Оксид графена в композите с наночастицами серебра снижает цитотоксичность фибробластов и эндотелиальных клеток антибактериальной наноплатформы

Введение

Материалы с антибактериальными поверхностями широко используются в медицине и биомедицине [1]. Наноматериалы считаются эффективными альтернативными противомикробными агентами, которые можно использовать вместо антибиотиков и химических агентов [2]. Наночастицы серебра (AgNP) чаще всего используются из-за их антибактериальных свойств [3]. Однако наночастицы, которые проявляют антимикробную активность, включая AgNP, особенно в более высоких концентрациях, могут быть токсичными для клеток человека и, возможно, влиять на здоровье человека [4, 5]. Поэтому в биомедицинской промышленности применение материалов с поверхностями, покрытыми наноматериалами, вызывает вопросы об их безопасности и токсичности.

Один из возможных способов минимизировать потенциальную токсичность наноматериалов - ограничить их подвижность без изменения их антимикробных свойств. Прочно прикрепленные наноматериалы, используемые в антибактериальных поверхностях, которые не отделяются от материала, снижают их токсичность для клеток человека [6]. Одним из эффективных методов покрытия поверхностей наночастицами является ультразвуковая технология [7]. Ультразвуковые волны приводят к структурным изменениям наноматериалов, что приводит к деагломерации или агломерации, в зависимости от наноматериала [8]. Ультразвуковая технология также может быть использована для синтеза нанокомпозитов из различных материалов, включая ионы металлов и наночастицы [9,10,11]. Обработка ультразвуком использовалась для сборки различных наноматериалов, включая украшение чешуек оксида графена (GO) AgNP и другими наночастицами [12].

Механизм антибактериальной активности наночастиц варьируется между различными типами наночастиц; однако основные процессы, ответственные за антимикробные свойства наночастиц, следующие:прямое взаимодействие с компонентами клетки и косвенные процессы, включая окисление компонентов клетки и нарушение оксидоредуктивных процессов [3]. Антибактериальная активность AgNP возникает в результате прямого разрушения мембраны бактериальной клетки AgNP и высвобождаемых ионов Ag +, вызывая синтез активных форм кислорода (ROS) и коллапса потенциала плазматической мембраны, что приводит к истощению внутриклеточного АТФ [13 , 14,15]. ГО может быть цитотоксичным для бактериальных клеток за счет синтеза АФК и прямой иммобилизации клеток на поверхности ГО [16, 17], вызванной высокой адсорбционной способностью ГО и нанокомпозитов ГО [18, 19].

Однако токсичность наночастиц наблюдалась не только в бактериальных клетках. Как правило, клетки человека менее уязвимы для наночастиц, чем бактерии, из-за их большего размера, а также их эффективных механизмов восстановления и защиты, но наблюдалась цитотоксичность, особенно при высоких концентрациях. Токсичность AgNP в исследованиях in vitro проявляется в концентрациях аналогичного порядка величины, хотя они могут существенно различаться для более сложных биологических систем или организмов [20]. Токсичность AgNP для многоклеточных организмов часто ниже из-за их структурных и физиологических различий, таких как специализированные клеточные ткани, включая эпителиальные клетки [21]. Биосовместимость ГО для клеток человека зависит от концентрации и морфологии листа. В более высоких концентрациях ГО может привести к проникновению через плазматическую мембрану и усилению синтеза АФК [22,23,24].

В наших предыдущих исследованиях мы показали, что наноплатформы, состоящие из нанокомпозита AgNP и GO (Ag-GO), обладают высокой антимикробной эффективностью по отношению к бактериям ( Escherichia coli , золотистый стафилококк и эпидермальный стафилококк ) и патогенные дрожжи ( Candida albicans ), что было связано с усилением синтеза АФК и перфорацией плазматической мембраны [25]. Ag-GO показал более высокую антибактериальную активность, чем наноплатформы AgNP или GO, из-за совместной активности обоих наноматериалов. Здесь мы предположили, что полиуретановая фольга, покрытая нанокомпозитом Ag-GO, будет иметь более низкую токсичность по отношению к фибробластам, эндотелиальным клеткам пупочной вены человека (HUVEC) и альтернативной модели in vivo - хориоаллантоисной мембране куриного эмбриона - по сравнению с фольгой, покрытой только AgNP.

