональных призм. Кристаллы вытянуты в направлении роста c-плоскостей - [001]. На изображении хорошо видно пересечение призм:размер шестиугольников составляет 50–100 нм. В основном наночастицы агломерируются и образуют более крупные структуры. На рис. 1б показана такая структура сильно агломерированных и сгруппированных кристаллов ZnO:Fe. Образец также состоит из неоднородных зерен, размер которых составляет от сотен нанометров до микрометров. Нет четких указаний на существование отдельной фазы, кроме ZnO, что позволяет предположить отсутствие кристаллизации фазы на основе железа (например, оксида железа) [30].

Изображения НЧ ZnO:Fe, нанесенные на медную сетку после осаждения крупных агрегатов, полученные с помощью сканирующей электронной микроскопии. Увеличение 100 кг ( a ) и 20 тыс. x ( b ). Суспензию, содержащую 1 мг наночастиц ZnO на миллилитр воды, по каплям наносили на покрытую поликарбонатом медную сетку, чтобы обеспечить возможность наблюдений с помощью сканирующей микроскопии с высоким разрешением

Термогравиметрический анализ (ТГА) и дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) были выполнены в потоке аргона от комнатной температуры до 800 ° C, и полученные результаты показаны на рис. 2. Первая потеря массы произошла до 200 ° C и это привело к уменьшению массы образца на 4,78% относительно его исходной массы. Вторая потеря была зарегистрирована между 200 и 400 ° C, и ее значение составляет около 7,36%. Других убытков массы до 800 ° C не было. Первый был связан с испарением молекул адсорбированной воды, а второй, вероятно, был вызван восстановлением гидроксильных групп. Кривая ДСК показывает эндотермический пик при 118,3 ° C (-0,6175 мВт / мг, испарение воды) и экзотермический пик при 283,1 ° C (0,4356 мВт / мг, разложение гидроксильных групп). Небольшой эффект, связанный с разложением, показал, что почти полная кристаллизация наночастиц ZnO:Fe произошла в микроволновом гидротермальном процессе.

ТГА / ДСК НЧ ZnO:Fe, нагретые в аргоне

На рис. 3 представлены спектры фотолюминесценции НЧ ZnO:Fe при комнатной температуре. Спектр излучения (рис. 3а) состоит из двух особенностей:люминесценции узкой ближней зоны (NBE) низкой интенсивности и люминесценции очень интенсивного излучения широкого глубокого уровня (DLE). Первая имеет максимум при ~ 380 нм, а вторая - при 600 нм. Преобладание интенсивности DLE в спектре свидетельствует о том, что полученные нанокристаллы были сильно дефектными на кристаллографическом уровне [31,32,33]. Спектр возбуждения (рис. 3b) указывает на механизм излучения с глубоких уровней в запрещенной зоне ZnO:Fe.

Фотолюминесценция (ФЛ) излучение ( a , λ _exc =260 нм) и возбуждения ( b , λ _em =595 нм) спектры НЧ ZnO:Fe. Образцы неплотно залили в алюминиевую матрицу, а затем повторно сбалансировали, чтобы можно было проводить измерения ФЛ. Второй и более высокие порядки длины волны возбуждения фильтровались спектральным полосовым фильтром

Спектр катодолюминесценции НЧ ZnO:Fe показан на рис. 4; Отношение интенсивностей DLE / NBE составляет ≈ 25. Пики полосы NBE прибл. 380 нм, полоса DLE содержит четыре компонента с максимумом на ~ 570, 625, 653 нм и очень слабым при 770 нм. Согласно Маккласки и Джокела [34], полосы 570 нм относятся к кислородным вакансиям, а другие - к вакансиям цинка в решетке типа вюрцита [35].

Спектр катодолюминесценции (КЛ) НЧ ZnO:Fe. Сухой нанопорошок гранулировали для получения спектра ХЛ для большого объема образца. Показанные полосы иллюстрируют количество и качество кристаллографических дефектов, присутствующих в нанокристаллах оксида цинка

Количество железа в образце определяли с использованием двух методов:атомно-абсорбционной спектроскопии (AAS) и энергодисперсионной рентгеновской спектроскопии (EDX). В случае AAS суспензия, приготовленная аналогично тому, как использовалась в эксперименте с грызунами, была проанализирована, чтобы показать 3,98 атомных% Fe в ZnO:Fe. Методом EDX был проанализирован сухой порошок в медной сетке и обнаружено, что концентрация железа составляет 4,5% ат. по отношению к ионам цинка.