Результаты

AgNP и GO сформировали нанокомпозит в гидроколлоиде

Анализ на просвечивающем электронном микроскопе (ПЭМ) был использован для оценки морфологии наноматериалов и их взаимодействия в композите Ag-GO (рис. 1). AgNP представляют собой сферические наночастицы, средний размер которых составляет примерно 55 нм. Кроме того, изображения ПЭМ показали адгезию наночастиц серебра к GO (рис. 1e). Эти наблюдения получили дальнейшее подтверждение в анализе дзета-потенциала. Дзета-потенциал Ag-GO показал, что гидроколлоид был нестабильным сразу после обработки ультразвуком, но стабилизировался через 24 часа (дзета-потенциал:- 15,68 и - 27,7 мВ, соответственно; Таблица 1). Напротив, гидроколлоид AgNP был нестабильным как сразу после обработки ультразвуком, так и через 24 часа, тогда как гидроколлоид GO был довольно стабильным и не претерпел значительных изменений через 24 часа (дзета-потенциал:-31,11 мВ и -28,42 мВ, соответственно). Кроме того, анализ динамического рассеяния света (DLS) показал, что Z - средний размер AgNP составлял 93,1 нм, GO - 1485,0 нм и Ag-GO - 1157,0 нм. Распределение AgNP по размерам показало три пика, связанных с образованием агломератов, тогда как распределение GO и Ag-GO по размерам показало один пик (рис. 1b, d, f).

Морфология и распределение наночастиц по размерам. Изображения a , полученные с помощью просвечивающей электронной микроскопии наночастицы серебра, c оксид графена и е наночастицы серебра и композит оксида графена. Распределение размеров b наночастицы серебра, d оксид графена и f наночастицы серебра и композит оксида графена

Рамановские спектры и инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (FT-IR) были использованы для характеристики структурных особенностей GO (рис. 2). На рис. 2а показана деконволюция D, G и D ’GO. Положение полосы D составляет 1347 см ^{- 1} и полоса G 1578 см ^{- 1} ; соотношение ID / IG составляет 1,34. Анализ FT-IR выявил широкий пик, наблюдаемый при ~ 3500 см ^{- 1} , который относится в основном к воде и гидроксильным группам. Пик около 1600 см ^{- 1} относится к связям C =C, присутствующим в графитовом углероде. Другие пики, наблюдаемые в спектре FT-IR, показывают, что GO богат группами, содержащими связи C =O (в основном карбоксильные группы), пики около 1720 см ^{- 1} и 915 см ^{- 1} , эпоксидная смола (C – O – C) с видимым пиком около 1200 см ^{- 1} , и связи C – H (пик около 2800 см ^{- 1} ).

Анализ структурных особенностей оксида графена. а Рамановский спектр оксида графена с предполагаемой деконволюцией D, G и D ’. б Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (НПВО, ослабленное полное отражение) спектра оксида графена с отнесением функциональных групп

Фольга, покрытая AgNP-, GO- и Ag-GO, с уменьшенным содержанием Salmonella enteritidis Рост

Антибактериальная активность наноплатформ GO, AgNP и Ag-GO была протестирована с S. энтеритидис . Инкубация бактерий на фольгах, покрытых наноматериалами, при 37 ° C в течение 24 ч приводила к снижению их роста (рис. 3). Сильнейший С. энтеритидис ингибирование роста наблюдалось на наноплатформе Ag-GO. Однако наноплатформы AgNP и GO также привели к снижению S. энтеритидис рост. Сравнение изображений бактерий, инкубированных на наноплатформе Ag-GO, с контрольной группой, полученных с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ), показало снижение количества S. энтеритидис клетки. Кроме того, бактерии прикрепились к наноплатформам и показали морфологические изменения, указывающие на разрушение их клеточной мембраны.

Наноплатформы, покрытые наночастицами серебра и оксидом графена, снижают жизнеспособность S. Enteritidis. Изображения а , полученные с помощью сканирующего электронного микроскопа control S. энтеритидис бактерии и b С. энтеритидис инкубировали на наноплатформе, покрытой наночастицами серебра и оксида графена, после инкубации при 37 ° C в течение 24 часов. c Жизнеспособность S. энтеритидис после инкубации на наноплатформе в течение 24 ч оценивали с помощью анализа PrestoBlue. Значения выражены как среднее ± стандартное отклонение ( n =3, каждый эксперимент в трех экземплярах). Статистическая значимость обозначается разными надстрочными индексами (односторонний дисперсионный анализ; P <0,05). Сокращения:С - контрольная группа (фольга без наночастиц); AgNPs - наноплатформа, покрытая наночастицами серебра; GO - наноплатформа, покрытая оксидом графена; Ag-GO, наноплатформа, покрытая композитом оксида графена и наночастиц серебра; RU, относительные единицы

GO ингибирует токсичность AgNP на наноплатформе с композитным покрытием Ag-GO

Токсичность наноплатформ исследовали путем прямой инкубации фибробластов и HUVEC в течение 24 ч на наноплатформах и фольге без покрытия (рис. 4). Существовали значительные различия между жизнеспособностью фибробластов и HUVEC на разных наноплатформах ( P =0,0003 и P =0,0156 соответственно). Наноплатформы GO не изменяли жизнеспособность фибробластов по сравнению с жизнеспособностью клеток, инкубированных на непокрытой фольге. Точно так же не было значительного влияния GO на жизнеспособность HUVEC. Однако покрытие AgNPs привело к снижению жизнеспособности фибробластов и HUVEC на 40–50%. Жизнеспособность клеток фибробластов и HUVEC не изменилась при их инкубации на наноплатформах, покрытых нанокомпозитом Ag-GO, что свидетельствует об ингибировании токсичности AgNP. Морфология клеток на непокрытой фольге показала типичную морфологию фибробластов, выращенных в условиях 2D культивирования (рис. 4а). Клетки, инкубированные на фольге, покрытой AgNP, показали интенсивную агрегацию клеток. Морфология клеток на наноплатформах, покрытых GO и Ag-GO, показала снижение склонности к агломерации и разрастания клеток.

Наноплатформы, покрытые оксидом графена, снижают цитотоксичность наночастиц серебра . Морфология фибробластов, культивируемых на a наноплатформы без покрытия, b наноплатформы, покрытые наночастицами серебра, c наноплатформы с покрытием из оксида графена, d наночастицы серебра и наноплатформы с композитным покрытием из оксида графена. Морфологию оценивали с помощью световой микроскопии с использованием фазового контраста с увеличением × 200. Фибробласт ( е ) и HUVEC ( f ) жизнеспособность после 24 ч инкубации на наноплатформах определяли с помощью теста PrestoBlue. Значения выражены как среднее ± стандартное отклонение ( n =3, каждый эксперимент в трех экземплярах). Статистическая значимость обозначается разными надстрочными индексами (односторонний дисперсионный анализ; P <0,05). Сокращения:HUVEC, эндотелиальные клетки пупочной вены человека; В - контрольная группа (фольга без наночастиц); AgNPs - наноплатформа, покрытая наночастицами серебра; GO - наноплатформа, покрытая оксидом графена; Ag-GO, наноплатформа, покрытая композитом оксида графена и наночастиц серебра; RU, относительные единицы

Токсичность наноплатформ оценивали также с использованием хориоаллантоисной мембраны куриного эмбриона (рис. 5). Наноплатформы инкубировали непосредственно на хориоаллантоисной мембране, и через 48 ч исследовали ее морфологию в месте контакта. AgNPs вызвали морфологические изменения хориоаллантоисной мембраны, тогда как в случае наноплатформ GO и Ag-GO морфология была сопоставима с таковой контрольной группы (рис. 5b). Хориоаллантоисная мембрана после инкубации на наноплатформе AgNP показала уменьшение количества капиллярных сосудов, что свидетельствует о прямой токсичности для эндотелиальных и мезенхимных клеток.

Оксид графена уменьшал морфологические изменения хориоаллантоисной мембраны, вызванные наночастицами серебра. Морфология хориоаллантоисной мембраны куриного эмбриона после 48 ч инкубации с наноплатформами. а Контрольная группа (фольга без наночастиц), б наноплатформа, покрытая наночастицами серебра, c наноплатформа, покрытая оксидом графена, d наноплатформа, покрытая композитом из оксида графена и наночастиц серебра

AgNP снижают высвобождение интерлейкинов 6 и 8

Набор антител использовали для анализа содержания 40 воспалительных белков в клеточной среде, синтезированных фибробластами (рис. 6). Основными воспалительными белками, выделяемыми фибробластами, были интерлейкин 8 (IL-8; фиг. 6, точки:E5, F5) и интерлейкин 6 (IL-6; фиг. 6, точки:E8, F8). Наноплатформы AgNP и Ag-GO значительно снижали уровень высвобождения IL-8, тогда как наноплатформа GO не имела такого эффекта. Кроме того, наноплатформы как GO, так и Ag-GO снижали уровень высвобождения колониестимулирующего фактора гранулоцитов-макрофагов (GM-CSF; рис. 6, точки:G5, H5). Наноплатформы GO и Ag-GO также привели к повышенному уровню высвобождения бета-фактора некроза опухоли (TNF-β; рис. 6, точки:A9, B9). Интересно, что наноплатформы AgNP, GO и Ag-GO значительно снижали уровень высвобождения IL-6. Уровень высвобождения остальных проанализированных белков не изменился. Карта массива со списком всех проанализированных цитокинов включена в Дополнительный файл 1:Рисунок S1.