Свойства суспензии были измерены с использованием методов DLS и TEM, при этом распределение диаметров наночастиц показано на рис. 5. Распределение является бимодальным:для одной популяции наиболее частый диаметр достигал пика между 20 и 100 нм (TEM), а также между 50 и 50 нм. 200 нм (DLS). Вторая совокупность содержит меньшее количество более крупных объектов 100–500 нм (ПЭМ) и прибл. 150–500 нм (DLS). Бимодальный характер наночастиц четко наблюдается обоими показанными методами. Большой разброс размеров в большей популяции указывает на то, что это соответствует агломерированным наночастицам. Статистика, показанная для диаметров более 100 нм, указывает на множество различных способов агломерации наночастиц ZnO:Fe. Наночастицы в водной суспензии были отрицательно заряжены, как показывает дзета-потенциал ниже 0 В. Значение примерно -40 мВ также указывает на то, что конечная водная суспензия была стабильной, а наночастицы не имели сродства к агломерации.

Распределение гидродинамических радиусов наночастиц, измеренных в водной суспензии (точки) и полученных непосредственно из изображений ПЭМ, вдоль более коротких и длинных сторон нанокристаллов (см. Текст). Наночастицы переводили в водную суспензию с помощью мощного ультразвукового рупора. Концентрация сухого материала составляла 1 мг на 1 мл воды. После завершения осаждения было выполнено десять измерений подвижности для получения достоверного графика зависимости подвижности от диаметра наночастиц. Размеры ПЭМ были взяты непосредственно с изображений:по c оси (более длинные стороны кристаллов ZnO) и вдоль м и a топоры (короткие стороны кристаллов)

Токсикологическая оценка ZnO:Fe наночастиц in vitro

Оба анализа жизнеспособности клеток (XTT и трипановый синий) выявили снижение поглощения клеток Caco-2, инкубированных с НЧ ZnO:Fe, что напрямую коррелировало с количеством жизнеспособных клеток. Статистически значимые изменения наблюдались только после 24-часового воздействия на инкубированные клетки наивысших концентраций НЧ (1,0 и 0,1 мг / мл), тогда как физиологические уровни концентрации НЧ (0,01 и 0,001 мг / мл) не оказывали значимого влияния на культуры клеток. (Рис. 6 и 7).

Жизнеспособность клеток (линия Caco-2) проверена методом XTT. Клетки подвергали действию в течение 24 ч суспензии НЧ ZnO, допированных железом, в различных концентрациях:0,001 мг / мл; 0,01 мг / мл; 0,1 мг / мл; и 1 мг / мл. Результаты представляют собой средний процент жизнеспособных клеток (± SEM) для контрольной и экспериментальной групп ( n =4). Значительная разница ** P ≤ 0,01 по сравнению с контролем отмечено на графике

Жизнеспособность клеток (линия Caco-2) тестировали с окрашиванием трипановым синим. Клетки подвергали действию в течение 24 ч суспензии НЧ ZnO, допированных железом, в различных концентрациях:0,001 мг / мл; 0,01 мг / мл; 0,1 мг / мл; и 1 мг / мл. Результаты представляют собой средний процент жизнеспособных клеток (± SEM) для контрольной и экспериментальной групп ( n =3). Значительная разница ** P ≤ 0,01 по сравнению с контролем отмечено на графике