Массив антител для выделения воспалительных цитокинов фибробластами через 24 часа инкубации. а Контрольная группа (фольга без наночастиц), б наноплатформа, покрытая наночастицами серебра, c наноплатформа, покрытая оксидом графена, d Наноплатформа Ag-GO, покрытая композитом оксида графена и наночастиц серебра. Наноплатформы AgNP и Ag-GO снижали уровень высвобождения IL-8 (точки:E5, F5). Наноплатформы как GO, так и Ag-GO снижали синтез GM-CSF (точки:G5, H5). Кроме того, наноплатформы GO и Ag-GO привели к усиленному синтезу TNF-β (точки:A9, B9). Наноплатформы AgNP, GO и Ag-GO снижали уровень высвобождения IL-6 (точки:E8, F8). Полная карта массива доступна в дополнительном файле 1

Обсуждение

В биомедицинских приложениях безопасность наноматериалов, используемых в антимикробных материалах, так же важна, как и их эффективность в уничтожении бактерий. В этом исследовании мы показали, что материалы покрытия с GO могут эффективно снизить токсичность наноматериалов. Полиуретановая фольга, покрытая AgNPs и GO (Ag-GO), не только повысила их антимикробные свойства, но и снизила их токсичность для клеток человека.

Рамановская спектроскопия использовалась для анализа структурных особенностей оксида графена. Полоса G в спектрах комбинационного рассеяния соответствует sp ² гибридизированный углеродный материал [26]. Пик D связан с дефектом или беспорядком решетки из-за связывания кислородной функциональной группы [27]. Интенсивность полосы D связана с размером sp ² плоские области [26]. Дополнительные полосы D ’возникают из-за дефектов, присутствующих в графитовой структуре углеродного материала. Отношение ID / IG (рассчитанное по интенсивности полос D и G) может быть использовано для характеристики беспорядка графитовой структуры в углеродных материалах. Как было продемонстрировано, GO имеет сильно разупорядоченную структуру из-за множества функциональных групп в структуре, образованных в процессе окисления графитового порошка [28].

ИК-Фурье-спектр оксида графена, собранный в режиме НПВО, показал, что GO имеет много функциональных групп, присутствующих в структуре, включая карбоксильные и эпоксидные группы, пики около 1720 см ^{- 1} и 915 см ^{- 1} , эпоксидная смола (C – O – C) с видимым пиком около 1200 см ^{- 1} , и связи C – H (пик около 2800 см ^{- 1} ). Анализ FT-IR хорошо согласуется с измерениями XPS, выполненными для GO, где также были идентифицированы гидроксильные, карбоксильные, эпоксидные и карбонильные группы [29].

Покрытие наноматериалов производилось с помощью ультразвуковых технологий, которые подтвердили свою эффективность в покрытии различных материалов антибактериальными и фунгицидными веществами, в том числе AgNP [30, 31]. Ультразвуковые волны используют явление кавитации, генерируя и схлопывая кавитационные пузыри, создавая высокую энергию и давление [32]. Наноматериалы, разогнанные до высоких скоростей, сталкиваются с материалом с покрытием и осаждаются на поверхности [33]. Однако эффективность осаждения наноматериалов можно повысить не только за счет использования надлежащего метода нанесения покрытия, но также за счет создания композитов с наноматериалами, которые легче прикрепить к поверхности. GO является подходящим наноматериалом для создания стабильных композитов с различными наноматериалами и поверхностями. Благодаря своей уникальной структуре, с атомами углерода в гексагональной структуре с многочисленными кислородсодержащими функциональными группами в непосредственной близости, включая карбоксильные и гидроксильные группы, GO склонен к образованию ковалентных связей или электростатических взаимодействий [34]. Обычно композиты GO-наночастицы синтезируются путем прикрепления ионов металлов или металлических наночастиц к поверхности GO посредством электростатических или ковалентных взаимодействий. Кроме того, восстановление ионов металлов и / или GO осуществляется с образованием ковалентных связей [35]. Композиты Ag-GO были изготовлены с использованием ультразвуковой обработки путем восстановления Ag на месте ⁺ [36, 37], а также нанесением AgНЧ [12]. В нашем предыдущем отчете мы показали, что ультразвуковые методы могут быть использованы для синтеза наноплатформ с покрытием Ag-GO на полиуретановой фольге [25]. Однако обработка ультразвуком привела не только к покрытию полиуретановой фольги наноматериалами, но и к образованию композита Ag-GO. Формирование композита Ag-GO даже до покрытия фольги могло привести к большей стабильности AgNP после нанесения покрытия.

В наших исследованиях фибробласты и HUVEC были использованы для исследований цитотоксичности с последующим анализом хориоаллантоисной мембраны куриного эмбриона. Фибробласты кожи считаются хорошей моделью для исследований раздражения кожи по сравнению с анализом in vivo [38], тогда как эндотелиальные клетки, включая цитотоксичность HUVEC, часто изучаются из-за вероятного прямого контакта наночастиц в биомедицинских приложениях и чувствительности этих клеток к наночастицам [38]. 39, 40]. Хориоаллантоисная мембрана куриного эмбриона является альтернативой моделям in vivo на грызунах для различных токсикологических исследований, включая токсикологию материалов и исследования острой токсикологии [41, 42].

Фибробласты и HUVEC имели более высокую жизнеспособность при выращивании на Ag-GO, чем наноплатформы, покрытые AgNP. Кроме того, наноплатформа AgNP вызвала морфологические изменения хориоаллантоисной мембраны, тогда как в случае наноплатформ GO и Ag-GO морфология клеток была сопоставима с контрольной группой. Снижение токсичности на наноплатформе Ag-GO может быть результатом комбинированных эффектов более высокой стабильности AgNPs в комплексе с GO и лучшего отложения AgNPs на наноплатформе. Токсичность клеток животных часто бывает более серьезной после того, как наночастицы попали в клетку путем прямого проникновения или эндоцитоза [43]. Эндоцитоз наночастиц зависит от размера и формы. Более крупные частицы и композиты поглощаются в меньшей степени, чем частицы размером примерно 45 нм [44]. Наиболее заметная связь между эндоцитозом и формой или размером наноматериалов характерна для нанотрубок с углеродными стенками. Нанотрубки длиной менее 1 мкм эффективно проникают через плазматическую мембрану посредством прямой диффузии, тогда как пути фагоцитоза или эндоцитоза интернализируют более длинные нанотрубки и агломераты [45]. Недавно было показано, что нанокомпозит Ag-GO интернализируется макрофагами J774, что примерно на 60% меньше, чем AgNP. Однако, поскольку Ag-GO индуцировал больше АФК, общая токсичность для клеток была выше [46]. Кроме того, кинетический анализ интернализации наночастиц в зависимости от формы показывает, что наночастицы сферического размера обычно интернализуются намного быстрее, чем плоские частицы [47]. Кроме того, токсичность наночастиц для клеток человека обычно зависит от размера, при этом более мелкие частицы проявляют более сильные цитотоксические свойства. В исследованиях зависимой от размера цитотоксичности AgNP для RAW, 264,7 макрофагов и наночастиц фибробластов L929 имели более низкую жизнеспособность после обработки 20-нм AgNP, чем после обработки более крупными наночастицами (80, 113 нм) [13]. Следовательно, увеличенный размер композитов Ag-GO и снижение способности клеток поглощать наночастицы в результате стабильного осаждения на поверхность могут быть причиной наблюдаемой более высокой жизнеспособности как HUVEC, так и фибробластов, культивируемых на наноплатформе Ag-GO.

Наноплатформы AgNP и Ag-GO значительно снижали уровень высвобождения IL-8 фибробластами. Наноплатформы GO и Ag-GO привели к повышенному высвобождению TNF-β. Кроме того, наноплатформы AgNP, GO и Ag-GO снижали высвобождение IL-6. Интересно, что изменения в синтезе провоспалительных белков фибробластами были связаны с инкубацией клеток на наноплатформах, покрытых AgNP или GO. Уровни синтеза клеток, инкубированных на Ag-GO, не отличались от таковых, инкубированных на наноплатформах, покрытых только одним из этих наноматериалов, что позволяет предположить, что биологическая активность не изменилась после синтеза композита. Фибробласты играют важную роль в воспалительных процессах и процессах ремоделирования, инициируя воспалительные реакции и ускоряя переход от острого воспаления к восстановлению тканей [48, 49]. Следовательно, анализ секреции воспалительных цитокинов фибробластами важен для прогнозирования иммунологического ответа на наноплатформы. И ИЛ-6, и ИЛ-8 являются одними из ключевых воспалительных цитокинов, которые после синтеза фибробластами приводят к активации иммунологического ответа [50, 51]. Уровень синтеза IL-6 в эпидермальных кератиноцитах человека снижается после обработки AgNP [52]. Точно так же ингибирование высвобождения IL-6 с помощью AgNP было продемонстрировано в клетках Jurcat и включает путь MAPK. AgNP также снижают уровень синтеза фактора некроза опухоли альфа (TNF-α) [53]. TNF-α и, очень похожие по структуре и функциям, TNF-β, являются воспалительными цитокинами, которые важны во время фазы острого воспаления. Хотя иммунные клетки в основном ответственны за высвобождение этих белков во время острой фазы воспаления, фибробласты и различные клетки участвуют в синтезе воспалительных цитокинов во время раннего процесса заживления ран [54]. Активность по индукции TNF-α после обработки ГО была продемонстрирована с использованием макрофагов RAW264.7 [55], что предполагает иммунологическую стимуляцию. Однако в наших исследованиях уровни высвобождения большинства проанализированных провоспалительных белков не изменились после культивирования клеток на наноплатформах GO и Ag-GO. Таким образом, эти анализы показывают, что наноплатформы как GO, так и Ag-GO обладают хорошей биосовместимостью и не должны вызывать сильных иммунологических реакций.