Распределение железа в животной модели

Для оценки доступности железа in vivo из НЧ ZnO:Fe, мыши ( n =4) перорально получали суспензию НЧ ZnO:Fe, и через 24 ч животных скарифицировали с дальнейшим сбором важных тканей. Количественная оценка содержания железа в исследуемых тканях была проанализирована методом AAS для всех собранных органов и рассчитана с помощью программного обеспечения Micro Image (на основе окрашивания Perl) для тканей печени, селезенки и мозга. Данные, представленные на фиг. 8, показывают повышенный уровень содержания железа (по сравнению с контролем) в тканях сердца, скелетных мышц, селезенки и тонкой кишки через 24 часа после перорального введения НЧ ZnO:Fe (без статистически значимого увеличения). В случае с костной тканью средний уровень железа в экспериментальной группе был лишь немного выше, чем в контрольной группе. Содержание железа в тканях печени и головного мозга значительно увеличилось ( P ≤ 0,01) через 24 ч после IG НЧ ZnO:Fe по сравнению с контрольной группой (рис. 8). В почках, висцеральной и подкожной жировой ткани и легких уровни Fe упали через 24 часа после введения НЧ ZnO:Fe.

Распределение железа в анализируемых тканях через 24 часа после введения IG ZnO:Fe НЧ. Данные представляют собой средний процент Fe в протестированных органах экспериментальной группы ( n = 4) по сравнению с контрольной группой (100% - горизонтальная линия). Содержание железа анализировали с помощью AAS. Значительная разница ** P ≤ 0,01 по сравнению с контролем

Оценка содержания железа в печени, окрашенная методом Перла, выявила чрезвычайно значимое ( P ≤ 0,001) повышенный уровень Fe у всех экспериментальных животных по сравнению с контрольными (рис. 9б). Аналогичным образом, результаты, полученные для красной пульпы ткани селезенки, показали чрезвычайно значительную ( P ≤ 0,001) повышение содержания железа у всех экспериментальных животных по сравнению с контрольными (рис. 10б). Данные, полученные из анализа ткани головного мозга, показали отсутствие увеличения содержания Fe в экспериментальной группе через 24 часа после IG ZnO:НЧ Fe (рис. 11b).

Содержание железа в печени рассчитано с помощью программ для окрашивания Perl и MicroImage. Результаты рассчитывают как отношение площади и интенсивности железо-положительных пятен к площади ядер клеток. Данные представлены в виде среднего (± SEM) результата для каждого исследованного животного ( a ) и как среднее (± SEM) значение для контрольной и экспериментальной групп ( b ). Значительная разница * P ≤ 0,05, ** P ≤ 0,01 и *** P ≤ 0,001

Iron content in the red pulp of the spleen calculated with Perl’s staining and MicroImage software. Results calculated as a ratio of area and intensity of iron-positive stains to the area of cell nuclei. Data presented as mean (±SEM) result for each, examined animal (a ) and as mean (±SEM) value for both control and experimental groups (b ). Significant difference of *P ≤ 0.05, **P ≤ 0.01, and ***P ≤ 0.001

Iron content in the brain calculated with Perl’s staining and MicroImage software. Results calculated as a ratio of area and intensity of iron-positive stains to the area of cell nuclei. Data presented as mean (±SEM) result for each, examined animal (a ) and as mean (±SEM) value for both control and experimental groups (b )

In case of content of iron from each animal of experimental and control groups, results were collected at the Figs. 9a, 10a, and 11a. The highest and significantly different (P ≤ 0.05 and P ≤ 0.01) level of iron within liver tissue was detected for mice – 2 (24 h 2), comparing with results from control group (Fig. 9a). Levels of iron stains in red pulps of the spleen within the experimental group were similar; however, most of them were statistically higher (P ≤ 0.05 or P ≤ 0.01) than mice – 1 (CTRL 1) from the control group (Fig. 10a). Results obtained for brain tissue were similar between each animal from experimental and control groups (Fig. 11a).

Sections of liver and spleen tissues stained with Perl’s method were also qualitatively assessed. Increased number of iron depositions (light blue stains) was visible within hepatocytes from liver sections of experimental group (Fig. 12).

Representative microphotographs of liver sections showing staining with Perl’s method. Comparison of the presence of iron (light blue areas) in control and experimental groups of mice (with ZnO:Fe NPs administered 24 h before sacrifice). The arrows point iron deposits in hepatocytes. × 40 lens

General greater accumulation of iron (blue stains) within the red pulp than in white pulp of spleen was observed in both control and experimental groups (Fig. 13). After application of ZnO:Fe NPs, the higher level of iron was particularly visible within the red pulp, comparing with images from control group (Fig. 13c, d). In experimental group, an increased concentration of iron was also noticeable around blood vessels (Fig. 13b, d).