Выводы

В заключение, представленные результаты показывают, что наноплатформы, покрытые композитом Ag-GO, показали более сильное ингибирование роста S. энтеритидис чем наноплатформы с покрытием AgNP и GO. Более того, композит Ag-GO значительно снижает цитотоксичность в отношении фибробластов, HUVEC и хориоаллантоисной мембраны куриного эмбриона по сравнению с наноплатформами, покрытыми AgNP. Жизнеспособность клеток фибробластов и HUVEC не изменилась при их инкубации на наноплатформах, покрытых нанокомпозитом Ag-GO, что свидетельствует об ингибировании токсичности AgNP. Эти результаты, вместе с низкой иммунологической стимуляцией, предполагают, что ГО может использоваться для снижения цитотоксичности различных наноматериалов в нанокомпозитах. Кроме того, результаты показывают, что наноплатформа Ag-GO может быть рассмотрена для использования в биомедицинских приложениях. Однако необходимы дополнительные исследования для оценки наноплатформы Ag-GO для конкретных приложений, включая перевязки ран.

Материалы и методы

Подготовка и определение характеристик наноплатформ, покрытых наноматериалами

Наноплатформы из полиуретановой фольги, покрытой наночастицами, были приготовлены, как описано ранее [25]. Квадратные полиуретановые пленки (15 × 15 мм, толщина 0,05 мм) покрывали суспензиями AgNP (HydroSilver1000, Amepox, Лодзь, Польша), синтезированных реакцией химического восстановления в присутствии поливинилового спирта, разработанного Amepox, и / или GO, синтезированного модифицированный метод Хаммерса. Десять граммов графитового порошка смешивали с 230 мл концентрированной серной кислоты (98%) (Sigma-Aldrich Co., Сент-Луис, Миссури, США) при температуре ниже 10 ° C. Затем к графитовой смеси добавляли 4,7 г нитрата натрия (Sigma-Aldrich) и 30 г перманганата калия (Sigma-Aldrich), поддерживая температуру ниже 10 ° C. Затем смесь нагревали до 30 ° C и перемешивали в течение 2 часов. Затем добавляли 100 мл воды и смесь обрабатывали 10 мл перекиси водорода. GO очищали фильтрованием и промывали деионизированной водой до тех пор, пока pH фильтрата не достигал 6,5. Суспензии ГО, AgNP и композита AgNPs и GO (Ag-GO) готовили в деионизированной воде. При нанесении покрытия концентрации наноматериалов были следующими:GO 200 мг / л; AgNPs, 100 мг / л; Ag-GO, 200 мг / л; и AgNPs - 100 мг / л. Покрытие наночастиц выполняли с использованием ультразвукового рупора (Ti-рупор, Ø13 мм, эффективность 60%, 20 кГц; Sonics &Materials, Inc., Ньютаун, Коннектикут, США) при температуре 30 ± 1 ° C. Покрытые образцы промывали деионизированной водой и сушили в стерильных условиях. Ранее сообщалось о характеристике наноплатформ с помощью сканирующего электронного микроскопа (SEM), атомно-силового микроскопа (AFM) и микроскопа боковых сил (LFM), показывающего, что наноплатформы почти полностью покрыты наноматериалами [25].

Наноматериалы, используемые для получения наноплатформ, были получены с помощью просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ). Изображения ПЭМ получали с использованием микроскопа JEM-1220 (JEOL, Токио, Япония) при 80 кВ с 11-мегапиксельной камерой Morada (Olympus Corporation, Токио, Япония). Образцы готовили, помещая капли гидроколлоидов на покрытые формваром медные сетки (Agar Scientific, Станстед, Великобритания), которым давали высохнуть на воздухе перед наблюдениями.

Спектры комбинационного рассеяния были получены с использованием спектрометра Renishaw inVia с лазерным источником с длиной волны 532 нм (Уоттон-андер-Эдж, Великобритания). Чтобы избежать нагрева образца, мощность лазера поддерживалась низкой (0,3 мВт, калибровка по образцу). Режим рамановского картирования использовался с областью сканирования приблизительно 10 × 10 мкм, содержащей 25 спектров). Каждый спектр состоит из двух основных полос, полосы G (~ 1578 см ^{- 1} ) и полоса D (~ 1347 см ^{- 1} ), была подобрана с использованием формы лоренцевой линии. FT-IR измерения проводили с использованием спектрометра Nicolet iS10 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) в режиме ослабленного полного отражения на кристалле алмаза. Суспензию оксида графена сушили на поверхности полиэтилена при комнатной температуре для создания тонкой фольги GO. Спектр получен в диапазоне 400–4000 см ^{- 1} . .

Zeta potential measurements of GO (20 mg/l), AgNPs (10 mg/l) and Ag-GO (GO 20 mg/l and AgNPs 10 mg/l) were carried out with a Nano-ZS90 Zetasizer (Malvern Instruments, Malvern, UK) at 25 °C, using the Smoluchowski approximation. Nanomaterials were sonicated for 30 min and zeta potential was immediately measured. Subsequently, nanomaterials were left for 24 h at room temperature and the zeta potential was measured again. Each measurement was repeated at least seven times after 60 s of stabilisation at 25 °C.

The hydrodynamic diameter of nanoparticles in water and their size distribution were measured with dynamic light scattering (DLS) using a Nano-ZS90 Zetasizer (Malvern). Similar to for the zeta potential analysis, GO (20 mg/l), AgNPs (10 mg/l) and Ag-GO (GO 20 mg/l and AgNPs 10 mg/l) were sonicated for 30 min and left for 24 h at room temperature. Each sample was measured at least seven times at 25 °C.

Bacterial Cultivation

Salmonella enteritidis subspecies enterica serovar Enteritidis (ATCC 13076) was obtained from LGC Standards (Łomianki, Poland). The bacteria were grown on tryptic soy agar (Merck Millipore, Darmstadt, Germany). The bacteria, grown on agar plates, were harvested by gently washing the plates with sterile distilled saline solution. To calculate the number of bacteria in the cell suspension, the optical density of the suspensions at 600 nm (OD600) was measured using a spectrophotometer (Helios Epsilon, Unicam, Milwaukee, WI, USA). A calibration curve was prepared by performing serial tenfold dilutions of bacterial suspensions of a known optical density, up to 10 ^− 5 . After 24 h of incubation at 37 °C, the number of formed colonies was enumerated and the number of colony-forming units (CFU) of the original bacterial suspension was calculated.

Bacteria Viability Assay

Viability was evaluated using a PrestoBlue Cell Viability Assay (Thermo Fisher Scientific). Bacteria were cultured onto foils coated with GO, AgNPs and Ag-GO, located on inserts inserted into six-well plates (200 μl MH broth with 5 × 10 ³  CFU per foil) and incubated for 24 h. Subsequently, 90 μl of each sample was transferred to 96-well plates and 10 μl of PrestoBlue reagent was added to each well and incubated for an additional 2 h at 37 °C. The optical density of each well was recorded at 570 nm using a microplate reader (Infinite M200, Tecan, Durham, NC, USA). Bacteria viability was expressed as the relative value after substitution of the absorbance from the blank samples. Experiments were repeated three times.

Scanning Electron Microscopy Analysis

Bacteria were incubated on foils with Ag-GO and a sterile cover glass. Bacteria cultures (100 μl, 10 ⁶ CFU/ml) were incubated on foils and a cover glass for 24 h at 37 °C. Все образцы были высушены и покрыты золотом. Cells were fixed with 2.5% glutaraldehyde in phosphate-buffered saline (PBS, pH 7.2) and contrasted with 1% osmium tetroxide (Sigma-Aldrich) and 1% carbohydrazide (Sigma-Aldrich). Subsequently, cells were dehydrated in increasing concentrations of hexylene glycol (Sigma-Aldrich). Drying was performed using a Polaron CPD 7501 critical point dryer (Quorum Technologies, Laughton, UK). Finally, the samples were imaged with a SEM (FEI Quanta 200, Tokyo, Japan) at an acceleration voltage of 15 kV.

Human Cell Lines

Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs; catalogue number:C0035C) and human fibroblasts (catalogue number:C0135C) were obtained from Thermo Fisher Scientific. HUVECs were maintained on low-serum Medium 200 basal media supplemented with Large Vessel Endothelial Supplement (Thermo Fisher Scientific) and 1% penicillin/streptomycin (Thermo Fisher Scientific), whereas fibroblasts were cultured in low-serum Medium 106 (Thermo Fisher Scientific) supplemented with Low Serum Growth Supplement (Thermo Fisher Scientific) and 1× penicillin/streptomycin (Thermo Fisher Scientific). Cells were maintained at 37 °C in a humidified atmosphere of 5% CO₂ /95% air.