Representative spleen sections following staining with Perl’s method. Comparison of the presence of iron (blue areas ) in control and experimental group of mice (with administered 24 h before ZnO:Fe NPs). Separate presented areas of the tissue:white pulp (a , b ) and red pulp (c , d ). The arrows point iron accumulated around blood vessels (circles). × 10 (a , b ) or × 20 (c , d ) lens

Discussion

As was mentioned in the “Introduction” section, the iron deficiency is a considerable nutritional disorder in human population, as well as in other mammalian species [3, 7, 8]. Consequently, an implementation of new, more efficient and safe iron supplementation strategy seems to be highly desirable. Currently presented results come from preliminary studies aimed at further, detailed investigations related with potential usage of biodegradable ZnO NPs doped with Fe as a novel strategy for iron supplementation. As was confirmed previously, in-house manufactured zinc-based NPs undergo very efficient absorption after their oral administration with further, rapid distribution to major organs and tissues in the living organism [22,23,24]. Moreover, we reported that these nanostructures demonstrated bio-safety and biodegradability within the body along with fast clearance from the organism [36]. Employed in the current study, the oral way of NP administration provides a highly efficient way of fast delivery of the exogenous nanostructures to the body, based on persorption process [37, 38]. Furthermore, this strategy decreases chance of eventual toxic effects related with administration of iron-doped substances, because of the existence physiological “security mechanisms” related to both Zn and Fe absorption from the gastrointestinal tract. This crucial, physiological pathways of iron distribution may be avoided in case of intravenous/intramuscular application iron-doped substances [14], which can result in increased possibility of occurrence iron-related toxic side effects. The examination of the internalization pathways of the nanoparticles, their dynamics, and cellular systems involved in the process is being currently studied in the frame of other publication. In the current paper, we decided to show overall effect of our nanoparticles on living organism, focusing on the effect of iron.

Toxicity of nanostructures may be related with various features of material, not only with chemical composition, but also with e.g. size, shape, or their ability to aggregate [39]. Nevertheless, it was confirmed that smaller NPs were better absorbed than bigger one and high surface-to-volume ratio makes the particles of some metals exceptionally reactive and cytotoxic [40, 41]. Nanostructures were able to enter cells and affect their components, which altered the viability of cells [42, 43]. In one of the previous investigations on cytotoxicity of ZnO or FeO NPs, authors did not observe toxic effects (based on ability of examined cells to grow and divide), even in high doses of NPs [44]. Presented here is a study performed on Caco-2 cell line, as a model of epithelial cells of the gastrointestinal tract, revealing a low toxicity of used nanomaterials. ZnO:Fe NPs in small/physiological doses (0.001 mg/ml and 0.001 mg/ml) did not alter the viability of cells (Figs. 6 and 7). Following the incubation of Caco-2 cells with high doses of ZnO:Fe NPs, a statistically significant decrease of viability was observed. However, IC50 (the half maximal inhibitory concentration), as a measure of the effectiveness of a substance in inhibiting a specific biological or biochemical function, still remained surprisingly high—around 1 mg/ml (Figs. 6 and 7). Observed drop of cell viability was probably associated with the physical deposition of nanoparticles on the surface and overstress of the cells rather than the cytotoxic effect related to the nanoparticles themselves. In another study, authors concluded decrease IC50 of cells from cancer cell line following incubation with ZnO and ZnO:Fe3O4 NPs and relatively low cytotoxicity effect (and non-dose-depended) of examined NPs on noncancerous cells [45]. Similar observations were also reported for ZnO and platinum NPs [46, 47]. Nevertheless, further examinations on chronic toxicity profile of such composites including antioxidant activity profiling, production of reactive oxygen species (ROS), and using another cells and cell line must be performed.