To analyse biological interactions, the nanoplatforms were put into six-well plates. After detachment from the cell culture flask, HUVECs or fibroblasts were placed directly on the nanoplatform with 100 μl of growth media. To avoid the media drying during incubations, plates were kept in humidity chambers.

Analysis of Nanoplatform Toxicity to HUVECs and Fibroblasts

To analyse HUVEC and fibroblast viability on the nanoplatforms, cells were cultured in the droplet directly on the nanoplatforms or uncoated foil (1 × 10 ⁴ cells in 100 μl growth media). After 24 h of incubation, cell viability was analysed using a PrestoBlue assay (Thermo Fisher Scientific). PrestoBlue reagent was incubated with assessed cells for 2 h in a cell culture incubator. Subsequently, 50 μl of growth media with PrestoBlue reagent was transferred to a 96-well plate where fluorescence (excitation λ  = 560 nm, emission λ  = 590 nm) was analysed using a Tecan Infinite 200 microplate reader (Tecan, Durham, USA). Cell viability was expressed as the relative value after substitution of the fluorescence from blank samples. Experiments were repeated three times.

Fibroblast morphology was observed using an inverted optical microscope (Olympus Corporation) using phase contrast. Fibroblasts were seeded in 35-mm diameter Petri dishes directly on the nanoplatforms (1 × 10 ⁴ cells in 100 μl growth media). Images were taken after 24 h of incubation.

Chorioallantoic Membrane Assay

Fertilised eggs from Ross 308 hens were obtained from a certified hatchery and kept for 4 days at 12 °C. The eggs were cleaned, sterilised with UVC light and divided into four groups (4 × 20 eggs). Embryos were incubated at standard conditions (temperature 37 °C, humidity 60% and turned once per hour). At 8 days of embryonic development, small holes (1 cm ² ) were made in the shell above the air space, the inner membrane was gently striped off and the nanoplatforms were placed on the chicken embryo chorioallantoic membrane. Subsequently, chicken embryos were incubated for the next 48 h, when nanoplatforms were cut out with the chorioallantoic membrane that was directly below the nanoplatform. The chorioallantoic membrane on the nanoplatforms was imaged using a stereoscopic microscope (SZX10, Olympus Corporation).

Antibody Array Analysis

An analysis of inflammation cytokines in fibroblast growth medium was performed using an antibody array (Abcam, Cambridge, UK; catalogue number ab134003). Fibroblast cells (1 × 10 ⁴ ) were incubated on nanoplatforms coated with AgNPs, GO, Ag-GO and uncoated foil with 100 μl of media. After 24 h, 80 μl of growth medium was collected. For each experimental group, the growth medium from six foils was used for analysis. Pooled growth medium from the six experiments was centrifuged (1600 rpm for 5 min), and 500 μl of growth media was diluted in 500 μl of PBS. Therefore, 1 ml of diluted growth media was used per each analysed membrane. The assay was performed in accordance with the manufacturer’s instructions. Diluted growth media was incubated with the membranes for 24 h at 4 °C. Subsequently, antibodies conjugated with biotins were added and incubated for the next 24 h at 4 °C. In the next step, the membranes were incubated with streptavidin conjugated with horseradish peroxidase for 2 h at room temperature. Membranes were visualised after the addition of the provided horseradish peroxidase substrate using a ChemiDoc imaging system (Bio-Rad, Hercules, USA).

Statistical Analysis

Data were analysed using one-way analysis of variance with GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Differences between groups were tested with Tukey’s HSD post hoc tests. Results are shown as means with standard deviations. Differences at P  < 0.05 were considered significant.

Доступность данных и материалов

The datasets used and/or analysed during the current study are available from the corresponding author on reasonable request.

Сокращения

Ag-GO:

Composite of silver nanoparticles and graphene oxide

AgNPs:

Silver nanoparticles

CFU:

Colony-forming units

DLS:

Динамическое рассеяние света

FT-IR:

Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье

GM-CSF:

Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor

GO:

Оксид графена

HUVECs:

Human umbilical vein endothelial cells

IL-6:

Interleukin 6

IL-8:

Interleukin 8

SEM:

Сканирующий электронный микроскоп

ТЕМ:

Просвечивающий электронный микроскоп

TNF-α:

Tumour necrosis factor alpha

TNF-β:

Tumour necrosis factor beta