Obtained in the in vivo experiment, results indicated a rapid distribution of ZnO:Fe NPs to tissues mostly related with iron homeostasis (Figs. 8, 9, and 10). Similar studies, concerning the bioavailability of iron from “nano” form, were mostly performed on anemic animals or examined following the iron depletion period [18, 19, 48], where our preliminary studies were carried out on healthy, normally maintained mice. Comparison of data presented in the current work with similar studies may be misleading because of differences in employed NPs e.g. their size, shape and compound or route, dose, and frequency of their administration to animals. Results of iron level in the liver showed significantly increased level at 24 h after application of ZnO:Fe NPs, comparing with control (Figs. 8 and 9). Iron accumulation was visible in hepatocytes of liver tissue (Fig. 12), where the major storage site of the element takes place [49]. Similarly, previous studies with intraperitoneally injected iron oxide, magnetic NPs to rats also resulted in 55% accumulation of these nanomaterials in the liver at 6 h following injection [50]. Likewise, the spleen level of iron in the current study was clearly higher in experimental group, than within control (Figs. 8 and 10). Interestingly, tendency of iron accumulation was detected around blood vessels within the spleen, which might indicate the transfer of ZnO:Fe NPs from general bloodstream into the tissue (Fig. 13b, d). Primary accumulation of nanostructures within the liver and spleen after their application might also be attributed with clearance via mononuclear phagocytes in these tissues, as was also postulated previously [50,51,52].

In case of brain tissue, the measurement of total iron level (AAS method) showed significantly higher level of the element in animals with previously administered ZnO:Fe NPs (Fig. 8), which was not confirmed by analysis based on Perl’s staining (Fig. 11). Inconsistency between both, employed in the study methods, may be related with sensitivity of Perl’s staining. This histological method of iron visualization is dedicated to detect iron aggregates. Iron contained in the “nano” form, additionally distributed within the tissue without physiological deposits of these elements, might not be sensitive enough to stain these extremely small deposits of iron. Possibility of overcoming the blood-brain barrier with manufactured by us nanostructures was already described [23, 24, 53]. In another study, with intraperitoneally administered superparamagnetic maghemite iron oxide NPs to mice, no accumulation of iron in experimental group was detected, nor within brain or heart tissues, which is inconsistent with our results [52]. Another study, focused on a distribution pattern of iron oxide magnetic NPs within living organism, indicated similar circulation mechanism of nanostructures as in our study—increased level of Fe within the brain and heart after administration of NPs [51]. Increased level of iron in heart tissue may be caused by presence of ZnO:Fe NPs in the general blood stream and consequently its higher level within the tissue. Likewise, higher level of iron within a skeletal muscle detected in AAS analyses is probably related with intensive blood circulation within this muscle and in case of small intestine, the improved content of iron is caused by residues of orally administered NPs.

Выводы

In conclusion, we performed the preliminary study on the distribution of biodegradable ZnO:Fe NPs as a perspective, new supplementation strategy in iron deficiency. Deposition of iron in the body of mice following oral administration of the nanostructures was detected within the crucial tissues, where the major storage site of the element takes place. We assumed that obtained in the study results might indicate the biodegradable ZnO:Fe NPs as a good carriers of exogenous iron in the living body. However, further research is needed to completely understand the exact mechanisms of the deposition, elimination, and influence of ZnO:Fe NPs on the body.

Доступность данных и материалов

The conclusions of the following study are based on the data presented in this manuscript.

Сокращения

NPs:

Наночастицы

ZnO:Fe NPs:

Zinc oxide nanoparticles doped with iron

IG:

Intra-gastric

ROS:

Reactive oxygen species

SEM:

Сканирующая электронная микроскопия

PL:

Photoluminescence spectroscopy

CL:

Cathodoluminescence spectroscopy

DLS:

Динамическое рассеяние света

Caco-2 cells:

Caucasian colon adenocarcinoma cells

DMEM:

Dulbecco’s modification of Eagle’s medium

FBS:

Фетальная бычья сыворотка

NEAA:

Non-essential amino acids

PSN:

Penicillin–streptomycin–neomycin

EDTA:

Этилендиаминтетрауксусная кислота

AAS:

Atomic absorption spectrometry

SEM (in statistical analysis):

Standard error of the mean